Method Article

小鼠粪便分离和微生物群移植

DOI:

10.3791/64310

⸱

May 26th, 2023

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1Division of Clinical Pharmacology, Department of Medicine Vanderbilt University Medical Center and Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University, 2Division of Pediatric Nephrology Department of Pediatrics, Vanderbilt University Medical Center, 3Department of Pathology, Microbiology, and Immunology, Vanderbilt University Medical Center

In This Article

Summary

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这里的目标是概述一个方案，以研究心血管疾病中生态失调的机制。本文讨论了如何无菌收集和移植鼠粪便样本，分离肠道，并使用"Swiss-roll"方法，然后使用免疫染色技术来询问胃肠道的变化。

Abstract

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肠道微生物群失调在心血管和代谢紊乱的病理生理学中起作用，但其机制尚不清楚。粪便微生物群移植（FMT）是描述总微生物群或分离物种在疾病病理生理学中的直接作用的宝贵方法。对于复发性 艰难梭菌 感染患者来说，这是一种安全的治疗选择。临床前研究表明，操纵肠道微生物群是研究生态失调与疾病之间机制联系的有用工具。粪便微生物群移植可能有助于阐明用于管理和治疗心脏代谢疾病的新型肠道微生物群靶向疗法。尽管啮齿动物的成功率很高，但仍存在与移植相关的翻译变化。这里的目标是为研究肠道微生物组在实验性心血管疾病中的作用提供指导。在本研究中，描述了小鼠研究中粪便微生物群的收集、处理、处理和移植的详细方案。描述了人类和啮齿动物捐赠者的收集和处理步骤。最后，我们描述了使用瑞士滚动和免疫染色技术的组合来评估心血管疾病的肠道特异性形态和完整性变化以及相关的肠道微生物群机制。

Introduction

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心脏代谢紊乱，包括心脏病和中风，是全球主要死亡原因1。缺乏身体活动、营养不良、年龄增长和遗传因素调节这些疾病的病理生理学。越来越多的证据支持肠道微生物群影响心血管和代谢紊乱的概念，包括2型糖尿病2，肥胖3和高血压4，这可能是开发这些疾病新治疗方法的关键。

微生物群引起疾病的确切机制仍然未知，目前的研究差异很大，部分原因是方法学差异。粪便微生物群移植（FMT）是描述总微生物群或分离物种在疾病病理生理学中的直接作用的宝贵方法。FMT广泛用于动物研究以诱导或抑制表型。例如，热量摄入和葡萄糖代谢可以通过将粪便从生病的供体转移到健康的受体来调节5，6。在人类中，FMT 已被证明是复发性艰难梭菌感染患者的安全治疗选择7。支持其在心血管疾病管理中使用的证据正在出现;例如，从瘦到代谢综合征患者的FMT可提高胰岛素敏感性8。在人类和啮齿动物研究中，肠道生态失调也与高血压有关9，

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Protocol

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范德比尔特大学的机构动物护理和使用委员会批准了本手稿中描述的所有程序。从杰克逊实验室购买的3个月大的C57B1 / 6雄性小鼠根据实验动物护理和使用指南进行饲养和护理。

1. 人类粪便样本的收集、储存和处理

  1. 收集粪便样本，如果受试者在诊所，请使用无菌容器。在收集后36小时内将粪便样品冷藏在4°C，直到准备好处理。或者，使用市售工具收集粪便样本，以便在环境温度下轻松延长DNA稳定性，特别是对于家庭使用。
  2. 用 10% 的漂白剂溶液或其他环境保护局批准的消毒剂对生物安全级通风橱进行消毒。
  3. 将粪便从冷藏库中取出并带入通风橱;使用一次性刮刀制成~1g等分试样，并储存在-80°C冰箱中，直到完全准备好进行处理。
  4. 将所有一次性物品丢弃在生物危害垃圾箱中。对所有表面（机罩和处理器接触的任何表面）和从机罩中取出的物品进行消毒。

2.小鼠粪便样本的无菌收集

注意:使用无菌技术，包括灭菌器械。

  1. 通过CO2 窒息对小鼠实施安乐死。用70%乙醇喷洒小鼠的胸部和侧面，并小心地打开皮肤和腹膜腔以暴露胃肠道。
  2. 分离盲肠并使用无菌手术剪刀将其切成两半。简而言之，暴露盲肠，从回肠近端....

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Results

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图 1 总结了上述步骤。将小鼠盲肠内容物或人粪便重悬于无菌盐水中以制备浆液，通过管饲法给予无菌小鼠（100μL），首先连续3天，然后每3天一次。在协议结束时，通过尾袖法测量血压，对小鼠实施安乐死，并收获组织以评估肠道微生物群的变化以及心血管和代谢的变化。

选择微生物群的一个关键步骤是确保感兴趣的疾病表型存在于供体中并与生态失调变化相关。例如，高盐饮食与生态失调和心血管功能障碍密切相关。这项研究使用了喂食8%NaCl饮食的小鼠供体。肠道微生物群响应高盐的变化包括细菌生物多样性的减少（图2A），其与正常盐微生物群分开聚集（图2B）。厚壁菌/拟杆菌的比例也增加（图2C），表明高盐诱导的微生物群变化（修改自Ferguson等人12）。

为了确定高盐诱导.......

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Discussion

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研究肠道微生物群在心血管和代谢疾病中的因果作用的一种有价值的方法是将总微生物群或选择感兴趣的物种转移到无菌小鼠中。在这里，我们描述了从人类和传统饲养的小鼠收集粪便样本到无菌小鼠中的方案，以研究肠道微生物群在高血压疾病中的作用。

在小鼠中，我们使用无菌收集的盲肠内容物在需氧室中处理，而在人类中，我们收集粪便。FMT可以在样品仍然新鲜或在液氮中快速冷冻时立即进行，并保持在-80°C直至准备使用。如果样品不能立即冷冻，例如人类在家中收集样本，则使用乙醇等核酸防腐剂很重要。肠道中的大多数细菌是厌氧菌;在准备用于移植的粪便样本时，必须快速完成以避免将细菌暴露在有氧环境中，因为这可能会由于混合物中厌氧菌的量减少而降低功效27。对于纵向研究，应同时对样品进行宏基因组测序，以避免批次效应。FMT的样本可以来自一个或多个供体，这些供体汇集在一起，然后分发给实验组中的多个接受者。

在探索机制影响之前，通过实验证实FMT的成功至关重要。粪便或盲肠内容物可以通过宏基因组学和评估供体和受体之间的相似性进行.......

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Disclosures

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提交人没有声明任何利益冲突，无论是财务利益冲突还是其他利益冲突。

Acknowledgements

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这项研究得到了范德比尔特临床和转化科学奖资助UL1TR002243（又名）的支持，来自国家推进转化科学中心;美国心脏协会拨款POST903428（致J.A.I.）;国家心脏，肺和血液研究所拨款K01HL13049，R03HL155041，R01HL144941（A.K.）和NIH拨款1P01HL116263（V.K.）。 图 1 是使用 Biorender 创建的。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 488 Tyamide SuperBoostThermoFisherB40932
厌氧室COY7150220
载脂蛋白 AINovus BiologicalsNBP2-52979
动脉剪刀 - 球头精细科学工具14086-09
漂白剂溶液Fisher Scientific14-412-53
牛血清白蛋白Fisher ScientificB14
CD3 抗体ThermoFisher 14-0032-82
CD68 单克隆抗体ThermoFisher14-0681-82
离心机Fisher Scientific75-004-221
CODA 高通量监测器Kent Scientic CorporationCODA-HT8
低温样品瓶Fisher Scientific10-500-26
一次性刻度移液管Fisher科学137119AM
一次性注射器Fisher Scientific14-823-2A
乙醇Fisher ScientificAA33361M1
喂食针精细科学工具18061-38
滤纸Fisher Scientific09-802
福尔马林 （10%）Fisher Scientific23-730-581
高盐饮食TekladTD.03142
OMNIgene.GUTDNAgenotekOM-200+ACP102
渗透微型泵Alzet 型号 2002
PAP 笔Millipore SigmaZ377821-1EA
培养皿Fisher ScientificAS4050
移液器吸头Fisher Scientific21-236-18C
移液器Fisher Scientific14-388-100
Serile 磷酸盐缓冲盐水Fisher ScientificAAJ61196AP
智能刮刀Fisher ScientificNC0133733
粪便收集装置Fisher Scientific50-203-7255
TBS 缓冲液Fisher ScientificR017R.0000
Triton X-100Millipore Sigma
9036-19-5
Varimix 平台摇杆Fisher Scientific09047113Q
涡旋混合器费舍尔科学02-215-41
二甲苯费舍尔科学1330-20-7， 100-41-4

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2021 update: a report From the American Heart Association. Circulation. 143 (8), 254(2021).
  2. Wu, H., et al. The gut microbiota in prediabetes and diabetes:....

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