高效转染 体外 使用肽-泊洛沙胺纳米颗粒在培养细胞中转录mRNA

摘要

利用微流控混合装置开发了一种自组装肽-泊洛沙胺纳米颗粒（PP-sNp），用于包封与递送 体外 转录的信使RNA。所述mRNA/PP-sNp可有效转染培养细胞 体外.

摘要

体外 信使RNA（mRNA）疫苗在应对2019冠状病毒病（COVID-19）大流行中展现出巨大潜力。由于mRNA具有不稳定性，mRNA疫苗必须包含高效且安全的递送系统。一种自组装肽-泊洛沙胺纳米颗粒（PP-sNp）基因递送系统专为核酸的肺部递送而设计，在介导成功mRNA转染方面表现出良好前景。本文介绍了一种改进的PP-sNp制备方法，详细阐述了PP-sNp 包裹 Metridia 荧光素酶（MetLuc）mRNA 并成功转染培养细胞。MetLuc-mRNA 通过以下方法获得： 体外 从线性DNA模板进行转录的过程。一种PP-sNp 通过微流控混合器将合成肽/泊洛沙明与mRNA溶液混合，从而实现PP-sNp的自组装。PP-sNp的电荷 随后通过测量Zeta电位来评估。同时，测定PP-sNp的多分散性和流体动力学粒径。 使用动态光散射法测量纳米颗粒。将mRNA/PP-sNp纳米颗粒转染至培养细胞中，并检测细胞培养上清液中的荧光素酶活性。代表性结果展示了其能力 体外 转染。该方案可能为开发下一代mRNA疫苗递送系统提供启示。

引言

接种疫苗被誉为减少传染病发病率和死亡率的最有效医学干预措施之一¹自2019冠状病毒病（COVID-19）暴发以来，疫苗的重要性已得到充分证明。与传统的注射灭活或减毒病原体的方法不同，先进的疫苗技术（如核酸疫苗）致力于保留目标病原体的免疫刺激特性，同时避免传统全微生物病毒或细菌疫苗可能带来的安全性问题。DNA疫苗和RNA（即 体外 基于体外转录信使RNA（IVT mRNA）的疫苗对包括传染病和癌症在内的多种疾病具有从预防到治疗的潜力^2,3从原理上讲，核酸类疫苗的潜力与其生产、有效性和安全性相关⁴这些疫苗可采用无细胞方式生产，从而实现经济高效、可扩展且快速的大规模制备。

单个基于核酸的疫苗可编码多种抗原，从而能够以更少的接种次数靶向多种病毒变异株或细菌，并增强对难治性病原体的免疫应答^5,6。 此外，基于核酸的疫苗可模拟病毒或细菌感染的自然侵入过程，从而引发B细胞和T细胞介导的免疫应答。与某些病毒载体或DNA疫苗不同，体外转录mRNA（IVT mRNA）疫苗在安全性方面具有显著优势。它们可在细胞质中快速表达目标抗原，且不会整合到宿主基因组中，从而避免了插入突变的风险⁷。IVT mRNA在完成有效翻译后会自动降解，因此其蛋白表达动力学易于控制^8,9。在严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）大流行的推动下，全球众多公司和机构的努力使得多种疫苗得以迅速上市。IVT mRNA疫苗技术展现出巨大潜力，并首次在临床上实现了人们此前预期的成功，这得益于其快速的设计能力以及在数月内灵活适应任意目标抗原的特性。IVT mRNA疫苗在抗击COVID-19临床应用中的成功，不仅开启了IVT mRNA疫苗研发的新时代，也为未来快速开发应对传染病暴发的有效疫苗积累了宝贵经验^10,11。

尽管体外转录mRNA疫苗具有广阔的应用前景，但将IVT mRNA高效递送至其作用部位（即细胞质）的细胞内递送仍面临重大挑战¹²，特别是对于那些被给予的 通过 气道⁴体外转录mRNA本质上是一种不稳定的分子，其半衰期极短（约7小时）。¹³，这使得体外转录mRNA极易被无处不在的RNase降解¹⁴先天免疫系统的淋巴细胞倾向于吞噬被识别的体外转录mRNA 体内 应用。此外，其高负电荷密度和大分子量（1 x 10⁴-1 × 10⁶ Da）的体外转录mRNA会削弱其穿过细胞膜带负电荷脂质双层的有效渗透能力¹⁵因此，需要一种含有特定生物功能材料的递送系统，以抑制体外转录mRNA分子的降解并促进细胞摄取¹⁶.

除少数例外情况直接使用裸露的体外转录mRNA外 体内 研究中，采用多种递送系统将体外转录的mRNA运送到治疗作用部位^17,18先前的研究表明，在无递送系统辅助的情况下，仅有极少数体外转录的mRNA可在细胞质中被检测到。¹⁹已开发出多种策略以改进RNA递送，该领域持续不断进行探索，方法涵盖从鱼精蛋白缩合到脂质包封等多种技术。²⁰脂质纳米颗粒（LNPs）是目前临床进展最快的mRNA递送载体，这一点已由所有获批用于临床的mRNA新冠疫苗均采用基于LNPs的递送系统所证实。²¹然而，当递送这些制剂时，脂质纳米颗粒（LNPs）无法介导有效的mRNA转染 通过 呼吸途径²²这显著限制了这些制剂在诱导黏膜免疫反应或治疗囊性纤维化、α1-抗胰蛋白酶缺乏等肺部相关疾病中的应用。因此，开发一种新型递送系统，以实现体外转录mRNA在呼吸道相关细胞中的高效递送和转染，是解决这一未满足需求的必要途径。

已证实，肽-泊洛沙明自组装纳米颗粒（PP-sNp）递送系统可在小鼠呼吸道中介导核酸的高效转染²³PP-sNp 采用多功能模块化设计方法，可将不同的功能模块整合到纳米颗粒中，用于快速筛选和优化²³合成肽和电中性两亲性嵌段共聚物（poloxamine）可在PP-sNp内自发与体外转录mRNA相互作用，形成结构致密、表面光滑且分布均匀的纳米颗粒²³. PP-sNp 可提高体外培养细胞及小鼠呼吸道中IVT mRNA分子的基因转染效果²³本研究描述了一种生成PP-sNp的方案 含有编码Metridia荧光素酶（MetLuc-mRNA）的体外转录mRNA（图1）。受控且快速的混合 通过 一种采用交错人字形混合设计的微流控混合装置在本方案中被使用。该操作步骤简便，可实现PP-sNp的制备 尺寸更均一。利用微流控混合器制备PP-sNp的总体目标是生成PP-sNp 以高度可控的方式实现 mRNA 的复合，从而实现高效且可重复的细胞转染 体外本实验方案描述了PP-sNp的制备、组装及表征方法。 含有 MetLuc-mRNA。

方案

1. 体外 化学修饰mRNA的转录

注意：必须使用无核酸酶的离心管、试剂、玻璃器皿、移液器吸头等，因为RNase在环境中普遍存在，例如实验室溶液、仪器表面、头发、皮肤、灰尘等。使用前应彻底清洁实验台表面和移液器，并佩戴手套以避免RNase污染。

1. 对DNA模板进行线性化。
   1. 合成海肾荧光素酶（Metridia luciferase，MetLuc）的开放阅读框（ORF），其两侧分别带有T7聚合酶启动子、5'非翻译区（UTR）、3'UTR和poly(A)尾，并将其克隆至可在细菌中表达的PUC57载体中（参见 材料表).
      注意：DNA 模板的编码序列已在下文提供 补充文件 1.
   2. 培养细菌，裂解细菌，并通过相应的柱子纯化质粒DNA（参见质粒DNA提取试剂盒） 在 材料表).
   3. 进行一次50 µL的单次反应，其中包含2 µL BamHI和2 µL KpnI（参见 材料表），以及2 µg质粒DNA，在37 °C下孵育1小时，以实现DNA模板的线性化。
2. 执行 体外 转录以生成无帽结构的体外转录mRNA。
   1. 使用T7转录试剂盒和假尿苷（pseudouridine）进行一次20 µL反应体系的mRNA合成（参见 材料表：10 µL（0.8–1 µg）线性化DNA模板，1.5 µL（150 mM）ATP、伪尿苷三磷酸（pseudo-UTP）、GTP和CTP，2 µL 10×转录缓冲液，1 µL T7酶，以及1 µL无核酸酶水（NF-water）。充分混匀上述组分，于37 °C孵育3小时。
3. 移除模板DNA。
   1. 转录完成后加入1 µL（1 U）无RN酶的DNase，37 °C孵育15分钟。
4. 使用氯化锂沉淀法纯化无帽-体外转录mRNA。
   1. 使用氯化锂纯化未加帽的体外转录mRNA（参见 材料表）工作浓度为 10 mM。将 50 µL 的 10 mM 氯化锂加入 20 µL 未加帽的体外转录 mRNA 溶液中。
   2. 将总体积充分混匀，置于 −20 °C 冰浴 1 小时。在 12,000 x g 条件下离心 12 分钟，收集未加帽的体外转录 mRNA。 g每次20 µL反应通常可产生80-120 µg的无帽IVT mRNA。
5. 进行体外转录mRNA加帽。
   1. 使用Cap 1加帽系统进行体外转录mRNA加帽（参见 材料表。简言之，将50 µg未加帽的体外转录mRNA（uncapped-IVT mRNA）于65 °C加热10分钟以去除二级结构，随后在37 °C反应30–60分钟，于100 µL反应体系中使用2.5 µL S-腺苷甲硫氨酸（SAM）（20 mM）和4 µL 2'-O-甲基转移酶（100 U），将未加帽的体外转录mRNA的5'端与通过修饰m7G帽结构生成的cap 1结构连接。
   2. 使用 250 µL 的 10 mM 缓冲液纯化 100 µL 帽修饰的体外转录 mRNA 氯化锂，并用50 µL无核酸酶水稀释。
6. 测定加帽IVT mRNA的纯度和分子大小。
   1. 使用紫外-可见分光光度计测定加帽IVT mRNA的浓度。使用RNA标准品（参见 材料表），在含有18%甲醛的1%甲醛变性琼脂糖凝胶中分析加帽-体外转录mRNA的分子大小（电压为120 V）。确保未加帽-体外转录mRNA和加帽-体外转录mRNA均储存于−80 °C。
      ​注意：在 A 值测定中，体外转录的 mRNA 被认为具有良好的纯度₂₆₀/A₂₈₀ 1.8–2.1 的比值和 A₂₆₀/A₂₃₀ 2.0 或略高的比例。

2. 体外转录mRNA/PP-sNp的制备

1. 通过将T704（见材料表）溶于无热原水（NF-water）中，配制10 mg/mL的泊洛沙胺704（T704）储备液。将配制好的溶液储存于4 °C。
   注意：T704含有由乙二胺中心基团连接四个聚丙烯氧化物（PPO）嵌段和聚乙二醇（PEO）嵌段链组成的X型结构²⁴。T704的分子量（Mw）为5500。
2. 将合成肽（sPep，见材料表）溶于无热原水中，配制2 mg/mL的sPep储备液（序列：KETWWETWWTEWWTEWKKKKRRRRRKKKKGACSE
   RSMNFCG），并于4 °C保存。
3. 将体外转录mRNA（IVT mRNA）（步骤1）置于冰上解冻，于室温下以300 × g 短暂离心3秒后再打开管盖。用无热原水将IVT mRNA溶液稀释至0.04 µg/µL。
   注意：建议尽可能在生物安全柜中操作IVT mRNA。
4. 用无热原水将sPep溶液稀释至0.555 µg/µL，T704溶液稀释至8 µg/µL，配制T704与sPep混合溶液。混合后于室温孵育15分钟，以备后续使用。
   注意：根据所需的N/P比计算所需sPep的用量。N/P比是指sPep中氮残基总数（N）与IVT mRNA中带负电荷的磷酸基团总数（P）之比。根据T704与IVT mRNA之间的质量比（w/w）计算所需T704的用量。实验中需确保N/P比为5，w/w比为100。
5. 按照以下步骤制备IVT mRNA/PP-sNp制剂。
   1. 将IVT mRNA溶液（步骤3）吸入1 mL注射器中，确保注射器尖端无气泡或空气间隙。将注射器装入卡匣一侧靠近旋转块的位置。
   2. 用1 mL注射器吸取T704与sPep混合溶液（步骤4），去除注射器尖端的气泡或空气间隙，并将注射器插入泵的另一入口（见材料表）。
   3. 设置泵的流速比为1:1，总流速为4–10 mL/min。
      注意：本研究中最佳总流速为6 mL/min。
   4. 在混合装置流路末端放置一个10 mL无RNase锥形管（见材料表），用于收集混合后的IVT-mRNA/PP-sNp溶液。
   5. 启动泵开始混合，确保参数输入正确。泵运行6秒后，从锥形管中收集IVT-mRNA/PP-sNp样品。
      注意：PP-sNp 采用微流控混合器制备（补充图1）。该装置包括恒流泵、连接装置、芯片和固定装置。在混合过程中，与芯片相连的恒流泵按照预设流速向芯片输送液体。该恒流泵可通过单一输出通道连接芯片的多个输入通道。装置各组件（包括芯片）均购自商业来源并合理组装（见材料表）。若使用不同的实验设置，则IVT mRNA溶液与T704-sPep混合溶液的流速、体积等参数可能与本方案所示不同，需相应优化。

3. IVT-mRNA/PP-sNp 的流体动力学直径和多分散性的测量

1. 取一步骤2所得的体外转录mRNA/PP-sNp溶液等分试样，用无核酸酶水稀释至终体积为1 mL。
2. 使用半微量比色皿²⁵测定其流体动力学粒径及多分散系数（PDI）。将体外转录mRNA/PP-sNp溶液加入比色皿中，并放入粒径分析仪（参见材料表）。设定标准操作程序，点击开始以启动数据采集。

4. 转染用细胞的制备

1. 转染前24小时，以每孔3.5 × 10⁴个细胞的密度将人支气管上皮细胞（16HBE）和树突状细胞系（DC2.4）接种于96孔板中。细胞培养基中需添加10%热灭活胎牛血清和1%青霉素/链霉素。
   注意：细胞购自商业来源（见材料表）。
2. 将细胞置于培养箱中（37 °C、5% CO₂环境）培养24小时，确保转染前细胞融合度达到60%–80%。

5. 培养细胞的转染

1. 移除培养基后，用每孔 0.2 mL 的 1× PBS 清洗已接种的细胞。
2. 向每孔含有已接种细胞培养物的孔中加入 170 µL 无血清培养基。
3. 将含有 0.4 µg MetLuc mRNA 的体外转录 mRNA/PP-sNp 制剂（按步骤 2 制备）以每孔 30 µL 的量逐滴加入。
4. 将细胞与体外转录 mRNA/PP-sNp 制剂在 37 °C、含 5% CO₂ 的加湿环境中孵育 4 小时。
5. 用 0.2 mL 新鲜培养基替换转染培养基，新鲜培养基中添加 10% 热灭活胎牛血清和 1% (v/v) 青霉素/链霉素。
   注意：胎牛血清在 56 °C 加热 30 分钟以实现灭活。
6. 将转染后的细胞在 37 °C、含 5% CO₂ 的环境中继续孵育 24 小时，收集各孔的上清液用于检测。

6. 使用Metridia荧光素酶（MetLuc）检测分析细胞转染效率

1. 使用腔肠素底物（见材料表）检测每个孔上清液中的MetLuc活性，步骤如下：
   1. 通过向腔肠素底物中加入1× PBS配制新鲜的检测溶液（腔肠素浓度为15 mM）。
   2. 涡旋振荡腔肠素溶液10秒，确保充分混匀。
   3. 将50 µL上清液（步骤5中收集）加入96孔板中。
   4. 在手动加入或通过自动进样方式向各孔加入30 µL腔肠素溶液（15 mM）之前，设置酶标仪（见材料表）的读数时间为1,000毫秒。
   5. 加入腔肠素溶液至上清液后立即点击开始以测定发光信号。
      注意：使用酶标仪测定发光信号，其活性以相对光单位表示。PBS转染孔获得的数值将作为空白对照使用。

结果

重组质粒经酶切消化以制备线性化DNA模板（图2A）。采用所述方案，T7 体外 转录试剂盒每20 µL反应可产生80-120 µg未加帽的MetLuc-mRNA，每100 µL反应可产生50-60 µg加帽的MetLuc-mRNA。通过电泳分析时，高质量的完整MetLuc-mRNA应显示单一且清晰的条带，如图所示 图2BDNA模板中引入的污染物可能导致RNA降解和产量降低。

采用微流控混合法制备含有 MetLuc-mRNA 的 PP-sNp（MetLuc-mRNA/PP-sNp）（图1）。表1列出了 MetLuc-mRNA/PP-sNp 理化表征的示例数据。若 MetLuc-mRNA/PP-sNp 的流体动力学半径在约 70–100 nm 范围内，可视为符合要求。此外，PP-sNp 的多分散系数（PDI）应保持恒定，最好低于 0.2，但 PDI 值不超过约...

讨论

此处描述的方案不仅能够以较低成本快速制备具有特定性质的体外转录（IVT）mRNA疫苗制剂，还提供了根据特定治疗目的（如基因治疗）定制PP-sNp制剂的可能性。为确保成功制备IVT mRNA/PP-sNp，建议特别关注若干关键步骤。操作mRNA时，务必始终注意保持无RNase的环境，因为IVT mRNA极易被RNase降解，即使其已通过化学修饰进行稳定化处理。同时，在储存制剂过程中也必须确保无RNase的条件。建议将IVT mRNA/PP-sNp在2–8 °C下储存，最长不超过1周。实验结果表明，无核酸酶水可有效形成PP-sNp 转染效率高。可根据需要使用其他缓冲液，如 PBS、生理盐水、OptiMEM 等。建议进行 体外 使用 OptiMEM 培养基进行 IVT mRNA/PP-sNp 转染，以确保培养细胞的存活率。若选择除无核酸酶水以外的缓冲液配制制剂，则必须使用低浓度（低于 100 ng/mL）的 IVT mRNA；否则，纳米颗粒易发生沉淀，导致制剂失效。该现象的原因在于合成肽中的阳离子部分。此外，纳米颗粒较高的正电荷密度可能破坏细胞膜稳定性，从而引起显著的细胞毒性。然而，既往研究已证实，PP-sNp 中...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BamHI	Takara	1010
cap 1 加帽系统	Jinan	M082
树突状细胞系	Sigma	SCC142
DNA 测序	Genescript
人支气管上皮细胞	Sigma	SCC150
KpnI	Takara	1068
LP	Beyotime	C0533
氯化锂	APEXBio	B6083
Malvern Zetasizer Nano ZS90	Malvern	NB007605
微流控芯片	ZHONGXINQIHENG	Standard PDMS chip
酶标仪	ThermoFisher	Varioskan lux
NanoDrop One	ThermoFisher	ND-ONE-W (A30221)
无核酸酶水	ThermoFisher	AM9932
OptiMEM	Gibco	31985070
青霉素-链霉素	Gibco	15140122
假尿苷	APE×Bio	B7972
QIAprep Spin Miniprep 试剂盒	Qiagen	27106
Quanti-Luc	InvivoGen	Rep-qlc2
RiboRuler High Range RNA Ladder	ThermoFisher	SM1821
无RNase锥形管	Biosharp	BS-100-M
RPMI 1640 培养基	ThermoFisher	C11875500BT
注射泵	Chemyx	Fusion 101
T7 转录试剂盒	Jinan	E131