本方案演示了在斑马鱼幼体模型中将脂多糖微量注射到脑室区域，以研究由此引发的神经炎症反应和神经毒性。
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摘要
摘要
神经炎症是包括神经退行性疾病在内的多种神经系统疾病中的关键因素。因此，研究和开发替代性的体内神经炎症模型以深入了解神经炎症在神经退行过程中的作用具有重要意义。本研究建立并验证了一种通过脑室微量注射脂多糖（LPS）诱导免疫反应和神经毒性的幼年斑马鱼神经炎症模型。采用转基因斑马鱼品系 elavl3:mCherry、ETvmat2:GFP 和 mpo:EGFP，结合荧光强度分析，通过活体荧光成像实时定量评估脑内神经元的存活情况。斑马鱼幼虫的运动行为由视频追踪记录仪自动记录。检测一氧化氮（NO）含量以及白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1β（IL-1β）和人肿瘤坏死因子α（TNF-α）等炎症细胞因子的mRNA表达水平，以评估LPS在斑马鱼幼体头部诱导的免疫反应。在脑室内注射LPS后24小时，观察到斑马鱼幼体出现神经元丢失和运动功能障碍。此外，LPS诱导的神经炎症增加了受精后6天（dpf）斑马鱼幼体头部NO的释放以及IL-6、IL-1β和TNF-α的mRNA表达水平，并导致中性粒细胞向斑马鱼脑部募集。本研究确定，在5 dpf时以2.5–5 mg/mL浓度注射LPS为该药理学神经炎症检测的最佳条件。本方案提供了一种新型、快速且高效的LPS脑室微量注射方法，用于在斑马鱼幼体中诱导LPS介导的神经炎症和神经毒性，适用于神经炎症相关研究，也可作为高通量的体内药物筛选模型。
引言
神经炎症被认为是参与中枢神经系统（CNS）多种神经退行性疾病发病机制的关键抗神经发生因子1。在病理损伤发生后，神经炎症可能导致多种不良后果，包括抑制神经发生以及诱导神经元细胞死亡2,3。在炎症反应的进程中，多种炎症性细胞因子（如TNF-α、IL-1β和IL-6）被分泌到细胞外空间，作为神经元死亡和神经发生受抑的关键组分发挥作用4,5,6。
将炎症介质（如 IL-1β、L-精氨酸和内毒素）微量注射入脑内可导致神经元细胞减少和神经炎症7,8,9。脂多糖（LPS，图1）是革兰氏阴性菌细胞壁中存在的致病性内毒素，可诱导神经炎症，加重神经退行性病变，并减少动物体内的神经发生10。将LPS直接注射到小鼠脑的中枢神经系统（CNS）后，一氧化氮、促炎性细....
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方案
AB野生型斑马鱼及转基因斑马鱼品系 elavl3:mCherry、ETvmat2:GFP 和 mpo:EGFP 均由中国医药科学研究院（ICMS）提供。动物实验已获得澳门大学动物研究伦理委员会的伦理批准（批准号：UMARE-030-2017），实验方案遵循机构动物护理指南。
1. 斑马鱼胚胎和幼体的饲养管理
- 通过自然成对交配方式获得斑马鱼胚胎（每次交配产生200–300枚胚胎），方法如先前报道28。
- 制备卵水（E3）培养基储备液（60×）：将34.8 g NaCl、1.6 g KCl、5.8 g CaCl2·2H2O 和9.78 g MgCl2·6H2O 溶解于ddH2O中，定容至2 L，用NaOH和HCl调节pH至7.2。使用时将储备液用ddH2O稀释60倍，得到工作浓度的E3培养基（1×）。不使用时在28.5 °C保存。
- 使用塑料移液管将斑马鱼胚胎转移至含有E3培养基的培养皿中。将胚胎置于28.5 °C培养箱中培养，并监测其发育情况和健康状态。每日移除死亡胚胎，并更换为新鲜的E3培养基。
- 进行斑马鱼成像实验时，使用塑料移液管收集受精后0–2小时（hpf）的胚胎（约200枚卵），置....
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结果
本文所述的工作流程提供了一种新的、快速且高效的方法，用于在斑马鱼幼鱼中诱导脂多糖（LPS）介导的神经炎症和神经毒性。在本方案中，使用微量注射器将5日龄斑马鱼幼鱼的脑室注射LPS（图1）（图2A-C）。通过1%伊文思蓝染色验证是否成功将物质注射至脑室部位（图2D）。使用注射器将斑马鱼头部与眼睛及身体分离（图2E），以排除斑马鱼身体部分的炎症细胞因子表达和一氧化氮释放对脑部神经炎症和神经毒性检测结果的干扰。
向斑马鱼脑室区域注射与LPS相同体积的PBS，作为假手术对照。在特定位于中缝核前群（Ra）的神经元（图3A-C）、脑神经元荧光积分密度（
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讨论
越来越多的流行病学和实验数据表明，慢性细菌和病毒感染可能是神经退行性疾病的潜在风险因素36。感染会触发炎症过程及宿主免疫反应的激活37。即使该反应作为一种防御机制存在，过度激活的炎症仍会对神经发生产生不利影响，且炎症环境不利于新生神经元的存活38。因此，其会导致宿主神经元功能和存活能力的损害。研究表明，炎症在神经退行性病变的病理生理过程中发挥着重要作用39。
作为一种被广泛研究的致病性内毒素，LPS 被认为可抑制神经发生并促进神经退行性变。LPS 激活炎症反应会显著损害神经发生，部分机制是通过产生一氧化氮（NO）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-1β（IL-1β）实现的40。越来越多的证据表明，在神经退行性疾病啮齿类动物模型中，中枢注射 LPS 可导致行为缺陷和神经元丢失，并影响神经发生的进程
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
本研究由澳门特别行政区科学技术发展基金（FDCT）（资助编号：FDCT0058/2019/A1 和 0016/2019/AKP）、澳门大学研究委员会（MYRG2020-00183-ICMS 和 CPG2022-00023-ICMS）以及国家自然科学基金（编号：81803398）提供资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 琼脂糖 | Sigma-Aldrich | A6361 | |
| 低凝胶温度琼脂糖 | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Drummond Nanoject III 可编程纳升级注射仪 | Drummond Scientific | 3-000-207 | |
| 荧光体视显微镜 | Leica | M205 FA | |
| GraphPad Prism 软件 | GraphPad Software | Ver. 7.04 | |
| 大肠杆菌 O111:B4 脂多糖 | Sigma-Aldrich | L3024 | |
| 手动显微操作器 | World Precision Instruments | M3301 | |
| 矿物油 | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| Mx3005P qPCR 系统 | Agilent Technologies | Mx3005P | |
| Nanovue plus 分光光度计 | Biochrom | 80-2140-46 | |
| 亚硝酸盐浓度检测试剂盒 | 碧云天生物技术 | S0021M | |
| 磷酸盐缓冲液 | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| 可编程水平拉针仪 | World Precision Instruments | PMP-102 | |
| PTU（N-苯基硫脲） | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| 随机引物 | Takara | 3802 | |
| SuperScript II 逆转录酶 | Invitrogen | 18064014 | |
| SYBR Premix Ex Taq II 试剂盒 | Accurate Biology | AG11701 | |
| 第三代 Tgrinder 组织研磨仪 | Tiangen | OSE-Y30 | |
| 带纤维的薄壁玻璃毛细管（4”），外径 1.5 mm | World Precision Instruments | TW150F-4 | |
| 三卡因（3-氨基苯甲酸乙酯） | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
| TRNzol Universal 总RNA提取试剂 | Tiangen | DP424 | |
| 斑马鱼行为追踪箱 | ViewPoint Behavior Technology |
参考文献
- Xanthos, D. N., Sandkuhler, J. Neurogenic neuroinflammation: inflammatory CNS reactions in response to neuronal activity. Nature Reviews Neuroscience. 15 (1), 43-53 (2014).
- Fan, L. W., Pang, Y.
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