构建环状细胞穿透肽以增强穿越生物屏障的能力

摘要

本方案描述了含芳香族交联结构的环状细胞穿透肽的合成方法，及其跨生物屏障渗透性的评价。

摘要

癌症一直是全球健康领域的重大挑战。然而，复杂的肿瘤微环境通常限制了治疗药物对深层肿瘤细胞的渗透，从而导致肿瘤复发。为了克服生物屏障穿透能力有限的问题，研究人员发现了具有优异膜转位能力的细胞穿透肽（CPPs），并将其作为有效的分子载体用于将多种货物递送入细胞。然而，传统的线性CPPs通常表现出较差的蛋白水解稳定性，这限制了它们穿越生物屏障的能力。因此，开发能够穿透生物屏障并具有增强蛋白水解稳定性的新型分子载体，对于提高生物医学应用中的药物递送效率具有重要意义。我们此前已合成了一系列带有芳香族交联结构的短环状CPPs，其在癌细胞和组织中的渗透能力优于相应的线性肽。本文介绍了一种简明的实验方案，用于合成荧光标记的环状多聚精氨酸R8肽及其线性对应物，并概述了研究二者细胞渗透性的关键步骤。

引言

过去几十年来，细胞穿透肽（CPP）在药物递送领域的研发取得了快速进展。CPP 已被广泛用作分子转运体，用于治疗多种危及生命的疾病，包括神经系统疾病^1，2、心脏病³、糖尿病⁴、皮肤病⁵以及癌症^6，7。尽管已有大量研究投入，癌症仍然是全球重大健康负担，伴随高发病率和高死亡率⁸。治疗癌症的一个严重障碍是由于生理屏障（如致密的细胞外基质（ECM）、异常的肿瘤血管系统、多重膜屏障以及高的组织间液压力（IFP））限制了治疗药物对深层肿瘤细胞的可及性⁹。因此，开发具有更强能力跨越生物屏障递送货物的新型 CPP 被认为是癌症治疗的关键策略^10，11。

根据其理化性质，细胞穿透肽可分为阳离子型、两亲性和疏水性细胞穿透肽¹²其中，带正电荷的HIV-TAT肽和合成多聚精氨酸在生物医学研究中具有重要意义，已被广泛研究以促进药物的细胞内递送¹³Tunnemann 等人基于使用 R3 至 R12 多肽进行的细胞通透性研究报道，合成的多聚精氨酸肽要实现高效的细胞穿透，至少需要八个精氨酸残基。¹⁴然而，由于这些CPPs会迅速发生水解，通常具有较短的血浆半衰期 体内此外，关于如何优化细胞穿透肽（CPPs）的化学结构以增强其跨屏障能力，目前知之甚少，因为穿透多层细胞膜具有较大挑战性。¹⁵因此，开发能够穿透生物屏障的新型分子载体以提高药物递送效率成为迫切需求。2020年，Komin 等人¹⁶ 发现了一种名为CL肽的细胞穿透肽，其包含一个螺旋模体（RLLRLLR）和一个聚精氨酸尾（R7），可穿越上皮单层。通过改变螺旋结构模式，还合成了一系列CL肽变体。该探索可为开发新型细胞穿透肽以递送货物穿越生物屏障提供重要指导。此外，Dietrich等通过增加肽的整体疏水性，优化了StAX肽的细胞通透性，从而抑制Wnt/β-catenin信号通路。¹⁷.

通过环化对无规线性肽进行构象限制是提高其蛋白水解稳定性和通透性的有效方法^18,19,20结构强化增强了环肽对蛋白酶的抗性，使其更加稳定 体内 与线性类似物相比，肽的环化可能通过促进分子内氢键形成，从而掩盖极性的肽骨架，提高肽的膜通透性。²¹在过去二十年中，化学选择性环化方法已成为构建具有不同结构的环肽的有效策略，例如全烃类、内酰胺、三唑、间二甲苯、全氟芳基及其他交联结构。^22,23复杂的肿瘤微环境所形成的生物屏障可能会降低药物在实体瘤中的渗透²⁴我们先前发现，环状穿膜肽对酶降解的抗性显著优于其线性对应物²⁰此外，肽段的整体疏水性对其细胞通透性的增强至关重要。²²根据上述研究可以推测，带正电荷的模式、整体疏水性的提高以及蛋白水解稳定性的增强，可能共同促进穿膜肽（CPPs）在生物屏障中的通透性。在最近的一项研究中，我们鉴定出两种在第 i 和 i+7 位含有芳香族交联结构的环状穿膜肽，其在肿瘤细胞和组织中的通透性优于相应的线性穿膜肽。¹⁵本文介绍了一种合成荧光标记环状细胞穿透肽（cyclic CPPs）的简明合成方案，以及研究其通透性的关键步骤。

方案

1. 仪器设备准备

注意：所有操作均应在配备适当个人防护装备的通风橱中进行。

1. 在通风橱中组装手动多肽合成装置（图1）。将三通旋塞阀放置（参见 材料表) 转移至真空 manifold（参见 材料表）并连接至氮气（N₂）。确保封闭未使用的入口。
2. 连接一个10 mL聚丙烯柱（参见 材料表) 接到三通活塞上。使用橡胶吸头或真空装置将反应混合物或溶剂从聚丙烯柱中排出 通过 废液收集装置

2. FITC标记的线性R8肽（FITC-R8）和FITC标记的订书肽R8（FITC-sR8-4）的合成

注意：肽的合成是根据标准的Fmoc基固相肽合成（SPPS）方案²⁵进行的。本研究全程使用4-(2',4'-二甲氧基苯基-Fmoc-氨甲基)-苯氧基乙酰胺基-正亮氨酸-MBHA树脂（Rink酰胺MBHA树脂，参见材料表）。

注意：N, N-二甲基甲酰胺（DMF）、N, N-二异丙基乙胺（DIPEA）、吗啉、二氯甲烷（DCM）均为无色液体，吸入或经皮肤吸收后有害。乙醚极易燃。1,2-乙二硫醇（EDT）具有强烈异味。三氟乙酸（TFA）具有强腐蚀性，其酸性是乙酸的10⁵倍。因此，所有试剂和化学品均应在通风橱内使用，并佩戴适当的防护装备。

1. 准备用于多肽合成的树脂。
   1. 计算合成所需树脂的质量：树脂质量（mg）= 合成规模（mmol）/ 树脂载量（mmol/g） × 1,000（mg/g）
      注意：例如，0.2 mmol 规模下使用 Rink Amide MBHA 树脂（载量 0.572 mmol/g）所需质量 = 0.2 mmol / 0.572 mmol/g × 1,000 mg/g = 350 mg。
   2. 向所需量的树脂中加入 4–5 mL DMF，并转移至 10 mL 聚丙烯柱（步骤 1.2），用温和的 N₂ 鼓泡处理 30 分钟以充分溶胀树脂，然后排出 DMF。
   3. 向树脂中加入 4–5 mL 50% 哌嗪/DMF（v/v）溶液，用 N₂ 温和鼓泡处理 30 分钟，重复两次以脱除 N 端 Fmoc 保护基，然后排出混合液。随后，每次加入 4–5 mL DMF 至柱中并用 N₂ 鼓泡至少 1 分钟，重复洗涤 3 次。接着以相同方式用 DCM（3 次）和 DMF（3 次）依次洗涤树脂。
2. 按以下方法进行 Fmoc 保护氨基酸的偶联。
   注意：此处以 0.2 mmol 规模的手动合成为例，说明精氨酸的偶联过程。
   1. 在离心管中将 Fmoc-Arg(Pbf)-OH（5 当量，648.8 mg）和 2-(7-偶氮苯并三唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐（HATU，4.9 当量，372.6 mg）溶于 5 mL DMF 中。
   2. 加入 DIPEA（10 当量，348.4 µL）以活化偶联反应，然后将反应混合物转移至装有树脂的 10 mL 聚丙烯柱（步骤 2.1.3 中制备）中。随后用 N₂ 鼓泡温和搅拌 1–2 小时。
   3. 重复一次偶联反应（步骤 2.2.1 和步骤 2.2.2）。
   4. 偶联完成后，排出反应液，并依次用 DMF、DCM 和 DMF 各洗涤 3 次，每次至少 1 分钟。
   5. 按顺序进行各氨基酸的偶联：向树脂中加入 4–5 mL 50% 哌嗪/DMF（v/v）溶液，用 N₂ 鼓泡处理 30 分钟，重复两次以脱除 N^α-Fmoc 保护基，然后按步骤 2.2.4 所示方法洗涤树脂，再进行下一个氨基酸的偶联（如步骤 2.2.1 和步骤 2.2.2 所示）。重复多个循环以完成目标多肽的合成。
      注意：此步骤可在此暂停。用甲醇浓缩树脂，并用持续的 N₂ 气流干燥。盖紧聚丙烯柱后，将树脂于 4 °C 保存数天（或于 −20 °C 长期保存）。开始新一轮合成前，用 4–5 mL DMF 溶胀树脂 0.5–1 小时。若直接进行下一步，则无需浓缩树脂。
3. 按以下方法用异硫氰酸荧光素（FITC）对多肽进行标记。
   1. 使用与步骤 2.2 中氨基酸偶联相同的方法，将 β-丙氨酸作为间隔臂进行偶联，用于后续 FITC 标记。
   2. 向聚丙烯柱中加入 FITC（5 当量）、DIPEA（10 当量）和 DMF 的混合液，在避光条件下反应 8 小时，完成树脂上多肽的 FITC 标记。
4. 对于 FITC-sR8-4 的合成，按以下方法对线性多肽进行环化。
   1. 向聚丙烯柱中加入 TFA/三异丙基硅烷（TIS）/DCM（3/5/92，v/v/v）混合液，处理 2 分钟以选择性脱除 Cys(Trt) 保护基，然后排出混合液。重复该操作直至淡黄色溶液变为无色，以确保 Trt 保护基完全脱除。
   2. 随后，用 DMF 和 DCM 对树脂依次洗涤至少 3 次。然后将 4,4'-双(溴甲基)联苯（2 当量）溶于含 DIPEA（4 当量）的 DMF 中，加入柱内，反应 4 小时。
5. 按以下方法裂解多肽：多肽合成完成后，用 4–5 mL 甲醇洗涤树脂两次，每次 5 分钟，并用持续的 N₂ 气流干燥。使用适当的裂解试剂混合液处理树脂，对于一般多肽使用 TFA/TIS/H₂O（95/2.5/2.5，v/v/v），对于含半胱氨酸的多肽则使用 TFA/TIS/EDT/H₂O（92.5/2.5/2.5/2.5，v/v/v/v），每 100 mg 树脂使用约 1 mL 裂解液。裂解反应 2–3 小时以释放多肽，然后小心用 N₂ 气流除去 TFA。
6. 为获得粗品多肽，向裂解后的产物中加入 4–5 mL 乙醚以沉淀粗多肽，于 10,000 × g 离心 4 分钟。小心弃去上清液，并在通风良好的通风橱中将多肽风干 3 分钟。
7. 多肽分析：取少量粗品多肽（约从 10 mg 载肽树脂裂解所得）溶于 800 µL 乙腈（ACN）/H₂O（1/1，v/v）中，然后采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）和液相色谱-质谱联用（LC-MS）进行分析（见材料表）。
8. 采用 RP-HPLC 和 LC-MS 对多肽进行纯化。
   1. 将 50 mg 粗品多肽溶于 4 mL ACN/H₂O（1/1，v/v）中，注入配备 C18 柱（4.6 mm × 150 mm，孔径：120 Å，粒径：4 µm；见材料表）的 RP-HPLC 系统。使用含 0.1% TFA/H₂O（v/v）和 ACN 的流动相，以 10% 至 90% ACN 的梯度在 30 分钟内洗脱多肽。常规多肽在 220 nm 检测，FITC 标记多肽在 494 nm 检测。
   2. 收集由质谱鉴定的主要多肽峰对应的馏分，然后冻干目标多肽馏分。将纯化后的多肽于 −20 °C 保存。
      ​注意：纯化后的 FITC-R8 实测 m/z 值如下：[M + 3 H]³⁺：576.63；[M + 4 H]⁴⁺：432.72；[M + 5 H]⁵⁺：346.39；[M + 6 H]⁶⁺：288.85。纯化后的 FITC-sR8-4 实测 m/z 值如下：[M + 3 H]³⁺：704.74；[M + 4 H]⁴⁺：528.77；[M + 5 H]⁵⁺：423.34；[M + 6 H]⁶⁺：352.91。质谱分析条件：仪器：ESI（探针偏压：+4.5 kV；检测器：1.2 kV）；雾化气体流速：1.5 L/min；弯曲去溶剂化通道（CDL）：−20 V；CDL 温度：250 °C；块体温度：400 °C；流速：0.2 mL/min；流动相：50% H₂O/50% ACN。

3. FITC标记肽的定量分析

1. 将少量纯化后的多肽溶解于DMSO中作为储备液（例如，40 µmol/mL）。
2. 使用多功能酶标仪（参见材料表），在96孔微量板（参见材料表）中测定2 µL储备液加入498 µL 10 mM磷酸盐缓冲液（1× PBS，pH 7.4）后在494 nm处的吸光度（A₄₉₄）。稀释倍数为500 µL / 2 µL = 250，微量板的光程为0.5 mm。
3. 使用以下公式计算储备液的浓度：
   浓度（mM）= A₄₉₄ × 稀释倍数 / 0.05（cm）/ 77,000（cm⁻¹·M⁻¹）× 1,000（mM·M⁻¹）
4. 调整至适当稀释度，使测得的A₄₉₄值介于0.1至1.0之间。
   注意：应重复测量多次，以确保测得的浓度准确。77,000 cm⁻¹·M⁻¹的消光系数来源于FITC基团。

4. 肽在胎牛血清（FBS）中的稳定性

1. 将肽溶液与250 µL的25% FBS/H₂O（v/v）混合，使肽浓度为100 µM，在37 °C条件下孵育。分别在孵育0 h、1 h、2 h和4 h后，取10 µL等分试样，然后加入150 µL溶于H₂O/ACN（1/3, v/v）的12%三氯乙酸，以沉淀血清蛋白。
2. 将样品在10,000 × g 条件下离心5 min，取上清液采用HPLC分析（如步骤2.8所述），以确定肽的降解程度。
3. 计算1 h、2 h和4 h时肽峰面积相对于0 h时的比值，得到相应时间点未降解肽的比例。结果为三个平行样品的平均值。

5. 肽的细胞摄取

1. 荧光显微成像
   1. 将圆形盖玻片放入12孔板中。随后，在盖玻片上均匀接种1 × 10⁵个细胞，并加入2 mL培养基，过夜培养。弃去培养基，用1 mL PBS洗涤细胞3次。
      注意：本研究中，HeLa细胞和4T1细胞在含10%胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM，参见材料表）中，于37 °C、含5% CO₂的湿润培养箱中培养。
   2. 在无FBS的DMEM中加入1 mL浓度为3 µM的FITC标记肽，与细胞在37 °C共孵育1小时。随后弃去含肽培养基，用1 mL PBS洗涤细胞3次。
   3. 用1 mL Hoechst 33258染色15分钟。使用荧光显微镜（参见材料表），在相同荧光强度和曝光时间条件下观察各肽的内化情况。
      注意：荧光显微镜设置如下。物镜：Plan-Apochromat：63 ×/1.40 Oil DIC M27；通道1（FITC）：激发滤光片：450–490 nm，发射滤光片：500–550 nm，曝光时间：230 ms；通道2（Hoechst 33258）：激发滤光片：335–383 nm，发射滤光片：420–470 nm，曝光时间：27 ms。
2. 流式细胞术分析
   1. 在12孔板中均匀接种5 × 10⁵个HeLa细胞，于37 °C在DMEM中培养24小时。随后弃去培养基，用1 mL PBS洗涤细胞3次。
   2. 在无FBS的DMEM中加入1 mL浓度为3 µM的FITC标记肽，与细胞在37 °C共孵育1小时。弃去含肽培养基，用含0.25%（w/v）胰蛋白酶和0.53 mM EDTA的PBS消化细胞5分钟，然后在306 × g离心4分钟收集细胞。用PBS洗涤细胞沉淀。
   3. 用含0.05%（w/v）台盼蓝的PBS与细胞孵育3分钟，以淬灭细胞表面结合的荧光，随后使用流式细胞仪（参见材料表）对细胞内荧光进行定量分析。
      注意：流式细胞仪设置：激发波长：488 nm，发射波长：530 nm。台盼蓝还可淬灭死细胞的荧光，有助于在分析肽摄取时区分活细胞与死细胞。
   4. 对4T1细胞采用与HeLa细胞相同的流式细胞术方案进行处理和检测。每样本收集5 × 10⁵个细胞，每组设置三个平行样本。

6. 利用Transwell模型探索肽的细胞间穿透能力

1. 在12孔板中加入2 mL DMEM培养基，接种1 × 10⁵个HeLa细胞，并放入含组织培养板插件的12孔板中（见材料表），于37 °C、含5% CO₂的湿化培养箱中培养24 h。随后，吸除培养基，加入1 mL不含FBS的DMEM培养基，其中含10 µM FITC-R8或FITC-sR8-4（经HPLC纯化），在孔板中与细胞共孵育1 h。
2. 移除含肽段的培养基，用1 mL PBS洗涤细胞3次。向孔板中加入1 mL新鲜的不含FBS的DMEM培养基，然后将含组织培养板插件的孔板中的HeLa细胞与底部圆形盖玻片上的HeLa细胞共同孵育2 h。
3. 用2.5%戊二醛固定盖玻片上的HeLa细胞15 min，随后用DAPI染色15 min。接着在荧光显微镜下观察盖玻片上的HeLa细胞。采用与HeLa细胞相同的实验方案处理和检测4T1细胞。

结果

在本实验方案中，介绍了一种将线性多聚精氨酸R8限制为其环状形式的合成方法。固相肽合成（SPPS）通过手动操作使用简易装置完成（图1）。SPPS的详细合成过程如 图2所示。简而言之，首先使树脂充分溶胀，随后脱除N^α-Fmoc保护基团。然后将N^α-Fmoc保护的氨基酸逐个连接至树脂上，直至完成肽链组装（图2中的步骤1-4）。接着，使用裂解混合液将粗肽从树脂上切割下来（图2中的步骤5）。采用FITC对肽段进行标记，以合成荧光标记的环状穿膜肽（CPPs），并追踪其穿越生物屏障的通透性。随后，在树脂上选择性地脱除半胱氨酸的三苯甲基保护基，再利用4,4'-双(溴甲基)联苯作为交联剂进行肽环化反应（图3A）。FITC-R8和FITC-sR8-4的HPLC及质谱图谱见

讨论

通过引入构象约束来实现多肽的化学稳定化，已被证明是提高多肽稳定性和细胞通透性的有效策略²⁶。本实验方案详细描述了含芳香族交联结构的环状穿膜肽（CPP）的合成步骤及其跨生物屏障通透性的评价方法。与亲水性的内酰胺或三唑交联结构相比^22,27，本研究所采用的芳香族交联结构可提高CPP的整体疏水性，从而显著增强其细胞通透性。另一方面，多肽的环化可通过与半胱氨酸的取代反应轻松实现，无需任何金属催化剂。在本方案中，CPP的环化反应在树脂上进行；然而，由于空间位阻效应，环化效率还取决于多肽的具体序列和长度，可能导致二聚体副产物的生成²⁸。在此情况下，使用载荷能力较低的树脂将有助于减少副反应。此外，也建议在溶液相中以稀释浓度对这类特定多肽进行环化反应²⁹。

本实验方案中有几个关键点需要注意。首先，使用TFA/TIS/EDT/H_2<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1,2-乙二硫醇	Aladdin	K1722093	恶臭
2-(7-氮杂苯并三唑基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐（HATU）	HEOWNS	A-0443697
4,4'-双(溴甲基)联苯	TCI	B1921
4T1 细胞	ATCC		4T1细胞在添加10% FBS（Hyclone）的DMEM培养基中，于37℃、5% CO₂的培养箱中培养。 °含5% CO₂的湿润培养箱2.
乙腈	Adamas	1484971	毒性
二氯甲烷	能量	W330229	皮肤有害
乙醚	Aldrich	673811	易燃的
二甲基亚砜	Beyotime	ST038	皮肤有害
杜尔贝科’DMEM（杜尔贝科改良伊格尔培养基）	Gibco
电喷雾离子化质谱仪	沃特斯	G2-S 期 Tof
乙二胺四乙酸（EDTA）	BioFroxx	1340
胎牛血清（FBS）	HyClone
流式细胞仪	贝克曼库尔特	CytoFLEX
异硫氰酸荧光素异构体（FITC）	能量	E0801812500
荧光显微镜	卡尔·蔡司	Axio Observer 7
Fmoc-Arg(Pbf)-OH	HEOWNS	F-81070
Fmoc-Cys(Trt)-OH	GL Biochem	GLS201115-35202
Fmoc-βAla-OH	Adamas	51341C
HeLa 细胞	ATCC		HeLa 细胞在添加了10% FBS（Hyclone）的DMEM中，于37℃、5% CO₂的培养箱中培养。 °含5% CO₂的湿润培养箱2.
高效液相色谱法	安捷伦	安捷伦 1260
高效液相色谱柱	安捷伦	Poroshell EC-C18 120, 4.6 × 150 mm（孔径 120 Å，粒径4 μm)
冻干机	SP Scientific	Vir Tis
甲醇	Aldrich	9758	毒性
微量滴定板	赛默飞世尔科技 μ滴板	N12391
吗啉	HEOWNS	M99040	刺激物
多功能微孔板读板机	赛默飞世尔科技	VARIOSKAN LUX
N,N-二异丙基乙胺	HEOWNS	E-81416	刺激物
N,N-二甲基甲酰胺	能量	B020051	对皮肤有害
Poly-Prep 柱	Bio-Rad	7321010	聚丙烯层析柱
Rink Amide MBHA 树脂（0.572 mmol/g）	GL Biochem	GLS180301-49101
三通旋塞阀	伯乐（Bio-Rad）	7328107
组织培养板插件	LABSELECT	14211
三氟乙酸	HEOWNS	T63278	腐蚀性
三异丙基硅烷	HEOWNS	T-0284475
胰蛋白酶	BioFroxx	1004
真空 manifold	Promega	A7231