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子宫骶韧带悬吊大鼠模型的建立

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DOI：

10.3791/64311

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2022年8月17日

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1Department of Chemical Engineering, University of Virginia, 2Electrophysiology Division, Abbott, 3Department of Biomedical Engineering, University of Virginia, 4Department of Obstetrics and Gynecology, Division of Pelvic Medicine and Reconstructive Surgery, University of Virginia

本文内容

摘要

盆腔器官脱垂影响着全球数百万女性，但一些常见的外科手术干预措施的失败率高达40%。由于缺乏标准的动物模型来研究这一疾病，相关进展受到阻碍。我们提出以下方案，作为子宫骶韧带悬吊术及体内拉伸力学测试的模型。

摘要

盆腔器官脱垂（POP）是一种常见的盆底功能障碍（PFD），可能显著影响女性的生活质量。在美国，约有10%–20%的女性会接受盆底修复手术以治疗脱垂。仅在美国，PFD病例每年造成的总费用高达263亿美元。这一多因素疾病对生活质量产生负面影响，而近年来治疗选择却日益减少。一种常见的手术方式是子宫骶骨韧带悬吊术（USLS），通常通过将阴道穹窿固定于盆腔内的子宫骶骨韧带实现。与使用网片增强的手术相比，该修复术的并发症发生率较低，但失败率相对较高，可达40%。鉴于目前缺乏用于研究盆底功能障碍的标准动物模型，该领域迫切需要创新，尤其应致力于开发经济、可及的动物模型。在本论文中，我们描述了一种大鼠USLS模型，包括行全子宫切除术后，将残留的阴道穹窿固定至子宫骶骨韧带。该模型旨在模拟女性患者所接受的手术操作，从而可利用该模型进一步研究能够增强韧带附着机械完整性的修复策略。重要的是，我们还描述了一种 原位 用于在手术干预后的选定时间点表征界面完整性的拉伸测试程序。总体而言，该模型将为未来研究盆腔器官脱垂（POP）修复治疗方案提供一种有用的工具 通过 USLS

引言

盆腔器官脱垂（POP）是一种常见的盆底功能障碍，影响全球数百万女性，可能对女性生活的诸多方面产生显著影响，尤其是随着年龄增长1。值得注意的是，约有13%的美国女性将接受脱垂或尿失禁相关的手术治疗2。该疾病在妊娠和分娩后最为常见，其特征是盆腔器官（主要是阴道的不同区段和/或子宫）从腹膜腔内的正常位置下移。这会导致阴道膨出感或压迫感、肠道功能障碍、膀胱功能障碍、性功能障碍以及整体生活质量下降等令人困扰的症状。POP的其他危险因素包括肥胖、吸烟、慢性咳嗽和便秘3。

在健康女性中，盆底器官由肛提肌、子宫骶韧带（USLs）、主韧带、连接至盆侧壁的结缔组织以及会阴体的远端结构提供支持4,5。USLs 是子宫和阴道顶端最重要的顶端支持结构之一，因此常被用于盆腔器官脱垂（POP）的外科矫正手术中（图1）。USL 的结构支持来源于骶骨区域致密的胶原结缔组织，该组织逐渐过渡为紧密排列的平滑肌。由于这种成分梯度的存在，USL 与子宫和阴道的肌层相互交织，为盆腔器官提供稳固的支持6,7。在子宫骶韧带悬吊术（USLS）中，子宫切除术后将 USLs 固定于阴道穹窿，从而将阴道及其周围结构恢复至腹腔内的解剖位置。然而，无论经阴道或腹腔镜路径，USLS 手术在一些研究中的失败率相对较高，可达40%8,9。在一项大型多中心随机对照试验中，针对顶端腔室脱垂（如涉及 USLs）的患者，术后5年出现令人困扰的阴道膨出症状的复发率约为40%9；在同一试验中，术后5年因脱垂复发而需要再次治疗的比例约为10%。这种高失败率的机制尚未得到充分研究，但要将阴道及其周围结构恢复至解剖位置，必须将缝线置于 USL 的致密胶原结缔组织区域，而非平滑肌区域10,11。因此，较高的失败率可能是由于手术构建的阴道-USL 界面在力学和组织成分上存在不匹配，而无法实现天然宫颈-USL 连接所具有的完全整合状态所致。

治疗这些疾病的经济负担同样显著，仅美国每年在门诊护理上的支出就高达约3亿美元12，而每年用于手术的直接费用更超过10亿美元13。尽管投入了大量经济资源用于治疗这些疾病，但许多脱垂手术所引发的并发症仍令人担忧。例如，以聚丙烯网片为基础的顶端脱垂修复术（如骶骨阴道固定术）相较于自体组织修复具有更高的成功率14，但其代价是可能出现网片暴露或侵蚀等潜在并发症。仅在2008年至2010年间，美国食品药品监督管理局（FDA）就收到了近3000例与网片并发症相关的投诉。最终，FDA于2019年4月下令暂停所有用于盆腔器官脱垂（POP）的经阴道植入网片产品的生产与销售15。因此，临床上迫切需要寻找聚丙烯以外的替代材料，以及可用于测试这些材料的模型，以增强自体组织脱垂修复的效果，并相较于单纯缝线的传统技术提高手术成功率。

自2019年美国食品药品监督管理局（FDA）发布公告以来，大多数盆腔外科医生已停止在盆腔器官脱垂修复术中使用经阴道植入的网片，这促使研究人员寻求新的组织工程技术以增强自体组织修复效果16,17,18，例如使用间充质基质细胞（MSCs）9,20。随着研究重点的转移，迫切需要优化可用于新材料开发的动物模型；这一过程中的挑战在于平衡临床相关性与成本。为此，基础科学和临床研究人员迄今已采用多种动物模型研究盆腔器官脱垂，包括大鼠、小鼠、兔、绵羊、猪和非人灵长类动物19。确定最佳动物模型的过程颇具挑战性，因为人类是双足行走、无尾且分娩过程具有创伤性，与其他哺乳动物存在显著差异20。猪模型已被用于模拟机器人辅助骶骨阴道固定术21，而绵羊模型则被用于模拟经阴道脱垂修复术22。尽管这些动物模型具有较高的临床相关性，但其可行性和广泛应用受到高昂成本和维护难度的限制。非人灵长类动物已被用于研究脱垂的发病机制；其中，松鼠猴是除人类外极少数能够自发发生脱垂的物种之一，因此被认为是最具临床相关性的动物模型之一20。此外，非人灵长类动物还被用于研究妇科手术操作，如骶骨阴道固定术23和子宫移植术24。与绵羊和猪模型类似，非人灵长类动物作为脱垂研究模型的主要局限性在于饲养、护理和管理成本过高19。

尽管啮齿类动物的骨盆呈水平方向，且与人类相比其胎头与产道尺寸比例要小得多19，但大鼠适用于子宫骶韧带悬吊术（USLS）手术的小动物研究，因为其子宫骶韧带（USL）的解剖结构、细胞组成、组织学架构以及基质成分与人类USL相似25。此外，大鼠在饲养和管理方面也具有优势。尽管具备这些有利特性，目前尚无关于大鼠USLS修复模型的公开报道。因此，本研究旨在描述一种在多产Lewis大鼠中实施子宫切除术及USLS的实验方案。该方案将有助于研究人员利用这一易于获取的动物模型，开展关于盆腔器官脱垂（POP）病理生理机制及外科治疗组分的研究。

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图1：盆腔器官脱垂。（A）腹膜腔内器官的正常解剖位置，以及（B）发生脱垂时器官显著下移的情况。子宫切除术后，（C）子宫骶骨韧带悬吊术可将阴道及周围结构恢复至正常的解剖位置。请点击此处查看该图的放大版本。

方案

遵循所有机构动物照护与使用委员会（IACUC）指南，在开始实验前须获得动物实验操作的批准。无菌手术技术的相关要求可参见《动物照护与使用指南》26 以及动物福利法规27该研究已获得弗吉尼亚大学机构动物护理和使用委员会批准，方案编号为4332-11-20。获取经产（两胎）雌性繁殖鼠。大鼠应成对饲养于经美国实验动物护理评估与认证协会（AAALAC）认证的动物实验设施中，并自由供应食物和饮水 随意摄取本研究中使用的动物为购自查尔斯河实验室的Lewis大鼠，年龄介于4至6个月之间，以满足双胎次的要求。动物饲养环境保持12小时光照-12小时黑暗循环。

1. 使用子宫骶韧带悬吊术修复盆腔器官脱垂

  1. 活体动物手术的器械与手术区域准备
    1. 准备手术区域，使手术台加热至 37 °C 使用循环热水加热垫并配合无菌防水垫。采用不含漂白剂的表面消毒剂对手术板和手术区域进行消毒，随后用70%乙醇擦拭，以确保无菌状态。
    2. 使用高压灭菌器热力灭菌法对所有可高压灭菌的物品进行灭菌，包括手术器械、手术棉垫（纱布）、棉签和一次性手术单。获取无菌包装的外科手套。
    3. 准备电推剪、眼用软膏、乙醇擦拭巾、棉签和碘溶液，以及无菌包装的手术刀片和缝合线，放置于工作台。
  2. 活体动物手术的动物准备
    1. 将动物小心放入通有2%异氟烷的麻醉舱中，在达到适当麻醉深度后称量动物体重。当动物对脚趾夹捏无反应时，表明已达到合适的麻醉状态。
    2. 将动物俯卧位固定于手术板上，鼻部置于含有2%异氟烷的麻醉面罩中。在动物双眼涂抹眼用软膏。
    3. 皮下注射阿片类镇痛药和非甾体抗炎药镇痛药（NSAID）材料表).
    4. 将动物置于仰卧位，如图所示 图2，从剑突向下至尿道口剃除腹部毛发（8 cm × 4 cm）。用碘伏和酒精消毒腹部三次，以准备切口部位。
      注意：如果剃毛导致出血，需先加压止血，再使用碘伏和酒精消毒棉片进行皮肤准备。碘伏作用时间应保持30秒。
    5. 若无外科助手在场，应将无菌物品和器械放置于无菌器械盘中，包括无菌棉签、手术铺巾、纱布、手术刀片、缝线及手术标记笔（可选）。若有外科助手在场，则可省略此步骤，由助手根据步骤1.3.1提供无菌器械。
  3. 子宫切除术与骶子宫韧带悬吊术（USLS）
    1. 穿上手术衣、头套、口罩和无菌手套。用无菌巾覆盖动物，仅暴露腹部区域。
    2. 使用手术刀片沿腹白线从剑突下方至下乳线处做一长约7 cm的切口，切口末端应位于尿道外口前方约0.5–1.0 cm处。随后切开下方的肌层，注意避开腹壁血管，以防出血。
    3. 组装腹部牵开器并检查腹腔（图3A）。使用虹膜镊轻轻找到左侧子宫角。子宫位于肠管深部，进入腹腔时通常首先遇到的是肠管结构。首先辨认卵巢将有助于操作图3B）以及相关的卵巢脂肪垫。
    4. 用镊子或蚊式钳轻轻提起左侧子宫角，使用蚊式钳在卵巢和输卵管下方结扎子宫角，开始进行子宫切除术。卵巢结构 delicate，操作时容易受损或失去血供。提起子宫角时需格外小心，应钳夹距离卵巢安全的位置以实现操作。
    5. 使用显微剪刀夹住并修剪子宫角附近的血管、结缔组织和脂肪，继续进行子宫切除术。在去除组织前应先夹住结缔组织以减少出血。尽量将止血钳靠近子宫界面放置，一直到达子宫颈交界处（也称为角分叉处）。
    6. 使用蚊式钳在子宫角分叉处附近进行夹闭图4A- C）。切除夹子近头侧的同侧角，以避免出血。该位置位于子宫颈交界处（宫颈近头侧）与输卵管结扎点之间。子宫切除术后，阴道残端将保留。图4D).
      注意： 由于大鼠血管较细，使用临时夹钳夹闭子宫残端即可满足本手术要求。然而，根据需要，该技术可进行调整，改用电凝法封闭血管蒂或使用缝线结扎。
    7. 在右侧子宫角重复步骤 1.3.3-1.3.6，以完成全子宫切除术。
    8. 调整腹部拉钩以暴露下盆腔。检查暴露的阴道穹窿以及盆底支持韧带和结缔组织，这些结构可见附着于阴道和宫颈。若可能，辨认双侧输尿管，其位置位于卵巢内侧。
    9. 识别子宫骶韧带28,29，如图所示 图 5A，该韧带附着于子宫颈下方残余的子宫角残端（阴道穹隆）处，并向头侧内侧方向延伸至骶骨。
    10. 使用带小号锥形针的3-0聚二氧杂环己酮缝线，穿过左侧子宫骶韧带。缝合位置应靠近骶骨，位于韧带较高处。
    11. 牵拉缝线，确认其已缝合子宫骶韧带——该韧带结构插入宫颈，起始部延伸至直肠后方并附着于骶骨。再次辨认输尿管，确保其未被缝入子宫骶韧带缝线或发生扭曲。
    12. 然后，将左侧的聚二氧六环酮缝线穿过阴道残端的左侧部分（图5B），注意包含阴道残端的前壁和后壁。重复上述步骤，完成右侧的USLS手术。根据需要，可双侧放置多针缝线。
    13. 当双侧子宫骶骨缝线放置完毕后，使用方结牢固打结，如图所示 图5C使阴道穹窿向头侧抬高至骶骨方向；至此完成子宫骶韧带悬吊术。
  4. 缝合手术切口
    1. 将腹腔内容物复位至腹膜腔内的解剖位置。使用连续缝合方式闭合腹壁的深层结构（腹膜、筋膜、肌肉）。 4-0 到 6-0 的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（polyglactin 910）或聚二氧杂环己酮（polydiaxanone）缝线。
    2. 使用4-0至6-0的聚二氧杂环己酮或聚乙醇酸-910进行连续皮下（或间断）缝合关闭皮肤。根据需要皮下给予抗生素，以预防手术部位感染。
    3. 术后应持续监测动物，直至其恢复足够的意识以维持胸卧位。在动物完全恢复之前，不得将其放回群养环境。

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图2：活体手术的动物准备。 为确保无菌操作技术的正确实施，必须去除切口周围区域的毛发。图中（A）和（B）所示区域仅为参考。研究人员应去除足够范围的毛发，以确保手术过程中无菌器械不与毛发接触。请点击此处查看该图的放大版本。

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图3：保留卵巢。 打开腹腔后，子宫角通常不可见，如图（A）所示。一旦找到一侧子宫角并沿其追踪至（B）卵巢和输卵管与子宫角相连的部位，即可在子宫角顶端进行夹闭，并分离子宫角以开始子宫切除术。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图4：移除子宫角。 大鼠子宫切除术包括（A）双侧子宫角，（B）在子宫颈交界处夹闭，并（C）被切除。每个子宫角的阴道残端仍与（D）宫颈/子宫残端（箭头所示）相连。请点击此处查看该图的放大版本。

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图5：子宫骶骨韧带悬吊术。（A）子宫骶骨韧带相对于所构建的阴道残端结构的位置关系。在放置子宫骶骨韧带悬吊术（USLS）修复缝线时，（B）缝线首先缝合子宫骶骨韧带，然后穿过阴道残端的前壁和后壁。（C）阴道残端固定于子宫骶骨韧带后，现已向上朝向骶骨抬高。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 单轴拉伸试验

注意：测试系统和软件的使用遵循制造商提供的校准和测试指南。所有测试均在 22 °C 下进行。

  1. 样本制备
    1. 使用经IACUC批准的药理学方法处死大鼠，并确认死亡 通过 二级物理方法。此处，CO2 采用吸入麻醉后进行心脏穿刺。暴露阴道穹隆，以备进行拉伸力学测试。在本研究中，对天然子宫骶骨韧带（对照组）以及之前接受过上述子宫骶骨韧带悬吊术的动物（盆腔器官脱垂组）进行拉伸测试。
    2. 测试韧带 原位 术后24周。建议至少8周的终末时间点，以确保缝线完全被重新吸收。
      1. 在人道安乐死后，沿腹白线做切口以暴露腹腔。
      2. 开始剥离脂肪组织，直至阴道穹隆可见。继续剥离腹部脂肪垫，直至完整的子宫骶韧带（USLs）清晰可见（对照组动物， 图6A）或子宫骶骨韧带与阴道穹隆之间的连接处可见（POP 动物， 图6C）。去除脂肪组织时，注意不要牵拉连接处，而应使用显微剪进行精细剪切，以保持样本间的一致性。
      3. 使用软尺测量子宫骶骨韧带附着点（直肠后方）与阴道穹顶之间的距离。该数值即为组织的原始长度。
        注意：对照组 USL 测量的组织原始长度，即标距长度，为 13.4 ± 0.5 毫米，而USLs修复的标距测量为12.8 ± 0.4 mm
      4. 将脐带线穿过完整的USL后方（对照组， 图6B）或USLS连接处（POP， 图 6D使组织位于脐带绳中央。使用数显卡尺测量组织与脐带绳交叉处的高和宽，这些数值将用于计算横截面积。
      5. 安装一块大型加压板（材料表) 通过 将动物放置在底座适配器上，并调整位置，使样本位于夹持器正下方中央。
  2. 拉伸测试
    1. 将拉伸测试程序输入软件：预加载、预调节、拉伸至断裂。此步骤遵循先前的盆底测试方法29 和生殖组织30 机械测试方案。
    2. 设置仪器以准备进行拉伸测试。在本研究中，使用一个10 N的负荷传感器、一个3D打印的夹具以及一个基座适配器来安装压缩压板，如图所示。 图7.
      注意：任何能够支撑动物全身尺寸的固定装置均可使用。可使用任何能够牢固夹持脐带绳的夹具。此前研究中使用的定制3D打印支架和夹具31,32 在此项测试中使用了该文件。STL 文件作为补充材料提供。
      1. 将动物放置在夹具正下方，使样品居中图8A）。通过将动物固定于载物台来固定标本周围的骨盆区域（图8B).
      2. 降低负荷传感器，使脐带绳的尾端能够轻松到达夹具。将脐带绳固定在夹具中，保持绳子松弛，以避免对样本造成干扰。
    3. 在软件界面中打开预处理测试，并使用样品名称标记该测试。确保预处理方法包含预加载步骤。
    4. 单击以开始预 conditioning 测试，该测试将对样品施加 0.015 N 的预载荷。当预载荷力稳定后，以 0.1 mm/s 的拉伸速率对样品进行 30 秒的预 conditioning。随后让组织休息 1 分钟。在等待期间，加载拉伸至破坏的测试程序。
      注意：预载荷力的大小可能因仪器限制和测试条件的不同而有所变化。可参考以往研究中报道的预载荷范围，通常在 0.015 N 至 0.1 N 之间。29,33,34,35,36.
    5. 打开设定为拉伸至破坏的测试程序。使用样品名称标记测试，然后点击 好的 输入样品的标距长度，然后点击以进入下一个窗口。 下一步 转至测试页面。
    6. 平衡所有并点击 开始以0.1 mm/s的拉伸速率进行测试，直至组织断裂。该测试将生成载荷-位移数据。
  3. 拉伸试验中应力、应变和模量的计算
    1. 利用样品的载荷-位移数据、横截面积和标距，按照先前报道的方法计算应力（MPa）和应变（%）37,38,39,40,41使用 公式 1 和 公式 2 如下所示。请注意，在这些计算中还应考虑测试过程中胶带的拉伸。
      figure-protocol-5     方程 1
      figure-protocol-6     方程 2
      1. 从载荷-位移曲线（图9A，D），计算刚度（线性斜率，N/mm）和极限载荷。从应力-应变曲线中计算切线模量（线性斜率，MPa）和极限应力。应力-应变曲线的线性区域已注明在 图9B，E 该区域计算得到的切线模量如图所示 图9C，F 对于两个实验组。
        注意：对于刚度和切线模量，通过选择一个使 R 值最大化的点窗口来确定线性部分2 线性回归的值37,41.

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图6：单轴拉伸试验的样本制备。（A）暴露的对照组子宫骶韧带（USL）在（B）脐带线穿过组织后方之前的状态。（C）缝线完全溶解后的子宫骶韧带-阴道穹隆连接处，其中（B）脐带线已穿过组织后方，以备进行拉伸试验。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图7：机械测试系统。（A）用于拉伸测试模式的测试系统，配合（B）3D打印的夹具和（C）带有纹理条以增强夹持力的3D打印样品夹具。各部件的组装配置如图（D）所示。请点击此处查看该图的放大版本。

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图8：拉伸测试装置示意图。（A）试样位于夹具和支架下方中央位置。（B）在开始拉伸测试前，动物体及试样周围组织保持固定。如插图所示，固定周围组织对于分离目标组织至关重要。请点击此处查看该图的放大版本。

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图9：拉伸试验数据输出与分析示例。（A）对照样品的载荷-位移曲线，随后为（B）应力-应变分析，以及（C）直线拟合曲线的斜率，显示以MPa为单位的切线模量。（D-F）展示了USLS样品的相同分析过程。请点击此处查看该图的放大版本。

结果

手术可行性及骶子宫韧带缝合放置
在所有动物中，子宫切除术或骶子宫韧带悬吊术均未发生与手术相关的并发症。在切除子宫角时，只要预先夹闭邻近血管，出血量极少。少量出血有助于清晰显露骶子宫韧带以便进行缝合固定，并避免术中对肠管、直肠、输尿管或膀胱造成损伤。缝合完成后，新形成的骶子宫韧带-阴道穹隆连接处可有效限制宫颈/子宫残端的移动，如图5C所示。术后前三天每日对动物进行检查，之后改为每两周一次，直至实验结束。由于术中已给予缓释阿片类药物和非甾体抗炎药（NSAID）镇痛，因此无需额外使用镇痛药物。根据我们开展的16例动物手术经验（对照组和USLS组各n = 8），术后第一周体重下降属预期现象，平均较手术当天体重减少5.7 ± 1.4%。随后23周内，大鼠体重逐渐回升，整个实验期间平均增重15.1 ± 4.5%。

USLS修复的力学测试
为验证USLS修复的功能性，进行了单轴拉伸测试。在选定的术后时间点（本研究为24周）处死动物后，应仔细解剖手术区域，以暴露并观察USL-阴道穹隆连接处，如图所示。 图6A与其他测试大鼠USL及其相关支持结构和盆腔器官的方法相比29,42本研究所述方法是首次对大鼠脐韧带（USL）进行独立测试的方法。实验中选用的脐带在设计上具有良好的柔韧性，其顺应性可在拉伸测试准备过程中最大限度地减少对组织的干扰。因此，载荷-位移数据必须进行校正，以消除脐带自身轻微拉伸所带来的影响。 图9 提供了所获得数据的一个示例 通过 拉伸测试与 图9A 提供典型的应力-应变曲线示例。建议报告应力-应变数据，因为该信息经过归一化处理，且不受试样尺寸影响34 并且可以在不同研究之间进行更有效的比较。对于完整的子宫骶骨韧带（USL），我们报告了其结构特性，如最大载荷（2.9 ± 0.5 N）和刚度（0.4 ± 0.1 N/mm），以及归一化的材料特性，如极限应力（2.1 ± 0.4 MPa）、极限应变（1.6 ± 0.5）和切线模量（4.0 ± 1.1 MPa）。Moalli 等人在对大鼠生殖器官及其所有支持组织连接进行的单轴拉伸试验中，报告了更高的断裂时最大载荷（13.2 ± 1.1 N）和刚度（2.9 ± 0.9 N/mm），高于单独的 USL。29Moalli 等人的研究及其他相关文献的工作34,35 如本文所展示的数据所示，不同检测样本之间存在较高的变异性。对于子宫骶韧带悬吊修复术，我们发现所有结构材料特性（刚度，0.33 ± 0.13 N/mm；极限载荷，2.6 ± 1.3 N）以及归一化材料特性（极限应力，1.8 ± 0.7 MPa；极限应变，1.3 ± 0.3；切线模量，3.0 ± 0.9 MPa）均低于天然USL。

讨论

该方案具有多项优势。据我们所知，这是首次在大鼠模型中发表的关于无张力吊带悬吊术（USLS）的描述，将为今后的研究人员在科研环境中重复实施该手术提供可复现的操作步骤。其次，我们引入了一种针对子宫骶韧带（USL）天然组织及手术界面进行拉伸力学测试的创新性方案。该拉伸测试方法可应用于类似研究，用于评估旨在增强天然组织修复（如USLS）的新型组织工程策略。此外，与其他大型动物模型相比，大鼠模型本身具有易于操作与饲养、生命周期短以及成本效益高等优点，因此适用于盆底功能障碍的研究。本方案的局限性在于无法评估USLS的主要并发症之一——输尿管扭曲。尽管如此，本研究中未出现任何疑似输尿管损伤的病例。另一个需考虑的因素是，由于大鼠骨盆呈水平方向、胎儿头部与产道比例较小，且不会自发发生器官脱垂，这些特点在一定程度上限制了研究结果向人类的外推性。然而，本研究采用经产大鼠是一大优势，因为这模拟了盆腔器官脱垂（POP）发生中最主要的危险因素3。

在Lewis大鼠中建立成功的子宫切除术及子宫骶韧带悬吊术（USLS）方案，将为未来研究盆腔器官脱垂（POP）外科相关机制的研究人员提供一种有效工具，同时有助于减少在评估子宫骶韧带（USL）力学行为时的实验变异性。手术动物模型的优势在于，可使研究人员设计出具有临床相关性的实验，并对胎次、体质量、疾病状态及营养状况等变量进行有效控制。34 同时降低在人体中开展初步研究的伦理风险。此外，盆腔器官脱垂（POP）的标准化模型可使研究人员规避人体组织采集的局限性。特别是，本方案中所述的拉伸测试方法将有助于不同研究之间的结果一致性。既往啮齿类动物模型检测的是整个盆腔区域的力学特性，该区域包括宫颈、阴道及多个盆腔支持韧带。29,42所述方法可用于测量子宫骶韧带（USL），同时保持其在脊柱和宫颈的天然附着。需要注意的是，拉伸测试方法并非单独评估USL，而是评估USL与其在骶骨和宫颈附着部位的综合力学性能。这一特点增强了研究的临床相关性，因其更真实地反映了USL在体内的实际功能状态。 原位 韧带所承受的力。我们承认，如果对离体韧带进行测试，其力学行为将与在体情况下有所不同 离体 没有其天然附着结构。这种情况尤为明显，因为大鼠的结构较小，限制了采集适合样本的可行性 离体 测试。USLs 确实会受到多方向的负荷作用 原位，因此该测试的单轴特性是一个局限性，但使用此方法可实现与以往研究之间的有意义比较 大鼠USL力学研究29,42尽管目前尚无广泛认可的标准机械测试方案，但该模型将成为未来该领域组织工程研究的有用工具。

本方案中描述的多个步骤对于动物的健康与福利，以及USLS手术和后续拉伸测试的可重复性至关重要。首先，必须同时使用所述的镇痛药和抗炎药物，因为单独使用镇痛药被发现不足以有效控制疼痛。预防性使用抗生素可降低手术部位感染的风险，这也是人类外科手术中的标准护理措施。关于USLS手术操作，避免损伤卵巢并尽量减少出血是手术成功的关键。步骤1.3.3和1.3.4描述了将子宫角顶端与相邻卵巢分离的过程；分离时应确保在子宫角一侧进行，以避免破坏卵巢周围细小的血管，否则可能导致大量出血。值得注意的是，其他研究者已证实，在切除子宫角后卵巢功能仍可得以保留43。此外，若卵巢受到损伤或被切除，整体胶原纤维结构将被扰乱，从而改变组织的力学特性44,45。一旦子宫角安全地与卵巢分离，即可观察到清晰的解剖平面，便于将子宫角从周围的脂肪组织和血管中分离出来。尽管存在清晰的解剖平面，在使用显微剪刀横断之前，仍应使用钳夹固定子宫角沿途的血管蒂。与人类外科手术实践不同的是，我们发现结扎子宫切除血管蒂并非必要，因为在横断前夹闭血管蒂即可实现充分的止血。本方案的步骤1.3.6详细描述了这一旨在尽量减少出血的谨慎操作过程。在进行子宫切除术时，应特别注意识别输尿管，如步骤1.3.6和1.3.8所述。了解输尿管的解剖位置邻近关系至关重要，因为在人类USL手术中，最常见的并发症之一即为输尿管损伤46。

综上所述，我们提出了一种在大鼠模型中进行子宫切除术、子宫骶骨韧带悬吊术及子宫骶骨韧带（USL）拉伸强度测试的新型实验方案。我们预期，本研究将通过提供这些操作步骤清晰且可重复的描述，为今后的基础科学研究人员提供帮助，从而推动盆腔器官脱垂研究的进展。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢Silvia Blemker教授提供Instron设备的使用，感谢George Christ教授提供手术空间以及3D打印支架和夹具的使用。本工作由弗吉尼亚大学-科尔特转化研究合作伙伴计划（UVA-Coulter Translational Research Partnership）和美国国防部（DoD，项目编号：W81XWH-19-1-0157）资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
酒精消毒片BD326895
人工泪液软膏American Health Service Sales CorpPH-PARALUBE-O
Bluehill 软件InstronBluehill 3
Cavicide 1 消毒剂Fisher Scientific22 998 800
压缩平板Instron2501-163
棉签Puritan Medical806-WC
纱布海绵，8 层VWR95038-728
蚊式止血钳Medline IndustriesMMDS1222115
持针器Medline IndustriesDYND04045
手术剪，5½"，锐头American Health Service Sales Corp4-222
阿片类镇痛药（长效布托啡诺）Fidelis Animal HealthEthiqa XR0.65 mg/kg SC Q72
非甾体抗炎镇痛药（长效美洛昔康）Wildlife Pharmaceuticals, LLCMeloxicam SR1 mg/kg SC q72
PDS II，3-0 聚二氧杂环己酮缝线，SH-1EthiconZ316H
PDS II，5-0 聚二氧杂环己酮缝线，RB-1EthiconZ303H
牵开器Medline IndustriesMDS1862107
手术刀片，不锈钢，#10Miltex4-310
手术刀柄Medline IndustriesMDS15210
显微剪，弯型，4.5"WestcottMDS0910311
单立柱万能材料试验系统Instron5943 S38731 kN 力量容量，10 N 负荷传感器
无菌天然橡胶乳胶手套Accutech91225075
缝线，Vicryl，6-0，P-3EthiconJ492G
脐带夹带，棉质，1/8×18"EthiconU10T
拉伸与压缩负荷传感器Instron2530-10N10 N 负荷传感器（1 kgf，2 lbf）
兽用外科粘合剂（皮肤胶）Covetrus31477

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