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方法文章

自动图像处理确定河流大型无脊椎动物群落大小结构

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DOI：

10.3791/64320

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2023年1月13日

 ,  ,  , 
1Center for the Study of Mediterranean Rivers (CERM), Universitat de Vic - Universitat Central de Catalunya, 2Laboratoire Evolution et Diversité Biologique (EDB), UMR5174, Université Toulouse 3 Paul Sabatier, Centre national de la recherche scientifique (CNRS), Institut de Recherche pour le Développement (IRD), 3Department of Marine Biology and Oceanography, Institut de Ciències del Mar, Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), 4Aquatic Ecology Group, Universitat de Vic - Universitat Central de Catalunya

本文内容

摘要

本文基于一种改进的实验方案，通过半自动成像方法对与底栖河流大型无脊椎动物相对应的数字化物体进行扫描、检测、分类和识别。该方法可在约1小时内获取大型无脊椎动物群落的个体大小分布及大小参数。

摘要

体型是一个重要的功能性状，可作为生物指示剂用于评估自然群落中干扰的影响。群落的体型结构会对生物和非生物梯度产生响应，包括跨分类群和生态系统的人为干扰。然而，对小型生物（如底栖大型无脊椎动物，其体长通常为>500 µm至数厘米）进行人工测量十分耗时。为了加快群落体型结构的估算速度，本文建立了一种半自动测量保存的河流大型无脊椎动物个体体型的实验方案，这类生物是评估淡水生态系统生态状况最常用的生物指示剂之一。本方案改编自一种已有的方法，该方法原本用于通过专为水样设计的扫描系统对海洋中型浮游动物进行扫描。本方案包括三个主要步骤：（1）扫描河流大型无脊椎动物的子样本（细粒级和粗粒级样本组分），并对数字化图像进行处理，以在每幅图像中将检测到的每个对象单独分割；（2）通过人工智能建立、评估和验证训练集，以半自动地将扫描样本中大型无脊椎动物的个体图像与碎屑及人工杂质区分开来；（3）描绘大型无脊椎动物群落的体型结构。除实验方案外，本研究还提供了校准结果，并列举了若干在将该方法适配于大型无脊椎动物样本时所面临的挑战及改进建议。总体而言，研究结果支持使用本方案中的扫描系统对河流大型无脊椎动物进行自动体型测量，并表明其体型谱的描绘是快速生物评价淡水生态系统的一项有效工具。

引言

底栖大型无脊椎动物被广泛用作生物指示剂，以确定水体的生态状况1。大多数用于描述大型无脊椎动物群落的指数都侧重于分类学指标。然而，鼓励使用整合了体型大小的新生物评价工具，以对分类学方法提供替代或补充的视角2,3。

体型被认为是一种与新陈代谢、生长、呼吸和运动等其他重要性状相关的元性状4。此外，体型可以决定生物在食物网中的营养级位置及其相互作用5。在一个群落中，个体体型与按体型分级归一化的生物量（或丰度）之间的关系被定义为尺度谱6，其普遍模式表现为：在对数尺度上，随着个体体型的增加，归一化生物量呈线性下降7。这一线性关系的斜率已在理论上得到广泛研究，且跨生态系统的实证研究已将其用作群落体型结构的生态学指标4。另一个在生物多样性-生态系统功能研究中成功应用的群落体型结构综合指标是群落体型多样性，它以尺度谱中各体型类别的香农指数或其类似指标来表示，后者基于个体体型分布进行计算8。

在淡水生态系统中，不同动物类群的体型结构被用作一种非分类学指标，以评估生物群落对环境梯度9,10,11以及人为干扰12,13,14,15,16的响应。大型无脊椎动物也不例外，其体型结构同样会响应环境变化17,18以及采矿19、土地利用20或 氮（N）和磷（P）富集20,21,22等人为干扰。然而，测量数百个个体以描述群落的体型结构是一项繁琐且耗时的工作，由于时间有限，实验室通常避免将其作为常规测量项目。因此，已开发出多种半自动或全自动成像方法用于分类和测量标本23,24,25,26。但这些方法大多侧重于分类学鉴定，而非生物个体的体型测量，且尚不能适用于所有类型的大型无脊椎动物。在海洋浮游生态学中，扫描图像分析系统已被广泛用于确定浮游动物群落的体型大小和分类组成27,28,29,30,31。该仪器在全球多个海洋研究机构中均有配备，可用于扫描保存的浮游动物样品，获得整个样品的高分辨率数字图像。本方案对这一仪器的使用进行了改进，使其能够快速、自动地估算河流中大型无脊椎动物群落的体型谱，而无需投入成本研发新设备。

该方案包括对样品进行扫描，并对整幅图像进行处理，以自动获取样品中各个对象的单个图像（即小图）。通过多种形态、大小和灰度特征参数来表征每个对象，并实现对象的自动分类，分类结果随后由专家进行验证。每个生物个体的大小通过椭球形生物体积（mm3）计算得出，该体积基于以像素为单位测量的生物体面积推算而来。这使得能够快速获得样品的粒径谱。据我们所知，该扫描成像系统目前仅被用于处理中型浮游动物样品，但该设备未来有望也可用于淡水底栖大型无脊椎动物的研究。

本研究的总体目标是通过改进先前用于海洋中型浮游动物的现有方案，建立一种快速获取保存状态下河流大型无脊椎动物个体大小的方法。27,32,33该步骤包括 采用一种半自动方法，通过扫描设备对水样进行扫描，并利用三种开源软件处理扫描图像。本文介绍了一种经过改进的协议，用于扫描、检测和识别数字化的河流大型无脊椎动物，以自动获取群落体型结构及相关体型参数。基于从伊比利亚半岛东北部（NE）三个流域（Ter、Segre-Ebre 和 Besòs）采集的42幅河流大型无脊椎动物样本扫描图像，本文还对该方法的评估结果及提升效率的操作指南进行了阐述。

根据西班牙政府制定的可涉水河流底栖大型无脊椎动物野外采样与实验室分析方案34，在河流100米河段范围内进行样品采集。采用苏伯采样器（框架：0.3 m × 0.3 m，筛网孔径：250 µm）进行多生境调查法采集样品。在实验室中，样品经清洗后依次通过5 mm和500 µm筛网，获得两个子样品：粗颗粒子样品（5 mm筛网）和细颗粒子样品（500 µm筛网），分别储存于不同的样品瓶中，并用70%乙醇保存。将样品分为两个粒径组分有助于更准确地估算群落的个体大小结构，因为大型生物的数量通常比小型生物更稀少。否则，扫描所得样品将对大型个体组分产生偏差性表征。

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方案

注意：此处描述的方案基于 Gorsky 等人27为海洋中型浮游动物开发的系统。有关扫描仪（ZooSCAN）、扫描软件（VueScan 9x64 [9.5.09]）、图像处理软件（Zooprocess、ImageJ）以及自动识别软件（Plankton Identifier）的具体操作步骤，可参见先前的文献32,33。为了更好地将底栖大型无脊椎动物的尺寸范围与中型浮游动物相匹配，在按照原始方案32,33创建项目后，需在配置文件中将最小尺寸参数（minsizeesd_mm）调整为 0.3 mm，最大尺寸参数（maxsizeesd_mm）调整为 100 mm。为便于遵循本方案，相关流程已总结于工作流程图中（图 1）。所创建的项目将存储在计算机的 C 盘文件夹中，并按以下文件夹进行组织：PID_process, Zooscan_back, Zooscan_check, Zooscan_config, Zooscan_meta, Zooscan_results 和 Zooscan_scan。 每个文件夹包含多个子文件夹，供后续方案步骤中的不同软件程序使用。

1. 宏无脊椎动物样本数字图像的获取

  1. 扫描并处理空白样本
    注意：每天在扫描前创建两张空白图像，用于在当天处理扫描图像时提取背景扫描。
    1. 打开扫描仪，并将双位置光源开关拨至开启，以从顶部和底部投射白光。
      注意：扫描中型浮游动物样品时使用向上的光照方向，但由于大型无脊椎动物不透光性较强，建议将光源切换至双面照明位置。
    2. 用自来水清洗并冲洗扫描托盘。
    3. 将110 mL室温（RT）静置的自来水倒入扫描仪托盘中，直至玻璃表面被完全覆盖。将大号框架（24.5 cm × 15.8 cm）正确放置于扫描仪托盘内（框架一角位于托盘左上区域），并加入自来水至框架台阶处完全浸没，以避免弯月面效应影响扫描图像质量。关闭扫描仪盖板。
      注意：使用室温水以避免冷凝和气泡形成。清洁框架时避免留下划痕或液滴，以防光线反射。
    4. 前往图像处理软件，选择工作项目，然后单击 扫描（转换）背景图像.
    5. 转到扫描软件并点击 预览确保预览扫描图像，检查是否存在线条或斑点，并在开始下一次扫描前至少等待30秒。点击 扫描 并按压 好的 在第二次扫描前，在指令窗口中操作，将扫描软件的数据发送至图像处理软件。
      注意：扫描两次以获得将构成空白的两个背景扫描。此步骤在每天开始样品处理前进行一次，图像存储在 Zooscan_背面 文件夹
    6. 扫描完成后关闭扫描软件。
  2. 样品制备与扫描
    警告：乙醇为易燃液体，可能造成严重的眼损伤/刺激。
    1. 填写样本元数据。前往图像处理软件并选择 填写样本元数据输入样本编号，点击 好的，并填写元数据。
      注意：该元数据文件专为中型浮游动物样品设计，因此不适用于底栖大型无脊椎动物的采样方法。但在扫描前必须填写文件中的所有字段，否则将弹出错误提示。
    2. 将110 mL 70%乙醇倒入扫描托盘中，直至玻璃表面被完全覆盖，然后将大框架（24.5 cm × 15.8 cm）放置在扫描托盘的左上角位置。
      注意：应使用乙醇而非水，因为大型无脊椎动物标本保存在乙醇中。在水中，标本会漂浮并在扫描托盘中移动，导致图像模糊，从而无法获得可靠的尺寸测量结果。乙醇应于室温保存，以避免冷凝和气泡形成。
    3. 将大型无脊椎动物样品倒入由边框固定的扫描托盘中，如有需要，可在边框台阶处添加更多乙醇。
      注意：避免加入过多乙醇，以防生物体漂浮和漂移。
    4. 在整个框架区域内匀浆样品，将较大的个体置于托盘中央，以利于图像处理，并使用木针压沉漂浮的生物体。
      注意：如果一个子样本在数量上超过1,000个个体，应将该子样本分成两个或更多部分，以尽量减少扫描图像中生物体之间的接触，并分别对各部分进行扫描。
    5. 使用木针分离相互接触的生物体以及与视野边缘接触的生物体。
      ​注意：此步骤需要 5–20 分钟。软件会将相互接触的生物体视为单个对象；因此，在这些情况下，计算出的个体大小并不对应于实际的单个生物体，可能导致群落大小结构的估计出现偏差。虽然可以使用图像处理软件对图像进行编辑以分离这些对象，但该额外步骤至少需要 1.5 小时的重新处理时间；因此，强烈推荐采用人工分离方法。
    6. 扫描样品时，关闭扫描仪盖板，进入图像处理软件，选择工作项目，然后点击 使用 Zooscan 扫描样品（用于存档，不进行处理）.
    7. 选择样本并按照说明操作。
    8. 转到扫描软件并点击 预览确保预览扫描图像，检查是否存在线条或斑点，并在开始下一次扫描前至少等待30秒。
    9. 至少30秒后，点击 扫描 扫描软件中的按钮。
      注意：按压 好的 在图像处理软件中按下后 扫描 扫描软件中。请勿按动计算机键盘上的任何按键，并避免在扫描过程中产生振动。扫描完成后将生成三个文件 Zooscan扫描 > _raw 文件夹包含：(i) 一种标记图像文件格式（.tif）（16 位）；(ii) 一个名为 LOG 的标准文本文件（.txt），记录扫描参数信息；以及 (iii) 一个名为 META 的标准文本文件（.txt），包含采样方法的信息。
    10. 验证原始扫描结果是否正确。
      注意：如果扫描图像出现浅色条纹或其他可见问题，建议重新扫描，以避免后续步骤出现问题。
  3. 样品回收
    1. 取下框架，在扫描托盘上方使用装有70%乙醇的挤压瓶冲洗，以回收附着的大型无脊椎动物。
    2. 抬起扫描仪上部，通过扫描取出漏斗将托盘中的所有生物体和乙醇收集到烧杯中。保持扫描仪上部抬起状态，用挤压瓶冲洗托盘，冲走残留的任何生物体。
    3. 将烧杯中的样本和乙醇通过一个 500 µm 使用筛网保留无脊椎动物，并将其存回含有70%乙醇的样品瓶中。
    4. 一旦所有样本均已回收至小瓶中，用自来水清洗托盘。
      注意：在不同样品之间用自来水冲洗托盘，以尽量减少乙醇沉淀，避免影响图像处理。用自来水冲洗框架，以防乙醇使用可能造成的损害。 当天结束时，使用自来水清洗托盘，并用纸巾轻轻擦干，以避免划伤。
  4. 图像处理
    1. 转到图像处理软件并选择 转换 & 批量处理图像与生物样本，随后转换并处理图像及颗粒（图像位于 RAW 文件夹中）保持默认设置，然后点击 好的. 正常对照组 将在过程结束时出现。
      注意：将在扫描图像中为所有检测到的对象生成一个 PID 文件以及相应的插图（以联合图像专家组文件格式 [.jpg] 存储） Zooscan扫描 > 工作 文件夹中。PID 文件是一个单一文件，其中存储了所有元数据（元文件）、与日志文件相关联的技术数据，以及一个包含图像中检测到的所有对象的 36 个测量变量的表格。这些测量变量对应于灰度值、分形维度、形状和大小的不同估算值。可用于大小估算的变量包括面积，以及与对象面积相等的椭圆的长轴和短轴（参见实验方案第 3 节）。处理时间取决于 图像密度和计算机性能，并可在回收和准备下一个样本的同时在样本之间启动处理。否则，建议在夜间以批处理模式启动每天扫描样本的处理，并于次日早晨检查图像处理是否正常。
    2. 检查经图像处理软件处理后的图像中，样本图像的背景是否已适当扣除，或通过查看位于以 msk1.gif 结尾的掩膜图像进行确认 Zooscan扫描 > 工作如果背景存在过饱和区域或大量斑点，建议重新扫描以确保图像质量。
      注意：为避免背景出现饱和区域，每次使用乙醇扫描后，应使用自来水冲洗扫描托盘。同时需注意以下几点：（1）通过分样并分批扫描以减少每次扫描的个体数量；（2）确保较大的生物体置于扫描托盘中央；（3）使用洁净、过滤的乙醇；（4）减少样品上的污物；（5）确保扫描所用乙醇体积充足；（6）确保样品预览与正式扫描之间的间隔至少为30秒。
  5. 分离接触的生物体
    注意：当存在多个包含相互接触生物体的小图时，有必要将相互接触的生物体图像与其他生物体和/或纤维/碎屑分离开，以确保对群落大小结构进行准确估算。
    1. 转到图像处理软件以检测包含多个对象的图像片段。选择 使用情景片段进行分离 并继续按压 好的在配置选择窗口中，保持默认设置，然后单击 好的.
    2. 在 从插图中分离 窗口，保持默认设置，同时选择 在插图上添加轮廓，然后选择要编辑的样本。
    3. 分离每幅图中相互接触的生物体 通过鼠标绘制一条线（按住滚轮按钮进行绘制）会弹出窗口。当小图中的分离完成后，单击 X 窗口右上角的按钮，并按下 是 处理下一个。按 一氧化氮 结束并保存更改。在流程结束时， 正常对照组 如果一切正常，将会出现。
    4. 分离后，重新处理图像以获取更新的对象数据。进入图像处理软件，点击 过程（转换）图像（过程一），然后选择 在 WORK 子文件夹中对已处理图像的颗粒进行再次处理选择样本，并在 单幅图像处理 窗口，保持默认设置，勾选 分离掩膜操作（创建-修改-包含），然后点击 好的过程结束时， 正常对照组 如果一切正常，将会出现。
    5. 在 流动分离控制 窗口，按 好的 保存带有轮廓的图像以供处理前使用；如果已存在先前的图像，则将被替换。
    6. 在 分离控制掩模 窗口，如有需要，选择 编辑 使用鼠标在掩膜上添加分割线，以分离在之前的 vignettes 分割步骤中未出现过的相互接触的生物体。完成后，结束该过程，并在 分离掩膜控制 窗口，选择 是 接受掩膜。在过程结束时， 正常对照组 如果一切正常，将会出现。
      注意：使用分离掩膜对样本进行重新处理较为耗时（每个样本可能需要超过1.5小时）。建议在步骤1.2.5中投入必要时间，以避免这一额外步骤。

2. 物体的自动识别

注意：创建一个学习集，以自动预测所检测对象的身份，从而将样本中的生物体与碎片分离开来。

  1. 学习集创建
    1. 复制将用于创建学习集类别的图像及与这些图像相关的 .pid 文件 Zooscan扫描 > 工作 到 PID 过程 > 未分类小品_pid.
      注意：选择具有较高分类群多样性和不同采样地点和/或采样季节的样本子集，以确保样本中生物体的最大代表性。
    2. 在 PID 过程 > 学习集 文件夹中，创建一个以新学习集名称命名的子文件夹（例如：yyyymmdd_raw_LS），并在其中创建对应于学习集每个类别的子文件夹（例如：大型无脊椎动物、碎屑、其他无脊椎动物）。
      注意：为了高效获取河流大型无脊椎动物样本的群落大小结构，建议使用仅包含三个类别的学习集：大型无脊椎动物、其他无脊椎动物和碎屑。该学习集基本可将对应于生物体的物体缩略图与对应于碎屑（如纤维、颗粒或丝状藻类）的缩略图区分开来。
    3. 转到图像处理软件（仅限高级模式）并选择 用于浮游生物识别器的提取片段（用于训练的未分类片段）保持默认选项并检查 添加轮廓 盒
    4. 转到自动识别软件，点击 学习，从以下选项中选择 PID 过程 > 学习集 新学习集创建的子文件夹（步骤 2.1.2），然后按 好的.
    5. 左侧部分（未分类的缩略图) 打开窗口中，选择文件夹 未分类的片段_pid. 选择小插图，用鼠标将其从未分类缩略图区域拖动到右侧相应类别的文件夹中， 排序后的拇指，将每个对象分类到已定义的类别中。被移动的插图将标有红色的 X。
      注意：通过在已排序的缩略图文件夹中手动创建子文件夹，或通过点击软件中的文件夹图标来定义分类。每次移动的 vignettes 数量不得超过 50 个。
    6. 当所有类别均填入选定的对象（每个类别约300个对象）后，点击 创建学习文件 并将其保存为所需的名称。
      注意：学习集将被保存为 .pid 文件 PID 过程 > 学习集 项目的文件夹。建议创建并测试多个具有不同层级类别（从粗略到精细）以及每个类别内对象数量不同平衡性的学习集。首先从类别数量较少且每个类别至少包含50个对象的粗略学习集开始，然后增加每个类别中的对象数量和/或创建更精细的学习集。每个类别应在样本集中充分代表其变异性。
  2. 学习集的评估
    注意：使用随机森林方法结合自动识别软件，通过两次折叠和五次试验的交叉验证，获得对象分类结果的混淆矩阵。
    1. 转到自动分类软件并点击 数据分析.
    2. 在 选择学习文件，从已创建的学习集文件中进行选择 PID 过程 > 学习集.
    3. 在 选择一种方法，选择 交叉验证随机森林 方法。在 原始变量，取消勾选位置变量（X、Y、XM、YM、BX、BY 和 Height）。在 自定义变量，仅勾选 内镜黏膜下剥离术.
      注意：该方法使用学习集的一个随机部分来识别另一部分（两次折叠），并重复五次以确保统计上的稳健性。
    4. 点击 开始分析，并将结果另存为 分析名称.txt 在 PID 过程 > 预测 文件夹。当分析成功完成后，退出数据分析。
    5. 前往 PID 过程 > 预测 文件夹并单击交叉验证文件。此时将弹出一个窗口，显示真实分类（行）与自动分类（列）的混淆矩阵。
      注意：召回率是指属于某一类群的生物体被自动正确识别的比例，而1-精确率是指算法分类为该类群但实际上未被识别的生物体比例（即类群中的污染）。召回率应高于70%，污染率（1-精确率）应低于20%。
    6. 如果创建了多个学习集且需要获得每个学习集的召回率和1-精确率，请重复步骤2.1-2.5。
      注意：如果已创建多个学习集，请选择对目标类群（即大型无脊椎动物）具有最高召回率（良好的识别效果）和精确率（低污染率）的学习集，用于下一步测试样本集的自动预测。
  3. 大型无脊椎动物鉴定的预测
    注意：使用随机森林算法的自动识别软件，基于选定的学习集预测部分样本中所有对象的身份。
    1. 转到自动识别软件并点击 数据分析.
    2. 在 选择学习文件，从学习集文件中选择 PID 过程 > 学习集 用于预测时必须使用的参数。
    3. 在 选择样本文件，从以下选项中选择 PID结果 将要进行预测的样本（PID 文件）放入文件夹中。
      注意：为避免因内存问题导致的错误，每次最多同时处理 20 个 .pid 文件。若同时处理过多 .pid 文件，虽然进程可能显示正常结束，但实际处理可能不完整，并在后续使用图像处理软件进行处理时出现错误。
    4. 在 选择一种方法，选择 随机森林 方法。蜱虫 保存每个样本的详细结果在 原始变量，取消勾选位置变量（X、Y、XM、YM、BX、BY 和 Height）。在 自定义变量，仅勾选 ESD。
    5. 点击 开始分析，并将结果保存为 分析名称.txt 在 PID 过程 > 预测 文件夹
  4. 手动验证
    注意：由专家手动验证上一步的预测结果，将分类错误的对象重新归类至正确类别。
    1. 复制 Analysis_sample_dat1.txt 待验证的文件 PID 过程 > 预测 文件夹到 PID 过程 > Pid_results 文件夹
    2. 转到图像处理软件并选择 根据预测或验证提取文件夹中的片段然后，选择 使用来自 PREDICTED 的预测文件 "pid结果" 文件夹保持默认设置，然后按 好的.
    3. 该软件会创建一个名为 样本_yyyymmdd_hhmm_待验证 与预测对象在 PID 控制过程 > 排序后的片段 文件夹
    4. 前往 PID 过程 > 排序后的片段 文件夹，并复制该文件夹 样本_yyyymmdd_hhmm_待验证. 替换文件夹名称 验证 与 已验证.
    5. 为手动验证自动分类结果，请打开文件夹 样本_yyyymmdd_hhmm_已验证, 并依次查看每个子文件夹（类别）中的所有缩略图，以确定是否存在分类错误的对象。当发现某个对象被错误分类时，使用鼠标将该缩略图拖动至正确的文件夹（类别）中。
    6. 转到图像处理软件并选择 从已分类的小片段中加载识别信息保持默认设置并选择 yyyymmdd_hhmm_name_validated 待处理。
    7. 前往 PID 控制过程 > Pid_results > Dat1_validated, 名为的文件 来自已排序小插图的标识_年月日_时分.txt 以及每个已验证样本的一个.txt文件（sample_tot_1_dat1.txt已创建。
      注意：这些 .txt 文件包含一个新列，用于显示预测结果，命名为 pred_valid_Id_yyyymmdd_hhmm，该列指明每个对象的专家分类（即验证后的分类）。在验证过程中，可在此时创建新的类别（例如更细的分类单元）。但新类别的命名中需保留原始类别的名称（例如 macroinvertebrate_chironomidae），以便在计算召回率和精确率时追溯原始类别，并便于将所有大型无脊椎动物归类以计算群落体型结构参数（即体型谱和体型多样性）。文本文件提供了与每个对象相关的数据，包括用于计算每个生物体椭球体积（作为个体体型的度量）的短轴和长轴。此外，表格的最后两列包含每个对象（每行）的预测类别和验证类别，可用于按类别计算学习集在样本子集上的召回率和精确率。figure-protocol-1

图1：代表本实验方案第1节和第2节的工作流程图。 所示时间仅为示例，实际时间可能因计算机性能、需处理的病例片段数量以及学习集的类别数量而有所不同。本案例对应于在一个包含42个子样本（总计47,473个病例片段）的数据集上，对一个包含三个类别的学习集进行验证。 请点击此处查看该图的放大版本。

3. 计算个体大小分布、粒径谱和粒径参数

注意：本节中提到的计算使用 Matlab 进行（参见脚本 补充文件 1）。

  1. 个体大小分布
    1. 最后一列 来自已排序小插图_年月日_时数.txt的标识符 文件包含经过验证的分类结果。仅选择被归类为大型无脊椎动物的对象，以展示其在样本中的个体大小分布。
      注：个体体型对应于大型无脊椎动物的椭球体积。该系统以像素为单位提供测量值。
    2. 将两次扫描的尺寸测量向量进行拼接，因为每个组分具有不同的子采样指数。在拼接前，需根据各子样本的分级次数复制相应的尺寸向量，以校正分级效应。
      注意：若扫描对应样品的部分（即粗分或细分），则需执行此步骤。
    3. 根据与生物体具有相同像素面积的扁长椭球体的长轴（M）和短轴（m）计算椭球体积。在计算椭球体积之前，使用以下转换系数（cf）将长轴（M）和短轴（m）从像素单位转换为毫米（mm）。
      1 像素 = 2,400 dpi
      1 英寸 = 25.4 毫米
      cf = 25.4/2400
      椭球体积（ellipVol，单位为立方毫米）3) 对应：
      figure-protocol-2
    4. 在双对数坐标上绘制个体大小分布的概率密度函数2 规模。
  2. 尺寸多样性
    1. 根据 Quintana 等人（2008 年）的方法计算尺寸多样性（Sd）。8如 García-Comas 等人（2016 年）所述35:
      figure-protocol-3
      哪里 px(x) 是尺寸的概率密度函数 x以及 x 代表对数2 (ellipVol因此，该指标是适用于连续度量的香农多样性指数，例如群落中的个体大小分布。
  3. 标准化生物体积大小谱
    1. 确定NBSS的尺寸等级，将谱系下限设定为样本中大型无脊椎动物尺寸分布的0.01分位数，并以2为底数的几何尺度创建尺寸等级，直至涵盖样本中最大的生物体。
      注意：尺寸等级宽度随尺寸增大而增加，以考虑更大尺寸所伴随的更大变异性。此处分析的宏无脊椎动物群落的归一化生物量谱具有14个尺寸等级。表 1).
    2. 通过将每个尺寸级别的总生物体积除以该尺寸级别的宽度，获得归一化生物体积。
  4. 尺寸谱斜率
    1. 计算NBSS的线性斜率。
      注意：斜率（µ) 的计算基于对数关系2 （尺寸等级中点）与对数2 （归一化生物量）在大于众数的粒径等级中，忽略任何空等级（在本研究中，为第3至14级）。
粒径分级限值（mm3）粒径分级中点（mm3）  
0,12360,1855
0,24730,3709
0,49460,7418
0,98911,4837
1,97831,4837
3,95605,9348
7,913111,8696
15,826123,7392
31,652247,4783
63,304494,9567
126,6089189,9133
253,2178379,8267
506,43007597,7000
1012,900015193,0000
2025,7000

表1：标准化生物量大小谱（NBSS）的大小类别。 该表还 列出了15个大小类别的界限及其生物体大小类别的中点。

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结果

大型无脊椎动物样本的数字图像采集
扫描注意事项：扫描托盘中乙醇的残留
在对大型无脊椎动物样本进行系统测试时，部分扫描图像质量较差。背景中出现深色过饱和区域，影响了图像的正常处理，并导致无法准确测量各个大型无脊椎动物的尺寸（图2）。背景中出现过饱和区域或图像像素化严重可能由多种原因造成：（1）扫描托盘上样本数量过多；（2）样本中含有过多杂质；（3）样本预览与正式扫描之间的时间间隔不足；或（4）在图像处理过程中所使用的背景图像质量不佳，原因可能包括冷凝、污渍或水质差33。在大型无脊椎动物群落样本中，若使用乙醇代替水，会在托盘上产生沉淀物；若未在每次扫描之间用清水充分冲洗，则会形成深色阴影。充分冲洗对于获得清晰图像以及最大限度减少扫描托盘玻璃的腐蚀至关重要。

扫描细节：碎屑浓度
通过对 47,473 个图像片段的子集进行分析，发现其中大部分（86...

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讨论

采用 Gorsky 等人 2010 年描述的方法对河流大型无脊椎动物进行适应性改进，可实现对淡水大型无脊椎动物群落个体大小结构的高精度分类评估。结果表明，该方案可将单个样本个体大小结构的估算时间缩短至约 1 小时。因此，本方案旨在推动将大型无脊椎动物个体大小谱作为快速且综合的生物指示指标，用于评估外界干扰对淡水生态系统的影响。大型无脊椎动物个体大小谱已被成功用作评价沿海泻湖生态状况的有效指数22。随着该方案的建立，可开展大规模的无脊椎动物调查，从而支持覆盖广泛空间和时间尺度的野外监测工作。

由于本方案的目的是快速获得所采样群落中个体的大小分布，而不考虑分类学信息，因此建议创建一个如本文所提出的简单学习集。更精细的学习集（类别数量更多）的测试结果显示，整体大型无脊椎动物的召回率和精确度较低（表2），且验证步骤更加耗时。

自动预测结果与来自不同采样点的42个天然亚样品的验证预测结果高度一致，表明自动模式下的方法适用于对天然样品中的大型无脊椎动物进行计...

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披露

作者声明不存在潜在的利益冲突。

致谢

本工作得到了西班牙科学、创新和大学部（项目编号 RTI2018-095363-B-I00）的支持。我们感谢 CERM-UVic-UCC 成员 Èlia Bretxa、Anna Costarrosa、Laia Jiménez、María Isabel González、Marta Jutglar、Francesc Llach 和 Núria Sellarès 在大型无脊椎动物野外采样和实验室分类工作中的贡献，以及 David Albesa 在样品扫描方面的合作。最后，我们感谢 Josep Maria Gili 和海洋科学研究所（ICM-CSIC）提供实验室设施和扫描设备的使用。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
烧杯Labbox可使用其他容器
去离子水Icopresa 8420239600123用于稀释乙醇
漏斗Vitlab41094
8 ml 玻璃小瓶LabboxSVSN-C10-195每份样品使用 1 个小瓶
ImageJ 软件 免费获取版本 4.41o / 图像处理软件
大尺寸框架Hydroptic 由 ZooScan 提供24.5 cm × 15.8 cm
Monalcol 96（乙醇 96）Montplet1050JE001
浮游生物识别软件免费获取版本 1.2.6 / 自动识别软件
筛网Cisa26852.2标称孔径 500µ，标称孔径 0.5 cm
镊子BondlineB5SA不锈钢、抗磁、耐酸
VueScan 9 x 64 (9.5.09) 软件Hydroptic版本 9.0.51 / 扫描软件
木质针可使用任意塑料或木质针
Zooprocess 软件 免费获取版本 7.14 / 图像处理软件
ZooScan Hydroptic54版本 III / 扫描仪

参考文献

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