邻位连接测定可检测、定位和定量固定组织中的蛋白质精氨酸甲基化

Summary

当修饰的精氨酸残基未知和/或没有特异性抗体可用时，邻位连接测定是一种非常有用的技术，用于定位和定量给定蛋白质的精氨酸甲基化。

Abstract

精氨酸甲基化正在成为一种关键的翻译后修饰，涉及广泛的生物过程。它在组织中的研究通常受到缺乏识别靶标精氨酸残基的特异性抗体的限制。邻位连接测定 （PLA） 最初是为了研究蛋白质/蛋白质相互作用而开发的。在这里，我们详细描述了一种专门用于检测精氨酸甲基化的 PLA 方案，我们将其应用于糖皮质激素受体 （GR）。之前已经证明 PRMT5 使细胞中的 GR 二甲基化，我们使用 PLA 与泛对称二甲基抗体和抗 GR 抗体来测量乳腺肿瘤中的 GR 甲基化。我们证明 PLA 提供了一种独特的方法来测量靶蛋白的精氨酸甲基化，即使尚未确定甲基化位点。该技术可以扩展到其他可用有效 pan 抗体的翻译后修饰。因此，我们以 GR 为例详细介绍了用于检测固定组织中精氨酸甲基化的 PLA 技术。

Introduction

蛋白质精氨酸甲基转移酶 （PRMT） 的精氨酸甲基化是一种丰富的翻译后修饰 （PTM），参与许多生物过程。PRMT 催化甲基从 S-腺苷甲硫氨酸转移到精氨酸残基。PRMT 家族由 9 个成员组成，根据它们执行的甲基化类型进行分类。所有成员都进行单甲基化 （MMA）。1 型 （PRMT1、2、3、4、6 和 8） PRMT 催化不对称二甲基化 （ADMA），而 2 型 （PRMT5 和 9） 催化对称二甲基化 （SDMA），而 3 型 （PRMT7） 仅产生 MMA¹。通过甲基化多种底物，不同的 PRMT 调节各种重要的细胞过程，例如 DNA 修复、转录调节、免疫反应、RNA 加工和信号转导 ^2,3。对于类固醇激素信号转导尤其如此，其中 PRMT 不仅通过甲基化受体本身，还甲基化其调节因子或组蛋白来改变类固醇受体的活性²。

精氨酸甲基化在癌症中被广泛研究，因为与正常组织相比，大多数 PRMT 在癌症中过表达，并且它们的表达通常与不良预后有关 ^4,5。体内精氨酸甲基化检....

Protocol

获得每位患者的书面知情同意书。该研究方案得到了里昂癌症研究中心机构伦理委员会的批准。

1. 抗体的选择

1. 使用经 IHC 或免疫荧光 （IF） 验证的一抗。
   注:为研究选择的一抗对 PLA 的成功至关重要，尤其是在固定组织中。使用经 IHC 或 IF 验证的抗体将提高实验的成功率。在进行实验之前，需要对抗体进行优化和特异性分析，理想情况下，在目标蛋白表达无效的细胞中进行对照实验，并使用对所涉及的甲基转移酶的酶活性具有特异性的抑制剂。这里的条件之前已经优化过¹⁰.

2. 石蜡包埋的细胞系沉淀制备

注:将样品包埋在凝胶中，然后置于自动组织处理器中进行样品脱水和石蜡包埋。

1. 使用胰蛋白酶解离在 1.5 mL 微量离心管中制备细胞沉淀。
   注意:不要刮擦以收获细胞。
2. 将细胞沉淀重悬于 1.5 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中。
3. 在室温 （RT） 下以 200 x g 离心细胞。吸出 PBS 上清液。
4. 将沉淀重悬于 1 mL 4% 福尔马林中，并将....

Results

使用上述程序，可以检测和定量目标蛋白质的甲基化。在这里，我们展示了 PRMT5 甲基化 GR 的例子。PLA 的抗体和实验条件先前应用于细胞¹⁰。简而言之，靶向 GR 和 SDMA 的一抗通过与互补寡核苷酸偶联的邻位探针来识别。然后，当蛋白质非常接近时，就会发生环状 DNA 探针的杂交。该 DNA 的后续扩增在明场显微镜下通过 HRP 可视化（图 1）。首先在几种乳腺肿瘤中分析了通过 IHC 检测 GR 和 PRMT5 的理想条件（图 2）。为了检测 GR 甲基化，我们使用了在不同动物物种中产生的识别 GR （小鼠） 和泛 SDMA （兔子） 的一抗;如前所述进行后续的 PLA 实验，并获取图像（图 3A）。使用 ImageJ 软件进行定量以确定每个细胞的点数（图 3B）。

Discussion

与其他 PTM 一样，精氨酸甲基化有助于蛋白质功能的精细调节。然而，由于难以评估这些修改，其影响被低估了，主要是因为缺乏工具。在研究 体内甲基化时尤其如此，其中测量精氨酸甲基化的唯一方法是拥有识别目标蛋白质甲基化残基的特异性抗体。这显然构成了一个限制，因为必须知道甲基化精氨酸残基，并且必须有用于修饰的特异性有效抗体用于 IHC 应用，这种情况很少见。

在这里，我们提出了一种通过使用针对不同类型甲基化 （MMA、SDMA 和 ADMA） 产生的泛甲基抗体来规避这些障碍的方法。我们之前表明，将 pan methyl 抗体与识别目标蛋白的抗体偶联不仅可有效测量固定细胞中的甲基化¹⁰ ，而且可有效测量固定组织中的甲基化。

然而，尽管这项技术很强大，但在开始实验之前也应该注意一些限制。一抗的选择对于细胞中的 PLA 至关重要，在组织中的 PLA 更是如此。为了最大限度地提高成功率，请选择在 IHC 中验证.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
粘附载玻片 TOMO 90°， x100	VWR	631-1239
抗 GR 抗体（小鼠）	Santa Cruz	sc393232
抗 GR 抗体（小鼠）	santa cruz	sc393232
抗 PRMT5 抗体（兔）	Merck	07-405
抗 SDMA 抗体（兔）	CST	13222
Automate d'内含	Leica	ASP 6025	石蜡浸润和块制备
Autostainer XL	Leica	ST5010	Autostainer
Cassettes Q path macrostar III  x1500	VWR	720-2233
CC1 Roche		5279801001
柠檬酸盐缓冲液 pH 6 10x，100 mL	MMF	F/T0050
Dako 抗体稀释剂	Dako Agilent	S202230-2	抗体稀释剂
Discovery ChromoMap 二氨基联苯胺 （DAB） 试剂盒	Roche	760-159	二氨基联苯胺 （DAB） 试剂盒
Discovery Wash	Roche	7311079001
Duolink insitu PLA 探针抗小鼠 minus	Sigma-Aldrich	DUO92004	PLA  试剂盒（探针抗兔 minus）
Duolink 原位检测试剂明场	Sigma-Aldrich	DUO92012	PLA  试剂盒（原位检测试剂）
Duolink 原位 PLA 探针 anti-rabbit plus	Sigma-Aldrich	DUO92002	PLA  试剂盒（探针 anti-rabbit plus）
Duolink 原位洗涤缓冲液 明场	Sigma-Aldrich	DUO82047	PLA  试剂盒（原位洗涤缓冲液）
乙醇 96% VOL TECHNISOLV，5 L	VWR	83804.360
乙醇无水 ≥99.8%， AnalaR NORMAPUR ACS， 5 L	VWR	20821.365
EZ Prep 10x	Roche	5279771001
Formol，即用型，5 L	MMF	F/40877-36	福尔马林
全自动玻璃盖玻片		Leica CV5030	自动盖玻片
玻璃盖玻片 24 x 40	Dutscher	100037
Hematoxylin	Ventana	760-2021
IHC 仪器	Roche	DISCOVERY XT	IHC
自动化 LCS	Roche	5264839001
切片机	Thermo Scientific	Microm HM340E	切割组织，包括块状
封固培养基 Pertex	Histolab	00801-FR
PAP 笔，用于免疫染色	Sigma-Aldrich	Z672548-1EA
石蜡 tek III，4 x 2,5 kg	Sakura	4511
巴斯德一次性移液器	Fisher Scientific	12583237
PBS 缓冲液 10x，100 mL	MMF	F/T0020
反应缓冲液 10x	Roche	5353955001
Ribo 洗涤液 10x	Roche	5266262001
RiboCC1	Roche
抗小鼠二抗	Abcam	ab133469
二抗 OmniMap 抗兔 HRP	Roche	760-4311
组织包埋中心	MMF	EC 350
二甲苯（异构体混合物）≥98.5%，AnalaR NORMAPUR ACS，5 L	VWR	28975.360
蔡司 Axio Imager M2 显微镜			正置明场显微镜