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方法文章

小鼠噪声性听力损失的改良实验条件及听力功能与外毛细胞损伤评估

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DOI：

10.3791/64286

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2023年2月10日

 ,  , 
1Department of Audiology and Speech-Language Pathology, MacKay Medical College, 2Institute of Biomedical Sciences, MacKay Medical College

本文内容

摘要

本文介绍了一种噪声性听力损失（NIHL）小鼠模型的实验方案。为诱导NIHL，我们设计了一种新型且简便的装置，该装置由波纹塑料、大鼠捕鼠笼和扬声器组成。采用听觉脑干反应和免疫荧光成像分别评估听力功能和外毛细胞损伤情况。

摘要

噪声性听力损失（NIHL）的动物模型对于病理学家、治疗师、药理学家以及听力研究人员深入理解NIHL的发病机制，并进一步优化相应的治疗策略具有重要意义。本研究旨在建立一种改进的小鼠NIHL模型构建方案。实验采用雄性C57BL/6J小鼠，在未麻醉状态下连续5天、每天6小时暴露于高强度噪声（1 kHz和6 kHz纯音同时呈现，声压级为115–125 dB SPL-A）。在噪声暴露后1天和1周，通过听觉脑干反应（ABR）评估小鼠的听觉功能。ABR检测完成后，处死小鼠并取其耳蜗柯蒂氏器进行免疫荧光染色。ABR检测结果显示，噪声暴露1天后小鼠出现显著的听力损失。暴露1周后，实验组小鼠的听阈下降至约80 dB SPL，仍显著高于对照组小鼠（约40 dB SPL）。免疫荧光成像结果表明，外毛细胞（OHCs）出现损伤。综上所述，我们成功利用雄性C57BL/6J小鼠建立了NIHL模型，并研制并应用了一种新型且简单的纯音噪声发生与传递装置。通过听阈的定量测定以及外毛细胞损伤的形态学验证，均表明所施加的噪声成功诱导了预期的听力损失。

引言

全球约有13亿人因噪声暴露而遭受听力损失1。本研究旨在建立一套清晰、逐步的操作流程，用于诱导并确认噪声性听力损失（NIHL）。NIHL 是由于毛细胞（HCs）和螺旋神经节神经元（SGNs）的退化或破坏、毛细胞静纤毛的损伤，和/或耳蜗内毛细胞与螺旋神经节神经元之间突触的丧失所导致。此类异常除了引起噪声性听力损失外，还可能导致耳鸣以及言语感知能力下降（尤其是在复杂的声学环境中）。这些生理缺陷可能相继影响个体的社会功能、心理状态和认知功能2,3,4,5,6。

在基于小鼠的噪声性听力损失（NIHL）相关临床前研究中，最常用的小鼠品系为 CBA/CaJ2,3,6,7 和 C57BL/64,5,8。此外，雄性3,4,7 小鼠的使用频率高于雌性小鼠，因为雌激素对听力具有保护作用。因此，本研究中仅使用雄性小鼠9。在参考相关文献后，我们选择 1 kHz 和 6 kHz 作为施加噪声的频率。施加噪声的强度为 115 dB SPL-A（笼子周围）至 125 dB SPL-A（笼子中心）。将实验小鼠连续 5 天、每天持续暴露于噪声中 6 小时后，听阈出现理想程度的升高，表明实验小鼠已成功建立理想程度的噪声性听力损失（NIHL）模型。有关动物操作、实验装置搭建以及噪声暴露的全部步骤，均在所提供的实验方案中进行了清晰的逐步描述。

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方案

本研究的动物实验已获得马偕医学院动物照护委员会的批准。八周龄雄性 C57BL/6J 小鼠购自国家实验动物中心（中国台湾新北市）。所有小鼠的繁殖和饲养均依照标准动物实验规范进行。

1. 小鼠噪声性听力损失的诱导

  1. 准备实验小鼠的笼子
    1. 使用尺寸为 14 cm × 17 cm × 24 cm 的大鼠捕鼠笼。将四块瓦楞塑料板裁剪成合适大小，使其能够放入笼内（尺寸分别为 13 cm × 23 cm 和 13 cm × 16 cm）。
    2. 为防止小鼠脚部被网格划伤，将其中两块塑料板分别置于笼底和后侧。另将剩余两块塑料板相互垂直交错放置，将笼内空间均分为四个区域。
  2. 在隔音箱中进行本实验。将扬声器置于笼子前方 8.5 cm 处，并将扬声器与笼子一同放入隔音箱内。
  3. 打开 CLIO 应用软件
  4. 将光标移至扬声器图标，然后点击 TwoSin。将 Freq 1 的值设为 1000 Hz，Freq 2 的值设为 6000 Hz，然后点击 OK 开始播放声音。
  5. 在 Leq 选项卡下，将 dBV 更改为 dBSPL。在软件界面上设置好时间后，点击绿色三角形按钮开始播放声音。
  6. 在扬声器正前方 8.5 cm 处放置一个麦克风，用于校准噪声水平（参见 补充文件 1）。将噪声水平调节至 125 dB SPL-A，并持续监测不少于 3 分钟，以确保噪声水平足够稳定。使用信号发生器、分析仪和放大器来生成并控制噪声。（图 1）
    注意：此步骤应在隔音箱内进行，以避免对操作人员听力造成损伤。
  7. 将四只雄性 C57BL/6J 小鼠放入笼内（每区一只），进行噪声暴露。在噪声暴露期间，随机分配各区域中的小鼠。将一个麦克风放置于笼子顶部，用于在噪声暴露过程中监测噪声水平（图 2）。
    注意：此步骤应在隔音箱内进行，以避免对操作人员听力造成损伤。
  8. 使小鼠连续 5 天每天暴露于 1 kHz 和 6 kHz 频率的噪声中，每次持续 6 小时。
  9. 在噪声暴露后第 1 天（即第 6天）通过测量听觉脑干反应（ABR）来评估小鼠的听阈。在噪声暴露后第 1 周（即第 13天）再次重复 ABR 测量。完成 ABR 测量后，处死所有参与实验的小鼠并取出其耳蜗组织（图 3）。

2. 基于听觉脑干反应（ABR）的听力阈值评估

  1. 使用专为小型动物设计的商用 ABR 检测系统10。
  2. 通过腹腔注射给予小鼠替来他明与唑拉西泮混合物（40 mg/kg）和赛拉嗪（9.3 mg/kg），以实现全身麻醉。
    注意：ABR 评估过程约需 2 小时。务必通过加热垫提供保温支持，并涂抹眼膏以防止小鼠在麻醉期间眼睛干涩。
  3. 在全身麻醉状态下测量小鼠的 ABR。将皮下针电极（12 mm）置于头顶、左耳耳廓后方以及尾部附近的背部，用于测量听觉阈值。
  4. 使用放置在动物左耳 1 cm 处的扬声器呈现声学刺激。
  5. 使用示波器控制声学刺激。选择正弦波作为刺激信号，将窗口刻度设为10 k。调节频率旋钮，以获得所需声学刺激频率。
  6. 通过调节函数发生器上的AMLP旋钮来调整刺激强度。根据校准结果计算出合适的电压值，将AMLP旋钮调节至该电压，从而获得所需的刺激强度。
  7. 在一系列刺激强度下（从 10 dB SPL 到 100 dB SPL，步长为 10 dB）采集 ABR 测量数据。
    注意：在隔声室内进行听觉阈值测量。将采集信号中可辨识出明显 V 波的最低刺激强度定义为 ABR 阈值10,11（图 4）。完成 ABR 检测后，持续监测动物直至其从麻醉中恢复（约 1 小时）。

3. 显微镜检查

  1. 固定收获的组织
    1. 完成ABR测量后，通过腹腔注射替来他明和唑拉西泮混合物（100 mg/kg）以及赛拉嗪（23.25 mg/kg）处死小鼠，以进行显微镜检查。
    2. 从小鼠中取出耳蜗，并立即将其浸入10%甲醛（FA）中固定（每毫升含两个耳蜗），在4 °C下固定至少8小时。
    3. 固定完成后，在4 °C条件下用10%乙二胺四乙酸（EDTA）溶液替换FA溶液，脱钙处理3-4天。随后用镊子逐一检查每个耳蜗，确认耳蜗已充分软化。
    4. 将耳蜗置于盛有磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中，将螺旋状的柯蒂氏器（OC）（每个脱钙耳蜗）切成三段：基底回、中回和顶端回，用于组织染色。
    5. 在解剖显微镜下（放大倍数：8x–35x），去除脱钙耳蜗的骨性结构（前庭阶、鼓阶和蜗轴），获取包括柯蒂氏器在内的软组织（厚度约40 µm）。
  2. 耳蜗免疫荧光染色
    1. 封闭液的配制：在PBS中配制含2%牛血清白蛋白（BSA）和0.2% Triton X-100的溶液。
    2. 将待染色的组织从培养皿转移至微量离心管中，加入0.1 mL封闭液，在室温（RT）下孵育2小时。
    3. Myo7A一抗溶液的配制：用封闭液按1:200的体积比稀释Myo7A一抗。
    4. 在微量离心管中加入100 µL Myo7A一抗溶液处理组织，在室温下孵育2小时。
    5. 用PBS清洗组织三次，每次5分钟。
    6. Myo7A二抗（Myo7A-Rb-488）和鬼笔环肽抗体（phalloidin-594）溶液的配制：用封闭液分别按1:400稀释Myo7A二抗，按1:200稀释鬼笔环肽抗体。
    7. 加入100 µL Myo7A二抗与鬼笔环肽抗体混合溶液处理组织，在室温下孵育2小时。
    8. 抗体与鬼笔环肽抗体处理后，用PBS清洗组织三次，每次5分钟。
    9. 使用剪去尖端的1 mL塑料移液枪头，将清洗后的组织从微量离心管转移至盛有PBS的培养皿中。
    10. 为进行显微镜观察，将组织展开后放置于载玻片上，滴加15 µL 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）封片荧光介质，完全覆盖组织。轻轻盖上盖玻片，于室温下静置过夜，再用指甲油封片。
  3. 图像采集
    1. 使用正置荧光显微镜及图像采集软件获取二维图像。
    2. 进行显微观察前，将组织置于视野中央，并将感光度调整为ISO 100。首先点击软件中的自动模式按钮初步设定曝光时间，然后点击调整按钮手动微调，以优化信噪比。
    3. 通过旋转荧光滤块调节入射光波长，以激发不同荧光染料。采用伪彩色标记不同荧光标签的发射光（蓝光：DAPI；绿光：Myo7A；红光：鬼笔环肽）。
    4. 扫描组织样本，生成并采集图像数据，保存为.tif和.jpg格式的图像文件。

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结果

听觉脑干反应（ABR）听力阈值的变化
小鼠在噪声暴露后1天或1周时，采用短音听性脑干反应（tone-burst ABR）检测其听觉阈值。噪声暴露后1天，在所测试的三个频率下均观察到听觉阈值显著升高（12 kHz：84.29 ± 2.77 dB SPL；24 kHz：91.43 ± 0.92 dB SPL；32 kHz：98.57 ± 1.43 dB SPL）（即第6组）th 天）。噪声暴露后1周出现部分听力恢复（即第13th 天），但与对照组相比，所有频率的听阈仍升高超过30 dB（12 kHz：72.86 ± 2.86 dB SPL；24 kHz：84.29 ± 2.77 dB SPL；32 kHz：87.14 ± 4.21 dB SPL）（对照组：12 kHz：41 ± 0 dB SPL；24 kHz：51 ± 0 dB SPL；32 kHz：51 ± 0 dB SPL）。本研究中，高频听力损伤更为严重（图5采用双因素方差分析（two-way ANOVA）进行统计分析，组间比较采用Bonf...

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讨论

噪声性听力损失可分为两种类型：暂时性噪声性听力损失，表现为听阈的一过性偏移；以及永久性噪声性听力损失，其特征是听阈发生永久性偏移。我们在第6天观察到的听力损失th 天（噪声暴露后1天）被认为由这两种类型共同构成。在此情况下，由于听力损失的时间相关成分，听力阈值会随时间推移逐渐恢复。在我们前期的实验研究中，采用相同实验装置和动物所获得的结果显示，由2天噪声暴露引起的听力损失在2周内完全恢复，表明并未产生永久性噪声性听力损失（NIHL）。相反，本研究中由5天噪声暴露引起的听力损失被认为包含永久性成分，因为在第13天时，其听力阈值仍显著高于对照组水平th 天（噪声暴露后1周）。

当前方案的一个局限性在于，我们使用在12 kHz处检测到的听力阈值来代表小鼠的低频听力阈值，该频率对应于耳蜗的顶端回。严格来说，耳蜗顶端回对4 kHz至8 kHz的声刺激更为敏感12。然而，这一局限性几乎不会降低本研究及该方案的价值，因为所提供的方案详细描述了所有操作步骤，并列出了建模过程中所涉及的设备。文中提供的大多数参...

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致谢

感谢中国台湾科技事务主管部门（MOST）的资助（MOST 110-2314-B-715-005，MOST 111-2314-B-715-009-MY3），以及马偕医学院院内研究经费的支持（MMC-RD-110-1B-P030，MMC-RD-111-CF-G002-03）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
 1/4" CCP 自由场标准麦克风套装GRAS428158用于噪声暴露
放大器输入模块 AMI100DBIOPAC用于听觉脑干反应
生物放大器 BIO100CBIOPAC用于听觉脑干反应
牛血清白蛋白SIGMAA9647免疫荧光染色
Cellsens 软件Olympus life science图像采集
波纹塑料
DAPI 荧光封片剂SouthernBiotech0100-20免疫荧光染色
乙二胺四乙酸SIGMAE5134脱钙
诱发电位放大器 ERS100CBIOPAC用于听觉脑干反应
甲醛APLHAF030410耳蜗固定
高性能数据采集系统 MP160BIOPAC用于听觉脑干反应
模块化扩展电缆 MEC110CBIOPAC用于听觉脑干反应
Myo7A 一抗Proteus25-6790免疫荧光染色
Myo7A 二抗Jackson immunoresearch711-545-152免疫荧光染色
针状电极，单极 12 mmTp，EL452BIOPAC用于听觉脑干反应
鬼笔环肽抗体Alexa FluorA12381免疫荧光染色
磷酸盐缓冲液SIGMAP4417
鼠笼式捕鼠笼14 cm × 17 cm × 24 cm
ROMPUN-赛拉嗪注射液 Bayer HealthCare, LLC
声音放大器 MT-1000unika用于噪声暴露
声学信号发生器/分析仪/杂项 FW-02CLIO620300719用于噪声暴露
隔音室IEA Electro-Acoustic Technology用于噪声暴露和听觉脑干反应
扬声器 IEA Electro-Acoustic Technology用于噪声暴露
刺激模块 STM100CBIOPAC用于听觉脑干反应
吐温 X-100SIGMAT8787免疫荧光染色
耳管耳机套装 OUT101BIOPAC用于听觉脑干反应
正置显微镜 BX53Olympus图像采集
赛拉嗪（Zoletil）Virbac

参考文献

  1. World Report on Hearing. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240020481 (2021).
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  5. Takeda, S., Mannström, P., Dash-Wagh, S., Yoshida, T., Ulfendahl, M. Effects of aging and noise exposure on auditory brainstem responses and number of presynaptic ribbons in inner hair cells of C57BL/6J mice. Neurophysiology. 49 (5), 316-326 (2017).
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