方法文章

小鼠粪便分离与微生物群移植

DOI：

10.3791/64310

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2023年5月26日

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1Division of Clinical Pharmacology, Department of Medicine Vanderbilt University Medical Center and Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University, 2Division of Pediatric Nephrology Department of Pediatrics, Vanderbilt University Medical Center, 3Department of Pathology, Microbiology, and Immunology, Vanderbilt University Medical Center

本文内容

摘要

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本研究的目的是概述一种用于探究心血管疾病中菌群失调机制的实验方案。本文介绍了如何无菌采集和移植小鼠粪便样本、分离肠道组织，以及采用“瑞士卷”法处理肠道，随后结合免疫染色技术分析胃肠道中的病理变化。

摘要

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肠道菌群失调在心血管和代谢性疾病病理生理过程中起着重要作用，但其机制尚不明确。粪菌移植（FMT）是一种有效的方法，可用于阐明整体菌群或特定分离菌种在疾病病理生理中的直接作用。该方法对复发性Clostridium difficile感染患者是一种安全的治疗选择。临床前研究表明，调控肠道菌群是研究菌群失调与疾病之间机制联系的有力工具。粪菌移植可能有助于揭示以肠道菌群为靶点的新型治疗策略，用于心血管代谢性疾病的管理和治疗。尽管在啮齿类动物中成功率较高，但移植过程中仍存在转化医学方面的挑战。本研究旨在为探索肠道微生物组在实验性心血管疾病中作用的研究提供指导。本文详细描述了小鼠研究中粪菌样本的采集、处理、加工及移植的操作流程，并分别阐述了人源和啮齿类供体的样本采集与处理步骤。最后，我们介绍了结合瑞士卷技术和免疫染色技术，用于评估心血管疾病及其相关肠道菌群机制中肠道特异性形态学和完整性的变化。

引言

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包括心脏病和中风在内的心脑血管代谢性疾病是全球首要的死亡原因1。体力活动不足、营养不良、年龄增长和遗传因素均可调节这些疾病的病理生理过程。越来越多的证据表明，肠道微生物群会影响心血管和代谢性疾病，包括2型糖尿病2、肥胖3和高血压4，这可能为这些疾病的新型治疗策略的开发提供关键线索。

微生物群导致疾病的精确机制仍不清楚，目前的研究结果差异较大，部分原因在于方法学的不同。粪便微生物群移植（FMT）是一种有效的方法，可用于明确整个微生物群或分离出的特定物种在疾病病理生理过程中的直接作用。FMT在动物研究中被广泛用于诱导或抑制某种表型。例如，通过将患病供体的粪便物质移植给健康受体，可以调节热量摄入和葡萄糖代谢5,6。在人类中，FMT已被证明是治疗复发性Clostridium difficile感染的一种安全选择7。支持其在心血管疾病管理中应用的证据正在不断出现；例如，将瘦型个体的粪便微生物群移植给代谢综合征患者可改善胰岛素敏感性8。在人类和啮齿类动物研究中，肠道菌群失....

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方案

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本手稿中描述的所有实验程序均获得范德堡大学机构动物护理和使用委员会的批准。3月龄雄性C57B1/6小鼠购自杰克逊实验室，饲养和护理均按照《实验动物护理和使用指南》进行。

1. 人类粪便样本的采集、储存与处理

  1. 采集粪便样本，若受试者在诊所内，应使用无菌容器。采集后36小时内将粪便样本置于4 °C冷藏，直至准备进行处理。或者，可使用 commercially available 工具采集粪便样本，以在常温下实现便捷且长期的DNA稳定性，尤其适用于居家采样。
  2. 使用10%次氯酸钠溶液或其他美国环境保护署（EPA）批准的消毒剂，对生物安全级通风橱进行消毒。
  3. 将粪便样本从冷藏环境中取出并移入通风橱内；使用一次性刮勺分装约1 g的等分样本，并储存于-80 °C超低温冰箱中，直至完全准备好进行处理。
  4. 将所有一次性物品丢弃至生物危害垃圾桶中。对所有表面（通风橱及操作过程中接触过的任何表面）以及从通风橱中移出的物品进行消毒。

2. 小鼠粪便样本的无菌采集

注意：使用无菌技术，包括无菌器械。

  1. 通过 CO2 窒息法处死小鼠。用 70% 乙醇喷洒小鼠胸部和侧面，小心切开皮肤和腹膜腔，....

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结果

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上述步骤总结于图1。将小鼠盲肠内容物或人粪便重悬于无菌生理盐水中，制备混悬液，通过灌胃给予无菌小鼠（100 µL），前3天连续每天一次，之后每3天一次。在实验方案结束时，采用尾套法测量血压，随后处死小鼠，并采集组织以评估肠道微生物群以及心血管和代谢相关指标的变化。

选择微生物群的关键步骤之一是确保供体具有所关注的疾病表型，并且该表型与菌群失调相关。例如，高盐饮食与菌群失调及心血管功能障碍密切相关。本研究采用了一只喂食含8% NaCl饮食的小鼠作为供体。高盐饮食引起的肠道微生物群变化包括细菌多样性降低（图2A），其微生物群聚类与正常盐摄入组明显分离（图2B）。厚壁菌门/拟杆菌门比例也有所升高（图2C），提示高盐可诱导微生物群发生改变（修改自Ferguson等12）。

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讨论

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研究肠道微生物群在心血管和代谢性疾病中因果作用的一个重要方法是将总微生物群或特定目标菌种移植到无菌小鼠体内。本文描述了从人类和普通饲养小鼠收集粪便样本并将其移植至无菌小鼠的实验方案，以研究肠道微生物群在高血压相关疾病中的作用。

在小鼠中，我们使用在厌氧环境中无菌采集的盲肠内容物；在人类中，则采集粪便样本。粪便微生物移植（FMT）可在样本仍新鲜时立即进行，也可将样本在液氮中速冻后保存于 -80 °C，待使用时取出。如果样本无法立即冷冻（例如人类在家中自行采集样本的情况），则必须使用核酸保护剂（如乙醇）进行保存。肠道中的大多数细菌为厌氧菌；在制备用于移植的粪便样本时，操作必须迅速，以避免细菌暴露于有氧环境，否则可能导致混合物中厌氧菌数量减少，从而降低移植效果27。对于纵向研究，应对所有样本同时进行宏基因组测序，以避免批次效应。用于FMT的样本可来自单个供体，也可将多个供体的样本混合后分配给不同实验组的多个受体。

在探讨机制意义之前，必须通过实验确认粪菌移植（FMT）是否成功，这一点极.......

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披露

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作者声明不存在任何利益冲突，无论是经济方面还是其他方面。

致谢

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本研究由美国国家转化科学促进中心资助，资助号为范德堡临床与转化科学奖 UL1TR002243（授予 A.K.）；美国心脏协会资助号 POST903428（授予 J.A.I.）；美国国家心肺血液研究所资助号 K01HL13049、R03HL155041、R01HL144941（授予 A.K.），以及美国国立卫生研究院资助号 1P01HL116263（授予 V.K.）。（图 1 使用 Biorender 制作。）

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Alexa Fluor 488 Tyamide SuperBoostThermoFisherB40932
厌氧培养箱COY7150220
载脂蛋白 AINovus BiologicalsNBP2-52979
动脉剪 - 球头尖端Fine Science Tools14086-09
漂白液Fisher Scientific14-412-53
牛血清白蛋白Fisher ScientificB14
CD3 抗体ThermoFisher 14-0032-82
CD68 单克隆抗体ThermoFisher14-0681-82
离心机Fisher Scientific75-004-221
CODA 高通量监测仪Kent Scientic CorporationCODA-HT8
冻存管Fisher Scientific10-500-26
一次性刻度移液管Fisher Scientific137119AM
一次性注射器Fisher Scientific14-823-2A
乙醇Fisher ScientificAA33361M1
饲喂针头Fine Science Tools18061-38
滤纸片Fisher Scientific09-802
福尔马林 (10%)Fisher Scientific23-730-581
高盐饮食TekladTD.03142
OMNIgene.GUTDNAgenotekOM-200+ACP102
渗透压微型泵Alzet MODEL 2002
PAP笔Millipore SigmaZ377821-1EA
培养皿Fisher ScientificAS4050
移液器吸头Fisher Scientific21-236-18C
移液器Fisher Scientific14-388-100
无菌磷酸盐缓冲液Fisher ScientificAAJ61196AP
智能刮勺Fisher ScientificNC0133733
粪便采集装置Fisher Scientific50-203-7255
TBS缓冲液Fisher ScientificR017R.0000
吐温X-100Millipore Sigma
9036-19-5
Varimix平台摇床Fisher Scientific09047113Q
涡旋混合器Fisher Scientific02-215-41
二甲苯Fisher Scientific1330-20-7, 100-41-4

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2021 update: a report From the American Heart Association. Circulation. 143 (8), 254(2021).
  2. Wu, H., et al. The gut microbiota in prediabetes and diabetes:....

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