向幼年斑马鱼脑室微量注射脂多糖以评估神经炎症与神经毒性

摘要

本方案演示了在斑马鱼幼体模型中将脂多糖微量注射到脑室区域，以研究由此引发的神经炎症反应和神经毒性。

摘要

神经炎症是包括神经退行性疾病在内的多种神经系统疾病中的关键因素。因此，研究和开发替代性的体内神经炎症模型以深入了解神经炎症在神经退行过程中的作用具有重要意义。本研究建立并验证了一种通过脑室微量注射脂多糖（LPS）诱导免疫反应和神经毒性的幼年斑马鱼神经炎症模型。采用转基因斑马鱼品系 elavl3:mCherry、ETvmat2:GFP 和 mpo:EGFP，结合荧光强度分析，通过活体荧光成像实时定量评估脑内神经元的存活情况。斑马鱼幼虫的运动行为由视频追踪记录仪自动记录。检测一氧化氮（NO）含量以及白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1β（IL-1β）和人肿瘤坏死因子α（TNF-α）等炎症细胞因子的mRNA表达水平，以评估LPS在斑马鱼幼体头部诱导的免疫反应。在脑室内注射LPS后24小时，观察到斑马鱼幼体出现神经元丢失和运动功能障碍。此外，LPS诱导的神经炎症增加了受精后6天（dpf）斑马鱼幼体头部NO的释放以及IL-6、IL-1β和TNF-α的mRNA表达水平，并导致中性粒细胞向斑马鱼脑部募集。本研究确定，在5 dpf时以2.5–5 mg/mL浓度注射LPS为该药理学神经炎症检测的最佳条件。本方案提供了一种新型、快速且高效的LPS脑室微量注射方法，用于在斑马鱼幼体中诱导LPS介导的神经炎症和神经毒性，适用于神经炎症相关研究，也可作为高通量的体内药物筛选模型。

引言

神经炎症被认为是参与中枢神经系统（CNS）多种神经退行性疾病发病机制的关键抗神经发生因子¹。在病理损伤发生后，神经炎症可能导致多种不良后果，包括抑制神经发生以及诱导神经元细胞死亡^2,3。在炎症反应的进程中，多种炎症性细胞因子（如TNF-α、IL-1β和IL-6）被分泌到细胞外空间，作为神经元死亡和神经发生受抑的关键组分发挥作用^4,5,6。

将炎症介质（如 IL-1β、L-精氨酸和内毒素）微量注射入脑内可导致神经元细胞减少和神经炎症^7,8,9。脂多糖（LPS，图1）是革兰氏阴性菌细胞壁中存在的致病性内毒素，可诱导神经炎症，加重神经退行性病变，并减少动物体内的神经发生¹⁰。将LPS直接注射到小鼠脑的中枢神经系统（CNS）后，一氧化氮、促炎性细胞因子及其他调节因子的水平升高¹¹。此外，通过立体定位将LPS注射至局部脑环境可诱导神经毒性分子的过度产生，导致神经元功能受损，并继而促进神经退行性疾病的发展^{10,12,13,14,15}。在神经科学领域，对活体生物中细胞和生物学过程进行实时、时间序列的显微观察，对于理解发病机制和药理作用机制至关重要¹⁶。然而，对神经炎症和神经毒性小鼠模型进行活体成像时，显微镜有限的光学穿透深度从根本上限制了功能成像以及对发育过程的实时观察^17,18,19。因此，开发替代性的神经炎症模型具有重要意义，有助于通过活体成像手段研究病理发展过程，以及神经炎症与神经退行性病变的潜在机制。

斑马鱼（斑马鱼由于其进化上保守的先天免疫系统、光学透明性、较大的产卵量、易于进行遗传操作以及适用于研究神经炎症和神经退行性变的特性，斑马鱼（Danio rerio）已成为一个有前景的研究模型。 体内 成像^{19,20,21,22,23}先前的实验方案要么直接将LPS注射到幼年斑马鱼的卵黄和后脑室中，但未进行机制评估，要么只是将LPS添加到养鱼水（培养基）中以诱导致命的全身免疫反应^24,25,26,27在此，我们建立了一种将脂多糖（LPS）显微注射至受精后5天（dpf）斑马鱼幼鱼脑室的实验方案，以诱导其产生先天性免疫反应或神经毒性。注射后24小时，可观察到斑马鱼大脑中出现神经元细胞丢失、运动行为障碍、一氧化氮释放增加、炎症相关基因表达激活以及中性粒细胞募集等现象，证实了该反应的发生。

方案

AB野生型斑马鱼及转基因斑马鱼品系 elavl3:mCherry、ETvmat2:GFP 和 mpo:EGFP 均由中国医药科学研究院（ICMS）提供。动物实验已获得澳门大学动物研究伦理委员会的伦理批准（批准号：UMARE-030-2017），实验方案遵循机构动物护理指南。

1. 斑马鱼胚胎和幼体的饲养管理

1. 通过自然成对交配方式获得斑马鱼胚胎（每次交配产生200–300枚胚胎），方法如先前报道²⁸。
2. 制备卵水（E3）培养基储备液（60×）：将34.8 g NaCl、1.6 g KCl、5.8 g CaCl₂·2H₂O 和9.78 g MgCl₂·6H₂O 溶解于ddH₂O中，定容至2 L，用NaOH和HCl调节pH至7.2。使用时将储备液用ddH₂O稀释60倍，得到工作浓度的E3培养基（1×）。不使用时在28.5 °C保存。
3. 使用塑料移液管将斑马鱼胚胎转移至含有E3培养基的培养皿中。将胚胎置于28.5 °C培养箱中培养，并监测其发育情况和健康状态。每日移除死亡胚胎，并更换为新鲜的E3培养基。
4. 进行斑马鱼成像实验时，使用塑料移液管收集受精后0–2小时（hpf）的胚胎（约200枚卵），置于约15 mL含0.003% N-苯硫脲（PTU）的1× E3培养基中。
   注意：PTU可在胚胎发育过程中抑制黑色素细胞的形成²⁹。在胚胎发育期间使用PTU处理胚胎，可提高显微镜下信号检测灵敏度或荧光表达效果³⁰。
5. 在上述条件下继续培养斑马鱼胚胎，直至其发育至所需的目标幼虫阶段。

2. 显微注射的准备工作

1. 使用显微注射针拉制仪（见材料表）按照玻璃毛细管拉制的五步程序（表1）制备注射用玻璃毛细管。
2. 使用镊子以一定角度将注射针尖端（带内丝的薄壁玻璃毛细管[3.5英寸]，外径1.14 mm）打开至合适大小（图2A）。
3. 向针内注入0.1 mL矿物油，确保无气泡存在。
4. 取下显微注射装置钢针上的螺帽，将玻璃针的孔与钢针对齐后拧紧螺帽。将装好针的显微注射装置固定在显微操作仪上（见材料表）。
5. 调整显微注射装置的位置，使显微操作仪可在显微镜下灵活移动装置。排出一定体积的石蜡油，使钢针进入毛细玻璃管内。
6. 将注射溶液（如1× PBS或5 mg/mL LPS）滴加在经70%乙醇灭菌的载玻片上，并调节显微注射装置，使针尖插入液滴中，吸入约2 µL注射溶液至针内。
7. 设置显微操作仪（上下左右微调参数），使显微注射装置的针尖与幼虫在高倍镜下处于同一视野中（图2B）。

3. 斑马鱼显微注射的固定

注意：斑马鱼大脑发育在受精后3天内完成，并在受精后5天（5 dpf）时成熟，具有发育良好的中枢神经系统^31,32。因此，5 dpf的幼鱼已适用于研究脂多糖（LPS）介导的神经损伤以及行为和炎症反应。

1. 在斑马鱼幼鱼达到目标发育阶段后约30分钟内进行注射，以保持注射时间的一致性。
2. 为麻醉斑马鱼幼鱼，将三卡因与洁净的鱼缸水混合（终浓度为0.02% w/v 三卡因）。
3. 使用微波炉融化2%琼脂糖的ddH₂O溶液。将熔化的琼脂糖倒入塑料培养皿中。涂有2%琼脂糖的塑料培养皿可在4 °C保存长达2周。
4. 使用塑料移液管将麻醉后的幼鱼转移至涂有2%琼脂糖的塑料培养皿中央。将固定好的幼鱼调整为脑部朝上，以便针头进入。

4. 脑室注射

1. 调节显微镜放大倍数，使斑马鱼脑室结构在视野中清晰可见（图2B）。
2. 使用显微操作器将注射针小心地置于视顶盖上方（图2C）。
3. 使用显微操作器缓慢用针尖刺破斑马鱼脑部皮肤。
4. 踩下脚踏开关，注入1 nL的1×PBS或不同浓度的LPS（1.0、2.5和5.0 mg/mL）（参见材料表）。成功注射至脑室的示例图像显示了向脑室注射1 nL 1%伊文思蓝染料（溶于PBS）的结果（图2D）。注射后立即将幼鱼转移至洁净的E3培养基中。24小时后，收集幼鱼用于显微成像、运动行为检测及其他指标测定。

5. 成像

1. 在E3培养基中配制1.5%低熔点琼脂糖溶液，并用微波炉加热至完全溶解，形成澄清液体。
2. 使用洁净的塑料移液管将幼鱼转移至载玻片上，并尽可能吸除多余水分。
3. 用塑料移液管向幼鱼滴加一滴1.5%低熔点琼脂糖。
   注意：滴加前需将含有低熔点琼脂糖的移液管静置冷却一段时间，以免烫伤幼鱼。
4. 使用1 mL注射器针头调整幼鱼体位。待琼脂糖冷却凝固后，再开始成像。
5. 在荧光体视显微镜下观察并拍摄Tg(ETvmat2:EGFP)和Tg(elavl3:mCherry)斑马鱼全脑中的神经元区域，以及Tg(mpo:EGFP)斑马鱼脑内中性粒细胞的募集情况（参见材料表）。
   注意：成像所用荧光显微镜参数如下：Tg(ETvmat2:EGFP)斑马鱼脑（激发波长：450–490 nm，发射波长：500–550 nm，视觉放大倍数：100×）；Tg(elavl3:mCherry)斑马鱼脑（激发波长：541–551 nm，发射波长：590 nm，视觉放大倍数：100×）；Tg(mpo:EFGP)斑马鱼脑（激发波长：450–490 nm，发射波长：500–550 nm，视觉放大倍数：63×）。
6. 使用ImageJ软件测量并分析Tg(ETvmat2:EGFP)斑马鱼中Ra神经元区域的荧光强度和长度，以及Tg(elavl3:mCherry)斑马鱼脑神经元的荧光强度。人工计数Tg(mpo:EFGP)斑马鱼脑区的中性粒细胞数量。

6. 基因表达标志物的测定

1. 在LPS脑室内注射后24小时，进行基因表达标志物的检测。为此，使用0.02%三卡因对斑马鱼幼体进行麻醉（如步骤3.2所述）。
2. 使用两个1 mL注射器分离幼体的头部组织（每组40条幼体），去除眼部和卵黄囊区域（图2E）。
3. 从幼体头部组织中提取RNA。
   1. 进行RNA提取时，使用组织研磨器（见材料表）在200 µL RNA提取试剂（见材料表）中以11,000 rpm的转速匀浆头部组织5秒。
   2. 采用氯仿-异丙醇法进行RNA提取。加入40 µL氯仿，剧烈振荡试管，并在室温下孵育10分钟。在4 °C条件下以12,000 × g离心15分钟。
   3. 将水相转移至新管（约100 µL），加入100 µL异丙醇。孵育10分钟后，在4 °C条件下以12,000 × g离心10分钟。弃去上清液。
   4. 加入200 µL 75%乙醇洗涤RNA沉淀。短暂涡旋混匀后，在4 °C条件下以7,500 × g离心5分钟。弃去上清液，并再次洗涤RNA沉淀。
   5. 将RNA沉淀空气干燥5–10分钟，然后加入30 µL无RNase的水以溶解RNA沉淀。使用微量分光光度计（见材料表）检测RNA的纯度（260 nm与280 nm吸光度比值）和完整性。
4. 使用逆转录酶和随机引物（见材料表），对步骤6.3中提取的RNA进行cDNA合成。
   1. 在无核酸酶的离心管中加入1 µL随机引物、1 µL dNTPs、1 µg RNA以及去离子水（总体积至12 µL）。将混合物在65 °C加热5分钟，然后迅速置于冰上冷却。
   2. 向管中加入1 µL 0.1 M DTT、1 µL RNase抑制剂、4 µL 5×第一链缓冲液和1 µL M-MLV逆转录酶（总体积：20 µL）。轻轻混匀后，先在25 °C孵育2分钟，再于42 °C孵育50分钟。最后在70 °C加热15分钟以终止反应。
5. 使用商用RT-qPCR试剂盒（见材料表）在qPCR系统（见材料表）上进行实时PCR，检测目标基因（IL-1β、IL-6和TNF-α）的表达水平。反应体系（20 µL）包含10 µL SYBR Green、0.4 µL ROX参比染料、正向和反向引物各0.8 µL、6 µL ddH₂O以及2 µL模板cDNA（1 µg）。PCR扩增条件为：95 °C预变性30秒，随后进行40个循环（95 °C变性5秒，60 °C退火34秒），最后进行解离曲线分析（95 °C 15秒，60 °C 60秒，95 °C 15秒）。
6. 将目标基因的mRNA水平相对于看家基因延伸因子1α（Ef1α）进行归一化处理，并采用2−ΔΔCT法计算各目标基因的表达水平³³。各基因的引物序列见表2。
7. 为测定一氧化氮水平，使用组织研磨器将步骤6.2获得的头部组织在100 µL冷PBS中匀浆。将所得PBS与头部组织悬液在4 °C条件下以12,000 × g离心15分钟。收集裂解液，并使用商用试剂盒（见材料表）进行亚硝酸盐浓度测定³⁴。

7. 斑马鱼运动行为检测

1. 在脑室内注射LPS后24小时，将斑马鱼幼鱼 individually 转移至96孔方形微孔板的各个孔中。每孔加入300 µL E3培养基，随后孵育幼鱼4小时，使其适应检测用微孔板环境。
2. 将载有幼鱼的微孔板转移至斑马鱼行为追踪箱（见材料表）。打开光源，随后将幼鱼在检测箱中孵育30分钟，以适应环境。
3. 使用自动视频追踪系统监测并记录斑马鱼的行为。对每条斑马鱼记录12个时段（每个时段5分钟，共1小时）。将总移动距离（包括静止、小距离和大距离移动）定义为每条鱼在60分钟追踪期间所移动的总距离（单位：mm）。

8. 统计分析

1. 使用标准分析软件进行统计分析（参见材料表）。
2. 采用普通单因素方差分析（one-way ANOVA）对两组之间的差异进行统计分析。计算 Pearson 相关系数以评估相关性的强度。所有分析中，P < 0.05 被认为具有显著性。

结果

本文所述的工作流程提供了一种新的、快速且高效的方法，用于在斑马鱼幼鱼中诱导脂多糖（LPS）介导的神经炎症和神经毒性。在本方案中，使用微量注射器将5日龄斑马鱼幼鱼的脑室注射LPS（图1）（图2A-C）。通过1%伊文思蓝染色确认LPS成功注射至脑室部位（图2D）。使用注射器将斑马鱼头部与眼睛及身体分离（图2E），以排除斑马鱼身体部分炎症性细胞因子表达和一氧化氮释放对脑部神经炎症和神经毒性检测结果的干扰。

向斑马鱼脑室区域注射与LPS相同体积的PBS，作为假手术对照。在特定位于中缝核前群（Ra）的神经元（图3A-C）、脑神经元荧光积分密度（

讨论

越来越多的流行病学和实验数据表明，慢性细菌和病毒感染可能是神经退行性疾病的潜在风险因素³⁶。感染会触发炎症过程及宿主免疫反应的激活³⁷。即使该反应作为一种防御机制存在，过度激活的炎症仍会对神经发生产生不利影响，且炎症环境不利于新生神经元的存活³⁸。因此，其会导致宿主神经元功能和存活能力的损害。研究表明，炎症在神经退行性病变的病理生理过程中发挥着重要作用³⁹。

作为一种被广泛研究的致病性内毒素，LPS 被认为可抑制神经发生并促进神经退行性变。LPS 激活炎症反应会显著损害神经发生，部分机制是通过产生一氧化氮（NO）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-1β（IL-1β）实现的⁴⁰。越来越多的证据表明，在神经退行性疾病啮齿类动物模型中，中枢注射 LPS 可导致行为缺陷和神经元丢失，并影响神经发生的进程

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂糖	Sigma-Aldrich	A6361
低凝胶温度琼脂糖	Sigma-Aldrich	A9414
Drummond Nanoject III 可编程纳升级注射仪	Drummond Scientific	3-000-207
荧光体视显微镜	Leica	M205 FA
GraphPad Prism 软件	GraphPad Software	Ver. 7.04
大肠杆菌 O111:B4 脂多糖	Sigma-Aldrich	L3024
手动显微操作器	World Precision Instruments	M3301
矿物油	Sigma-Aldrich	M5904
Mx3005P qPCR 系统	Agilent Technologies	Mx3005P
Nanovue plus 分光光度计	Biochrom	80-2140-46
亚硝酸盐浓度检测试剂盒	碧云天生物技术	S0021M
磷酸盐缓冲液	Sigma-Aldrich	P4417
可编程水平拉针仪	World Precision Instruments	PMP-102
PTU（N-苯基硫脲）	Sigma-Aldrich	P7629
随机引物	Takara	3802
SuperScript II 逆转录酶	Invitrogen	18064014
SYBR Premix Ex Taq II 试剂盒	Accurate Biology	AG11701
第三代 Tgrinder 组织研磨仪	Tiangen	OSE-Y30
带纤维的薄壁玻璃毛细管（4”），外径 1.5 mm	World Precision Instruments	TW150F-4
三卡因（3-氨基苯甲酸乙酯）	Sigma-Aldrich	A-5040
TRNzol Universal 总RNA提取试剂	Tiangen	DP424
斑马鱼行为追踪箱	ViewPoint Behavior Technology