本文介绍了一种噪声性听力损失（NIHL）小鼠模型的实验方案。为诱导NIHL，我们设计了一种新型且简便的装置，该装置由波纹塑料、大鼠捕鼠笼和扬声器组成。采用听觉脑干反应和免疫荧光成像分别评估听力功能和外毛细胞损伤情况。
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摘要
摘要
噪声性听力损失（NIHL）的动物模型对于病理学家、治疗师、药理学家以及听力研究人员深入理解NIHL的发病机制，并进一步优化相应的治疗策略具有重要意义。本研究旨在建立一种改进的小鼠NIHL模型构建方案。实验采用雄性C57BL/6J小鼠，在未麻醉状态下连续5天、每天6小时暴露于高强度噪声（1 kHz和6 kHz纯音同时呈现，声压级为115–125 dB SPL-A）。在噪声暴露后1天和1周，通过听觉脑干反应（ABR）评估小鼠的听觉功能。ABR检测完成后，处死小鼠并取其耳蜗柯蒂氏器进行免疫荧光染色。ABR检测结果显示，噪声暴露1天后小鼠出现显著的听力损失。暴露1周后，实验组小鼠的听阈下降至约80 dB SPL，仍显著高于对照组小鼠（约40 dB SPL）。免疫荧光成像结果表明，外毛细胞（OHCs）出现损伤。综上所述，我们成功利用雄性C57BL/6J小鼠建立了NIHL模型，并研制并应用了一种新型且简单的纯音噪声发生与传递装置。通过听阈的定量测定以及外毛细胞损伤的形态学验证，均表明所施加的噪声成功诱导了预期的听力损失。
引言
全球约有13亿人因噪声暴露而遭受听力损失1。本研究旨在建立一套清晰、逐步的操作流程，用于诱导并确认噪声性听力损失（NIHL）。NIHL 是由于毛细胞（HCs）和螺旋神经节神经元（SGNs）的退化或破坏、毛细胞静纤毛的损伤，和/或耳蜗内毛细胞与螺旋神经节神经元之间突触的丧失所导致。此类异常除了引起噪声性听力损失外，还可能导致耳鸣以及言语感知能力下降（尤其是在复杂的声学环境中）。这些生理缺陷可能相继影响个体的社会功能、心理状态和认知功能2,3,4,5,6。
在基于小鼠的噪声性听力损失（NIHL）相关临床前研究中，最常用的小鼠品系为 CBA/CaJ2,3,6,7 和 C57BL/64,
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方案
本研究的动物实验已获得马偕医学院动物照护委员会的批准。八周龄雄性 C57BL/6J 小鼠购自国家实验动物中心（中国台湾新北市）。所有小鼠的繁殖和饲养均依照标准动物实验规范进行。
1. 小鼠噪声性听力损失的诱导
- 准备实验小鼠的笼子
- 使用尺寸为 14 cm × 17 cm × 24 cm 的大鼠捕鼠笼。将四块瓦楞塑料板裁剪成合适大小，使其能够放入笼内（尺寸分别为 13 cm × 23 cm 和 13 cm × 16 cm）。
- 为防止小鼠脚部被网格划伤，将其中两块塑料板分别置于笼底和后侧。另将剩余两块塑料板相互垂直交错放置，将笼内空间均分为四个区域。
- 在隔音箱中进行本实验。将扬声器置于笼子前方 8.5 cm 处，并将扬声器与笼子一同放入隔音箱内。
- 打开 CLIO 应用软件
- 将光标移至扬声器图标，然后点击 TwoSin。将 Freq 1 的值设为 1000 Hz，Freq 2 的值设为 6000 Hz，然后点击 OK 开始播放声音。
- 在 Leq 选项卡下，将 dBV 更改为 ....
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结果
听觉脑干反应（ABR）听力阈值的变化
小鼠在噪声暴露后1天或1周时，采用短音听性脑干反应（tone-burst ABR）检测其听觉阈值。噪声暴露后1天，在所测试的三个频率下均观察到听觉阈值显著升高（12 kHz：84.29 ± 2.77 dB SPL；24 kHz：91.43 ± 0.92 dB SPL；32 kHz：98.57 ± 1.43 dB SPL）（即第6组）th 天）。噪声暴露后1周出现部分听力恢复（即第13th 天），但与对照组相比，所有频率的听阈仍升高超过30 dB（12 kHz：72.86 ± 2.86 dB SPL；24 kHz：84.29 ± 2.77 dB SPL；32 kHz：87.14 ± 4.21 dB SPL）（对照组：12 kHz：41 ± 0 dB SPL；24 kHz：51 ± 0 dB SPL；32 kHz：51 ± 0 dB SPL）。本研究中，高频听力损伤更为严重（图5采用双因素方差分析（two-way ANOVA）进行统计分析，组间比较采用Bonf.......
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讨论
噪声性听力损失可分为两种类型：暂时性噪声性听力损失，表现为听阈的一过性偏移；以及永久性噪声性听力损失，其特征是听阈发生永久性偏移。我们在第6天观察到的听力损失th 天（噪声暴露后1天）被认为由这两种类型共同构成。在此情况下，由于听力损失的时间相关成分，听力阈值会随时间推移逐渐恢复。在我们前期的实验研究中，采用相同实验装置和动物所获得的结果显示，由2天噪声暴露引起的听力损失在2周内完全恢复，表明并未产生永久性噪声性听力损失（NIHL）。相反，本研究中由5天噪声暴露引起的听力损失被认为包含永久性成分，因为在第13天时，其听力阈值仍显著高于对照组水平th 天（噪声暴露后1周）。
当前方案的一个局限性在于，我们使用在12 kHz处检测到的听力阈值来代表小鼠的低频听力阈值，该频率对应于耳蜗的顶端回。严格来说，耳蜗顶端回对4 kHz至8 kHz的声刺激更为敏感12。然而，这一局限性几乎不会降低本研究及该方案的价值，因为所提供的方案详细描述了所有操作步骤，并列出了建模过程中所涉及的设备。文中提供的大多数参.......
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致谢
感谢中国台湾科技事务主管部门（MOST）的资助（MOST 110-2314-B-715-005，MOST 111-2314-B-715-009-MY3），以及马偕医学院院内研究经费的支持（MMC-RD-110-1B-P030，MMC-RD-111-CF-G002-03）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1/4" CCP 自由场标准麦克风套装 | GRAS | 428158 | 用于噪声暴露 |
| 放大器输入模块 AMI100D | BIOPAC | 用于听觉脑干反应 | |
| 生物放大器 BIO100C | BIOPAC | 用于听觉脑干反应 | |
| 牛血清白蛋白 | SIGMA | A9647 | 免疫荧光染色 |
| Cellsens 软件 | Olympus life science | 图像采集 | |
| 波纹塑料 | |||
| DAPI 荧光封片剂 | SouthernBiotech | 0100-20 | 免疫荧光染色 |
| 乙二胺四乙酸 | SIGMA | E5134 | 脱钙 |
| 诱发电位放大器 ERS100C | BIOPAC | 用于听觉脑干反应 | |
| 甲醛 | APLHA | F030410 | 耳蜗固定 |
| 高性能数据采集系统 MP160 | BIOPAC | 用于听觉脑干反应 | |
| 模块化扩展电缆 MEC110C | BIOPAC | 用于听觉脑干反应 | |
| Myo7A 一抗 | Proteus | 25-6790 | 免疫荧光染色 |
| Myo7A 二抗 | Jackson immunoresearch | 711-545-152 | 免疫荧光染色 |
| 针状电极，单极 12 mmTp，EL452 | BIOPAC | 用于听觉脑干反应 | |
| 鬼笔环肽抗体 | Alexa Fluor | A12381 | 免疫荧光染色 |
| 磷酸盐缓冲液 | SIGMA | P4417 | |
| 鼠笼式捕鼠笼 | 14 cm × 17 cm × 24 cm | ||
| ROMPUN-赛拉嗪注射液 | Bayer HealthCare, LLC | ||
| 声音放大器 MT-1000 | unika | 用于噪声暴露 | |
| 声学信号发生器/分析仪/杂项 FW-02 | CLIO | 620300719 | 用于噪声暴露 |
| 隔音室 | IEA Electro-Acoustic Technology | 用于噪声暴露和听觉脑干反应 | |
| 扬声器 | IEA Electro-Acoustic Technology | 用于噪声暴露 | |
| 刺激模块 STM100C | BIOPAC | 用于听觉脑干反应 | |
| 吐温 X-100 | SIGMA | T8787 | 免疫荧光染色 |
| 耳管耳机套装 OUT101 | BIOPAC | 用于听觉脑干反应 | |
| 正置显微镜 BX53 | Olympus | 图像采集 | |
| 赛拉嗪（Zoletil） | Virbac |
参考文献
- World Report on Hearing. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240020481 (2021).
- Fernandez, K. A., et al. Noise-induced cochlear synaptopathy with and without sensory cell loss. Neuroscience. 427, 43-57 (2020).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C.
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重印与许可
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