邻近连接技术可实现固定组织中蛋白质精氨酸甲基化的检测、定位与定量

摘要

当修饰的精氨酸残基未知和/或没有特异性抗体可用时，邻近连接实验是一种用于定位和定量特定蛋白质精氨酸甲基化的非常有用的技术。

摘要

精氨酸甲基化作为一种关键的翻译后修饰，正日益受到关注，其参与了多种生物学过程。在组织中对其进行研究常常受限于缺乏能够特异性识别目标精氨酸残基的抗体。邻近连接实验（Proximity ligation assay, PLA）最初被开发用于研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用。本文中，我们详细描述了一种专用于检测精氨酸甲基化的PLA实验方案，并以糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor, GR）为例进行了应用。此前我们已证实PRMT5可在细胞内对GR进行对称性二甲基化修饰，因此在本研究中，我们联合使用广谱性对称性二甲基化抗体与抗GR抗体，通过PLA技术检测乳腺肿瘤中GR的甲基化水平。我们证明，即使在甲基化位点尚未明确的情况下，PLA仍可提供一种独特的方法来定量检测特定蛋白质的精氨酸甲基化状态。该技术还可拓展至其他存在高效广谱抗体的翻译后修饰研究。因此，本文以GR为例，详细阐述了在固定组织样本中利用PLA技术检测精氨酸甲基化的具体方法。

引言

蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMTs）介导的精氨酸甲基化是一种广泛存在的翻译后修饰（PTM），参与多种生物学过程。PRMTs 催化甲基从 S-腺苷甲硫氨酸转移至精氨酸残基。PRMT 家族包含九个成员，根据其催化的甲基化类型进行分类。所有成员均可催化单甲基化（MMA）。I 型（PRMT1、2、3、4、6 和 8）催化不对称二甲基化（ADMA），II 型（PRMT5 和 9）催化对称二甲基化（SDMA），而 III 型（PRMT7）仅生成 MMA¹。通过甲基化大量底物，不同 PRMTs 调控多种重要的细胞过程，如 DNA 修复、转录调控、免疫应答、RNA 加工以及信号转导^2,3。在类固醇激素信号通路中尤为如此，PRMTs 不仅甲基化类固醇受体本身，还甲基化其调控因子或组蛋白，从而调节类固醇受体的活性²。

精氨酸甲基化在癌症中被广泛研究，因为大多数蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMTs）在癌组织中的表达水平均高于正常组织，且其表达水平常与不良预后相关^4,5精氨酸甲基化的检测 体内 对于理解与此修饰相关的细胞功能至关重要。传统方法是使用特异性识别....

方案

已获得每位患者的书面知情同意。该研究方案已通过里昂癌症研究中心机构伦理委员会的批准。

1. 抗体的选择

1. 使用经免疫组化（IHC）或免疫荧光（IF）验证的一抗。
   ​注意：所选的一抗对PLA实验的成功至关重要，尤其是在固定组织中的应用。使用经IHC或IF验证的一抗可提高实验成功率。在开展实验前，必须对抗体进行优化和特异性验证，理想情况下可通过在不表达目标蛋白的细胞中进行对照实验，并使用针对相关甲基转移酶酶活性的特异性抑制剂来实现。此处的实验条件此前已优化完成¹⁰。

2. 石蜡包埋细胞系团块制备

注意：将样本包埋于凝胶中，随后置于自动组织处理仪中进行样本脱水及石蜡包埋。

1. 使用胰蛋白酶消化法在1.5 mL微量离心管中制备细胞沉淀。
   注意：切勿刮取细胞以收获细胞。
2. 将细胞沉淀重悬于1.5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中。
3. 在室温（RT）下以200 × g 离心细胞，吸除PBS上清液。
4. 将沉淀重悬于1 mL 4%甲醛溶液中，于4 °C保存3小时。
5. 用1× Tris缓冲盐....

结果

通过上述方法，可以检测并定量目标蛋白的甲基化水平。本文以PRMT5介导的GR甲基化为例进行说明。此前，PLA实验中所用的抗体及实验条件已应用于细胞检测¹⁰。简言之，针对GR和SDMA的一抗会与连接有互补寡核苷酸的邻近探针结合；当两种蛋白彼此靠近时，环状DNA探针发生杂交，随后通过HRP在明场显微镜下可视化DNA的扩增信号（图1）。我们首先在多个乳腺肿瘤组织中分析了用于IHC检测GR和PRMT5的理想条件（图2）。为检测GR的甲基化，我们选用不同物种来源的一抗分别识别GR（小鼠源）和广谱SDMA（兔源）；随后按照前述方法进行PLA实验，并采集图像（图3A）。使用ImageJ软件对每细胞内的信号点数进行定量分析（图3B）。

讨论

精氨酸甲基化与其他翻译后修饰类似，有助于蛋白质功能的精细调控。然而，由于缺乏有效的检测工具，这种修饰的影响常被低估，这在研究甲基化时尤为突出。 体内，而测量精氨酸甲基化的唯一方法是拥有能够识别目标蛋白甲基化位点的特异性抗体。这显然存在局限性，因为必须事先知晓发生甲基化的精氨酸位点，且必须存在适用于免疫组化（IHC）的高效特异性抗体，但这种情况极为罕见。

本文介绍了一种利用针对不同类型甲基化（单甲基精氨酸，MMA；对称二甲基精氨酸，SDMA；非对称二甲基精氨酸，ADMA）产生的广谱甲基化抗体来克服上述障碍的方法。我们先前已证明，将广谱甲基化抗体与识别目标蛋白的抗体偶联，不仅可在固定细胞中有效检测甲基化水平¹⁰，也可用于固定组织中的甲基化检测。

然而，尽管这项技术十分强大，但在开始实验之前，仍有一些局限性需要了解。在细胞以及尤其是在组织中进行 PLA 时，一抗的选择至关重要。为了提高成功率，应选择经过免疫组化（IHC）验证的抗体，并遵循推荐的稀释比例。优化实验条件时.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Adhesion slides TOMO 90°，x100	VWR	631-1239
抗GR抗体（小鼠）	Santa Cruz	sc393232
抗GR抗体（小鼠）	santa cruz	sc393232
抗PRMT5抗体（兔）	Merck	07-405
抗SDMA抗体（兔）	CST	13222
自动包埋机	Leica	ASP 6025	石蜡浸润与组织块制备
Autostainer XL	Leica	ST5010	自动染色机
Cassettes Q path macrostar III  x1500	VWR	720-2233
CC1	Roche	5279801001
柠檬酸盐缓冲液 pH 6 10x，100 mL	MMF	F/T0050
Dako抗体稀释液	Dako Agilent	S202230-2	抗体稀释液
Discovery ChromoMap二氨基联苯胺（DAB）试剂盒	Roche	760-159	二氨基联苯胺（DAB）试剂盒
Discovery Wash	Roche	7311079001
Duolink insitu  PLA探针 抗小鼠负向	Sigma-Aldrich	DUO92004	PLA 试剂盒（抗兔探针负向）
Duolink insitu 显色检测试剂（明场）	Sigma-Aldrich	DUO92012	PLA 试剂盒（原位检测试剂）
Duolink insitu PLA探针 抗兔正向	Sigma-Aldrich	DUO92002	PLA 试剂盒（抗兔探针正向）
Duolink insitu 洗涤缓冲液（明场）	Sigma-Aldrich	DUO82047	PLA 试剂盒（原位洗涤缓冲液）
乙醇 96% VOL TECHNISOLV，5 L	VWR	83804.360
无水乙醇 ≥99.8%，AnalaR NORMAPUR ACS， 5 L	VWR	20821.365
EZ Prep 10x	Roche	5279771001
福尔马林，即用型，5 L	MMF	F/40877-36	甲醛
全自动封片机	Leica	CV5030	自动封片机
盖玻片 24 x 40	Dutscher	100037
苏木精	Ventana	760-2021
IHC仪器	Roche	DISCOVERY XT	IHC自动化设备
LCS	Roche	5264839001
切片机	Thermo Scientific	Microm HM340E	组织切片（包括包埋块切片）
Pertex封片介质	Histolab	00801-FR
免疫组化用PAP笔	Sigma-Aldrich	Z672548-1EA
石蜡 Wax tek III，4 x 2.5 kg	Sakura	4511
一次性巴斯德吸管	Fisher Scientific	12583237
PBS缓冲液 10x，100 mL	MMF	F/T0020
反应缓冲液 10x	Roche	5353955001
Ribo Wash 10x	Roche	5266262001
RiboCC1	Roche	5266297001
二抗 抗小鼠	Abcam	ab133469
二抗 OmniMap 抗兔 HRP	Roche	760-4311
组织包埋中心	MMF	EC 350
二甲苯（异构体混合物）≥98.5%，AnalaR NORMAPUR ACS，5 L	VWR	28975.360
Zeiss Axio Imager M2显微镜			正置明场显微镜