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快速评估膜蛋白质量的荧光尺寸排阻色谱法

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DOI：

10.3791/64322

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2023年1月6日

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1Peak Proteins Ltd.

本文内容

摘要

本方案描述了一种对膜蛋白进行荧光尺寸排阻色谱（FSEC）分析的操作流程，用于评估其在后续功能与结构分析中的质量。文中展示了多种G蛋白偶联受体（GPCRs）在去垢剂溶解和无去垢剂条件下获得的代表性FSEC结果。

摘要

在膜蛋白结构解析和生物物理表征过程中，通常需要尝试多种蛋白构建体，这些构建体包含不同的标签、截短、缺失、融合伴侣插入以及稳定化突变，以筛选出在从膜中提取后不发生聚集的构建体。此外，通过缓冲液筛选来确定能够为膜蛋白提供最稳定条件的去垢剂、添加剂、配体或聚合物，也是一项重要的实验步骤。利用荧光尺寸排阻色谱对膜蛋白质量进行早期表征，是一种无需纯化蛋白即可评估和排序不同构建体或条件的有力工具，同时该方法还能显著减少样品用量。膜蛋白必须带有荧光标记，通常通过在其表达时融合GFP标签或类似荧光蛋白实现。蛋白可直接从完整细胞中溶解提取，随后通过离心进行粗略澄清；接着将样品上样至尺寸排阻色谱柱，收集荧光信号图谱。本文介绍了运行FSEC的方法，并展示了G蛋白偶联受体靶标鞘氨醇-1-磷酸受体（S1PR1）和5-羟色胺受体（5HT2AR）的代表性FSEC数据。

引言

尺寸排阻色谱法（SEC），也称为凝胶过滤色谱法，是蛋白质科学研究中常用的技术1。在SEC过程中，蛋白质根据其流体动力学半径进行分离，该半径取决于蛋白质的大小和形状2。简而言之，这种分离是通过在流动条件下将蛋白质样品加载到由多孔微珠填充的柱床中实现的，这些微珠起到分子筛的作用。所用微珠通常为交联琼脂糖，具有特定范围的孔径，允许蛋白质进入或被排除在微珠孔隙之外3,4,5,6,7。流体动力学半径较小的蛋白质在孔隙内停留的时间比例更高，因此在柱床中移动较慢；而较大的蛋白质更多时间处于微珠外部（即排阻体积），因而更快地通过柱床。当使用制备型色谱柱时，SEC可作为蛋白质纯化的一个步骤1。当使用分析型色谱柱时，SEC可用于分析蛋白质的质量和性质2。例如，样品中可能存在的蛋白质聚集体通常体积较大，仅在排阻体积中迁移，因此最早从色谱柱中洗脱出来；该体积被称为柱空体积或空体积。此外，可通过使用分子量标准品对色谱柱进行校准，从而根据标准曲线插值得到目标蛋白质的估计分子量。

通常，通过检测蛋白质在280 nm处的吸光度来监测蛋白质从尺寸排阻色谱柱中的洗脱情况。这限制了尺寸排阻色谱（SEC）作为分析工具的应用，仅能在目标蛋白质基本不含污染蛋白时使用，例如在蛋白质纯化的最后步骤中。然而，荧光尺寸排阻色谱（FSEC）利用了带有荧光标记的目标蛋白质，因此可以在其他蛋白质甚至粗提混合物存在的情况下，特异性地通过荧光信号监测目标蛋白质的洗脱8,9。此外，由于荧光信号具有高度灵敏性，即使样品中蛋白质含量极低，也能成功进行分析。目标蛋白质通常通过在表达载体中融合绿色荧光蛋白（GFP）或增强型绿色荧光蛋白（eGFP）标签来实现荧光标记。随后可通过在395 nm或488 nm激发，并分别在509 nm或507 nm检测GFP或eGFP的荧光发射信号来监测荧光强度10。

利用荧光信号监测蛋白从SEC柱中的洗脱，使得FSEC成为分析膜蛋白样品的一种有价值工具，尤其当膜蛋白的表达水平远低于可溶性蛋白时。关键的是，可在粗裂解液经增溶后直接分析膜蛋白的质量和特性，而无需事先优化纯化流程11,12。基于这些原因，FSEC可用于快速评估膜蛋白质量，同时探索可能改善膜蛋白在溶液中行为的各种因素。例如，通常需要测试多种含有不同标签、截短、缺失、融合伴侣插入以及稳定突变的构建体，以筛选出从膜提取后不发生聚集的蛋白13,14。此外，通过缓冲液筛选确定能够为膜蛋白提供最稳定环境的去垢剂、添加剂、配体或聚合物，有助于明确最佳的蛋白纯化缓冲体系，或为后续应用（如生物物理检测或结构表征）提供足够的蛋白稳定性。

因此，FSEC 方法的总体目标是为感兴趣的靶膜蛋白收集凝胶过滤层析柱的洗脱谱。此外，由于采用了荧光检测，该 SEC 谱图可在构建体和实验条件优化的早期阶段即获得，无需经历耗时的纯化步骤。FSEC 谱图可作为比较工具，用于评估在不同缓冲条件或不同膜蛋白构建体下纯化膜蛋白的成功可能性。通过这种方式，收集 FSEC 谱图可作为一种快速迭代的过程，用于在投入大量资源制备后续分析所需量的高纯度蛋白之前，优化构建体设计和缓冲液组成。

方案

1. FSEC 所用去垢剂和缓冲液的配制

  1. 配制去垢剂储备液。
    1. 配制20 mL储备液时，称取4 g十二烷基麦芽糖苷（DDM）粉末和0.4 g胆固醇半琥珀酸酯（CHS）粉末，用实验室级去离子H2O定容至20 mL。
    2. 加入所有组分后，在4 °C下通过翻转混匀仪（end-over-end inversion）混合，直至组分完全溶解。建议在4 °C下过夜翻转混合。
    3. 分装后将去垢剂储备液于−20 °C保存备用。若需立即使用，应将去垢剂储备液置于冰上保存。
      注：本研究中使用的标准去垢剂储备液为20%（w/v）DDM和2%（w/v）CHS的混合液（见材料表）。也可使用其他去垢剂（例如新戊二醇月桂基麦芽糖苷，LMNG），或尝试使用聚合物（如苯乙烯-马来酸共聚物，SMA）进行无去垢剂提取。此选择应在设计待测试实验条件时确定。
  2. 配制溶解缓冲液。
    1. 在烧杯中加入适量质量或体积的各组分，配制溶解缓冲液，使其终浓度为100 mM HEPES、200 mM NaCl、20%（v/v）甘油和1×蛋白酶抑制剂混合液（见材料表）。
      注：在本研究中，配制50 mL溶解缓冲液足以处理五个样品。
    2. 向烧杯中加入0.7倍体积的实验室级去离子H2O（例如，若配制50 mL缓冲液，则加入35 mL）。
    3. 置于磁力搅拌器上搅拌，并使用pH计逐滴加入浓NaOH，调节缓冲液pH至7.5。
    4. 使用量筒加入实验室级去离子H2O，定容至所需最终体积。
  3. 配制SEC运行缓冲液。
    1. 在烧杯中加入适量质量或体积的各组分，配制SEC运行缓冲液，使其终浓度为100 mM HEPES、150 mM NaCl和10%（v/v）甘油。
      注：在本研究中，配制600 mL SEC缓冲液足以运行五个样品。
    2. 向烧杯中加入0.7倍体积的实验室级去离子H2O（例如，若配制600 mL缓冲液，则加入420 mL）。
    3. 置于磁力搅拌器上搅拌，并使用pH计逐滴加入浓NaOH，调节缓冲液pH至7.5。
    4. 使用量筒加入实验室级去离子H2O，定容至所需最终体积。
    5. 在真空条件下，使用瓶顶式0.45 µm孔径滤器过滤SEC缓冲液（见材料表）。
    6. 待缓冲液完全通过滤器后，继续在真空下抽气脱气，直至摇动时不再产生气泡。
    7. 向SEC缓冲液中加入步骤1中配制的去垢剂储备液，使DDM终浓度为0.03%（w/v），CHS终浓度为0.003%（w/v）（例如，若配制600 mL SEC缓冲液，则加入0.9 mL去垢剂储备液）。
    8. 使用前预先将缓冲液冷却。
      ​注：可根据所测试条件选择不同的缓冲液。例如，若需测试不同去垢剂对目标蛋白的影响，理想情况下应配制与蛋白溶解所用去垢剂相同的缓冲液。若使用SMA进行无去垢剂条件测试，则SEC缓冲液中应完全省略去垢剂。有关去垢剂筛选的方案修改细节，请参见讨论部分。

FSEC 样品制备

  1. 制备细胞沉淀。
    注意：本实验的起始步骤是从悬浮培养的表达GFP标记（或其他荧光标记）目标蛋白的细胞中收获细胞沉淀。收获的具体时间和条件取决于所表达的蛋白、使用的细胞系、细胞的培养条件以及诱导蛋白表达的方法。这些细节超出了本方案的范围。在本研究中，每种待测条件使用0.5–1 g的Sf21细胞沉淀，相当于感染后2–3天、以约4 × 106个活细胞/mL密度培养的25–50 mL培养物，该培养物由P2代杆状病毒按1:20稀释后感染获得。请注意，本方案已在其他真核细胞系（例如HEK293E）的类似湿重细胞沉淀上测试并证实同样有效。
    1. 当悬浮培养的细胞达到收获状态时，将25–50 mL培养液分装至50 mL锥形管中。
    2. 对称平衡各管，使用台式离心机（摆桶式转子，参见材料表），在室温下以2,000 × g离心15分钟，使细胞沉淀。
    3. 通过轻轻倾倒去除并弃去上清液；若细胞沉淀较为松散，可使用50 mL移液器配合移液器辅助装置进行移除。
    4. 若细胞将立即用于后续分析，请将细胞沉淀置于冰上，并直接进入步骤5。若需将细胞保存以备后续使用，则应将其置于–80 °C冷冻保存。
    5. 若细胞沉淀已储存在–80 °C，请在室温下孵育15分钟或直至样品完全解冻，迅速解冻后立即转移至冰上。
  2. 重悬并溶解样品。
    1. 向细胞沉淀中加入2 mL溶解缓冲液（步骤1.2）。
    2. 在4 °C下以翻转混匀方式孵育15–30分钟，直至溶液均匀。
    3. 加入预先混合的去垢剂储备液（步骤1.1）（例如，100 µL的20% DDM/2% CHS储备液），使终浓度为1% DDM/0.1% CHS。
    4. 在4 °C下以翻转混匀方式溶解30分钟。
      ​注意：如需要，可同时平行测试多个条件。一次可处理的平行样品数量取决于进行SEC实验所用系统的通量。在本方案描述的实验设置中，最多可同时处理五个样品。
  3. 进行低速离心步骤。
    1. 将样品置于预冷（4 °C）的台式离心机中（摆桶式转子），在2,000 × g下离心15分钟。
  4. 进行高速离心步骤。
    1. 使用连接在5 mL注射器上的钝头针，小心地将低速离心后的上清液转移至超速离心管（例如0.5–2 mL管）中，注意避免扰动低速离心产生的沉淀。
    2. 将离心管配对平衡，质量差控制在0.05 g以内，并放入固定角转子超速离心机中（参见材料表）。
    3. 在4 °C下以250,000 × g离心30分钟。

3. 尺寸排阻色谱法（SEC）

  1. 准备快速蛋白液相色谱（FPLC）系统，并对色谱柱进行平衡。
    1. 按照制造商的说明准备系统（参见材料表），例如，用SEC缓冲液填充系统，并排出泵中的空气。
    2. 将SEC色谱柱连接至FPLC系统，确保无空气进入色谱柱。可通过在色谱柱底部连接一支装有水的注射器，对SEC色谱柱施加背压，从而实现与FPLC系统流路之间的逐滴对接。
    3. 使用1.5个柱体积（对于24 mL色谱柱为36 mL）的实验室级蒸馏过滤H2O冲洗SEC色谱柱，随后再用1.5个柱体积的SEC缓冲液在推荐的流速和压力下进行预平衡（参见材料表）。
      注：本研究中用于进行FSEC的FPLC系统处于低温环境中，配备五位进样阀和六位板式组分收集器。该配置可实现五个样品在相同色谱柱上按顺序自动进样和运行，无需在各次运行之间进行人工干预。进行SEC实验时使用了一种 commercially available 预装的24 mL色谱柱（参见材料表），其填料可分离分子量范围为10–600 kDa的蛋白质。若目标蛋白特别大，可选用其他色谱柱基质，以实现分子量高达5,000 kDa的蛋白质分离。请注意，去垢剂/脂质胶束的存在会使膜蛋白的整体尺寸增加>150 kDa，具体数值取决于所用蛋白和去垢剂。
  2. 将样品上样至色谱柱，并运行SEC实验。
    1. 使用连接在注射器上的钝头针，将高速离心步骤后的上清液转移至1 mL注射器中。此方法可在不扰动沉淀的情况下从离心管中回收样品。
    2. 将样品环设置为加载状态。通过将600–700 µL样品从注射器注入上样口，使500 µL样品环过量填充。根据所用系统，该上样步骤可编程至方法中，以避免操作错误。
    3. 在方法运行过程中，以推荐的流速和压力（参见材料表）用4 mL SEC缓冲液将样品从样品环注入色谱柱。
    4. 以相同流速继续运行色谱柱，直至有1.5个柱体积（对于24 mL色谱柱为36 mL）的缓冲液流经色谱柱。
    5. 在0.25个柱体积（对于24 mL色谱柱为6 mL）时开始收集0.2 mL的组分，共收集90个组分。
      ​注：由于色谱柱的空体积预计为0.3个柱体积，在此之前立即开始收集组分可确保监测到所有蛋白的洗脱情况，包括存在于空体积中的任何蛋白。

4. 荧光示踪物的采集与分析

  1. 将样品从分馏收集器（步骤 3.2.5）转移至 96 孔板，并读取荧光信号。
    1. 在进行荧光检测前，需对收集的样品进行稀释。使用多通道移液器，将储液槽中的 90 µL 实验室级去离子 H2O 转移至不透明平底 96 孔板的每个孔中（参见 材料表）。
    2. 如果在步骤 3.2.5 中已将组分收集至 96 孔块中，则使用多通道移液器将 10 µL 的 SEC 组分从孔块转移至不透明平底 96 孔板中，并通过上下吹打混合；否则，若在步骤 3.2.5 中将 SEC 组分收集至单独的离心管中，则需逐个将每管中的 10 µL 组分转移至不透明平底 96 孔板中，每次转移后均需上下吹打以充分混匀样品。
    3. 将不透明平底 96 孔板放入酶标仪中，测量荧光信号。若使用 GFP 作为荧光标记（本实验中所用），则激发波长应尽可能接近 488 nm，发射波长应尽可能接近 507 nm。
      注：进行荧光检测前所需的稀释倍数取决于表达培养物中目标蛋白的总量以及所用酶标仪的灵敏度。在本研究展示的示例中，样品在水中稀释了 10 倍。建议初始检测时将各组分在水或缓冲液中稀释 5–10 倍。若记录的 FSEC 谱图信号特别低，可采用更小的稀释倍数甚至不稀释的样品。本研究中用于检测的设备为可实现 488 nm 激发和 507 nm 荧光发射检测的酶标仪（参见 材料表）。
  2. 绘制 FSEC 谱图。
    1. 以原始格式（纯文本或逗号分隔值文件）导出酶标仪的数据。这些原始数据将作为 FSEC 谱图的 Y 轴数值。
    2. 对于 X 轴，计算每个组分的收集体积。第一个数据点应为第一组分的洗脱体积，以校正分馏延迟（本例中为 6 mL）。后续各点应按收集的组分体积依次递增（本例中为 0.2 mL）。
    3. 在完成 X 轴和 Y 轴数据的计算后，将数据复制粘贴至绘图软件中（参见 材料表），以绘制各孔荧光信号随其从层析柱洗脱体积的变化曲线。
      注：图 1 展示了运行 FSEC 实验所需步骤的示意图。
  3. 分析 FSEC 谱图。
    1. 评估在空体积处（对于 24 mL 柱约为 8 mL）洗脱的蛋白量，该信号表明蛋白分子尺寸较大，可能处于未折叠或聚集状态。
    2. 评估在后续峰中洗脱的蛋白量，这些峰代表正确折叠的蛋白。对于 24 mL 柱，该峰通常出现在 10 mL 至 16 mL 之间，具体位置取决于蛋白大小（当与去垢剂/脂质胶束结合时）。需特别关注峰形，若峰较宽或分裂，且跨度超过 3–4 mL（对于 24 mL 柱），则表明样品为多分散体系。
    3. 通过将单体峰中的最大信号值除以空体积峰中的最大信号值，计算单体峰高与空体积峰高之比。
      注：该数值称为单分散性指数，可用于定量评估蛋白质量；数值越大表示蛋白质量越佳，而低于 1 的数值则表明样品存在问题，因其聚集蛋白含量高于正确折叠的单体蛋白。
    4. 若需比较多次 FSEC 运行结果，且最关注各情况下单体蛋白的绝对量，则应以酶标仪记录的原始信号（如 RFU）绘制谱图。
      注：若更关注单体蛋白与未折叠蛋白之间的相对比例，则需将信号归一化为总信号的百分比，使用谱图中的最小和最大读数进行计算，从而突出不同谱图间聚集态与单体态蛋白比例的差异。

膜蛋白纯化；荧光层析示意图；GFP标记的GPCR分析。
图1：进行FSEC实验所需步骤的示意图。 （1）表达荧光标记目标蛋白的细胞被溶解。（2）粗制溶解液首先通过低速离心澄清，随后（3）进行高速离心。（4）将澄清后的上清液上样并注入合适的SEC柱中，（5）收集洗脱组分。（6）将各组分样品转移至96孔板中，使用酶标仪检测GFP荧光信号，以（7）绘制FSEC图谱。 请点击此处查看该图的放大版本。

结果

首先，检测了本研究所用酶标仪对 eGFP 的动态范围和最低检测限。将已知浓度的纯化 eGFP 标准品在终体积 50 µL 中稀释至 50 ng·µL−1、25 ng·µL−1、12.5 ng·µL−1、6.25 ng·µL−1、3.125 ng·µL−1、1.5625 ng·µL−1、0.78125 ng·µL−1 和 0.390625 ng·µL−1，并在激发波长 488 nm、发射波长 507 nm 下测定荧光信号（图 2）。实验结果表明，该酶标仪对每孔 eGFP 标记蛋白的最低检测限为 30 ng，在信号饱和前的动态检测范围可达每孔 500 ng。根据最低检测限数值，并假设蛋白洗脱体积占层析柱体积的 0.33，则为了获得可检测的 FSEC 信号，上样至 SEC 层析柱的目标 eGFP 标记蛋白量至少需达到 1.28 µg。

eGFP 荧光数据、信号与浓度关系图、线性与饱和趋势、RFU 测量
图 2：eGFP 标准曲线。 纯化 eGFP 标准品稀释至 50 ng·µL−1、25 ng·µL−1、12.5 ng·µL−1、6.25 ng·µL−1、3.125 ng·µL−1、1.5625 ng·µL−1、0.78125 和 0.390625 ng·µL−1 后的荧光信号散点图。(A) 显示所有稀释度，包括信号饱和的点。(B) 放大后的散点图，仅包含落在酶标仪动态检测范围内的标准品点。请点击此处查看该图的高清版本。

其次，本研究使用的24 mL色谱柱采用分子量标准品进行了校准。在与FSEC分析相同的缓冲液和运行条件下，分别进样并流经色谱柱的分子量标准品包括：蓝色葡聚糖（>2,000 kDa）、铁蛋白（440 kDa）、醛缩酶（158 kDa）、卵清转铁蛋白（75 kDa）和卵清蛋白（43 kDa），并在280 nm吸收波长下收集洗脱曲线。记录到的洗脱体积分别为8.9 mL、12.4 mL、15.2 mL、16.9 mL和18 mL。将这些洗脱体积转换为Kav值（公式1），并对分子量的对数作图后，可拟合得到一条标准曲线。由此可通过标准曲线的插值法估算本研究中测试的GPCR的分子量（图3）。例如，G蛋白偶联受体5-羟色胺受体2A（5HT2AR）在去垢剂DDM中溶解后的FSEC洗脱峰显示其洗脱体积为13.4 mL。该5HT2AR的洗脱体积介于铁蛋白与醛缩酶之间，对应估算的分子量约为300 kDa。本研究中使用的5HT2AR构建体分子量约为50 kDa（包含eGFP标签），这意味着若假设5HT2AR为单体形式，则约250 kDa的分子量可归因于DDM去垢剂/脂质胶束。洗脱体积转换公式的表达如下（公式1）：

静态平衡概念；Kav 公式；色谱方法；蛋白质纯化方程。     (方程 1)

其中 Ve 为洗脱体积，V0 为柱床空隙体积，Vc 为柱总体积。

色谱结果；分子体积与信号图（A），分子量对数分析（B）
图3：使用分子量标准品对SEC柱进行校准的标准曲线。（A）5HT2AR在DDM中溶解后的典型FSEC图谱，图中标出了分子量标准品蓝色葡聚糖（空体积）、铁蛋白、醛缩酶、伴清蛋白和卵清蛋白的相对洗脱位置。铁蛋白、醛缩酶、伴清蛋白和卵清蛋白分别以绿色、紫色、红色和青色标示。（B）利用标准品的洗脱位置换算为Kav值（公式1）后，对log分子量（Mr）作图得到的分子量校准曲线。根据Kav值从该曲线上插值得到5HT2AR在DDM中的Mr，并在曲线上以蓝色方块标出。请点击此处查看该图的放大版本。

随后采用FSEC方法评估G蛋白偶联受体鞘氨醇-1-磷酸受体（S1PR1）的质量与特性15。表达GFP标记的人源S1PR1的昆虫细胞按照本方案所述方法进行FSEC分析（图1）。

首先，通过比较去垢剂 DDM 和 LMNG 与不含去垢剂的 SMA 提取方法，探索了最佳的膜蛋白提取条件（图 4A）。采用单分散性指数评估蛋白样品的质量，该指数基于空体积峰（约 8 mL 柱保留体积）与单分散组分峰（14–15 mL 柱保留体积）之间的蛋白比例。在 LMNG 中溶解的样品表现出更优的 FSEC 谱图，单体峰形更佳，且蛋白聚集体峰更小，表明在 LMNG 中进行溶解和纯化为此膜蛋白提供了最稳定的条件。相比之下，在 DDM 中溶解的样品 FSEC 谱图相对较差，聚集体峰更大，单体峰更宽，表明样品存在多分散性。

其次，通过在溶解过程中向样品中添加鞘氨醇-1-磷酸（S1P），研究了配体添加对FSEC谱型的影响。在此实验中，使用DDM作为溶解试剂，比较了S1PR1在有无S1P存在条件下的FSEC图谱（图4B）。在S1P存在下溶解的样品显示出更优的FSEC图谱，且聚集减少。这表明，在配体存在下进行纯化不仅有助于通过稳定溶液中的受体来提高蛋白样品质量，还可作为蛋白活性的替代标志物，因为结果提示该蛋白正确折叠并具备配体结合能力。

色谱图；信号 vs. 体积；SMA30010P、LMNG、DDM 比较；蛋白质纯化。
图 4：使用 S1PR1 粗提物进行的荧光尺寸排阻色谱（FSEC）分析，显示最佳膜蛋白提取条件及配体结合情况。 （A）S1PR1 在苯乙烯-马来酸共聚物（SMA；蓝色）、月桂基麦芽糖新戊二醇（LMNG；红色）或十二烷基麦芽糖苷（DDM；黑色）中溶解后的 FSEC 谱图比较。（B）S1PR1 在含有（红色）或不含（黑色）激动剂鞘氨醇-1-磷酸（S1P）的情况下，以 DDM 溶解后的 FSEC 谱图比较。请点击此处查看该图的放大版本。

FSEC 还被用于研究 5HT2AR 在不同条件下的长期稳定性。将GFP标记的人源5HT2AR从昆虫细胞膜中分别用去垢剂（DDM）或SMA聚合物溶解后，在4 °C或室温下储存，并在多个时间点进行FSEC分析（图5）。经过数天孵育后，无论在何种温度下，DDM中的5HT2AR单体峰高均显著下降，同时聚集体峰显著升高。相比之下，SMA脂质颗粒（SMALP）中的5HT2AR在整个实验过程中单体峰高未出现显著下降，表明该蛋白在SMALP中即使在不利温度下也能维持更长时间的稳定性。这一特性在考虑用于后续生物物理实验（如表面等离子共振（SPR）实验）的蛋白制备时可能具有重要意义，因为此类实验要求样品在较长时间内保持稳定和活性，以确保结合实验的成功完成。

色谱结果，第1-5天的信号分析；不同温度下DDM与SMALPs的比较图表
图5：时间与温度对使用DDM或SMALP从膜中提取的5HT2AR质量的影响（通过FSEC分析）。 （A）5HT2AR在DDM中溶解后于室温下保存1天（灰色）、2天（绿色）或5天（蓝色）的代表性FSEC图谱。 （B）DDM样品在4 °C（蓝色）或室温（绿色）保存，与SMALP样品在4 °C（灰色）或室温（黑色）保存的归一化单体峰高的柱状图。误差线代表标准误差（SEM）。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本文介绍的基于FSEC进行条件筛选的通用系统性方法，可快速优化膜蛋白生产的溶解和纯化参数。这意味着可以快速获得稳定且具有功能活性的膜蛋白，用于生物物理和结构研究。此外，FSEC可使用膜蛋白实验室中通常已配备的常规实验设备进行，因此无需购置专门仪器即可开展检测。

关键步骤
从使用去垢剂将蛋白从细胞中溶解出来，到样品上样至尺寸排阻色谱柱（SEC）之间的操作时间（步骤 2.1.5–3.2.5）极为关键，各步骤之间不得有任何停顿。所有操作均需在 4 ˚C 或冰上进行，且应尽可能缩短操作时间。这些时间和温度限制对于在膜蛋白发生潜在去折叠或降解之前获得其荧光尺寸排阻色谱（FSEC）图谱至关重要。膜蛋白一旦被溶解，即使在 4 ˚C 条件下，也更容易发生去折叠、聚集和降解。理想情况下，用于比较 FSEC 谱图的各样品，应在溶解后经过相同的时间间隔上样至 SEC 柱。在实际操作中，这具有一定难度，特别是当样品依次通过同一根色谱柱时；但可在 3 小时内连续收集最多五个 SEC 谱图，在此时间范围内，蛋白应不会发生显著降解。

故障排除
在进行FSEC实验时，如果荧光信号较弱或无信号，可能的原因包括：目标膜蛋白在所选细胞系中未表达、在所选细胞系中表达量极低，或未能在所选去垢剂中成功溶解。如果在采集荧光信号和记录FSEC图谱前对样品进行了稀释，可首先尝试降低稀释倍数或不稀释SEC组分。若仍无法获得可解读的FSEC图谱，则应检查蛋白的表达与溶解情况。

可通过在步骤 2.2.2 之后检测样品的荧光来分析蛋白表达情况。如果该样品的荧光信号非常弱或无信号（例如，信号接近背景水平），则蛋白表达可能存在问题。可采取一些措施来提高膜蛋白的表达水平，例如更换为其他细胞系，或调整培养条件、诱导表达条件，以及诱导/感染/转染与收获之间的时间间隔。然而，特别差的蛋白表达可能表明膜蛋白不稳定，因此提示构建体选择不佳。

如果在FSEC之前已检测过表达情况，并观察到明显高于背景的荧光信号，则可通过比较步骤2.4.3（可溶性膜蛋白）处理后样品与步骤2.2.2（总蛋白）处理后样品的剩余荧光信号，来评估溶解效率。通常情况下，即使溶解效率仅为20%-30%，仍可成功进行膜蛋白的分析与纯化。然而，若溶解效率低于20%，则可能需要更换不同的去垢剂或优化溶解条件。若尝试改善溶解效果仍不成功，则可能表明该膜蛋白本身特别不稳定，因此所选构建体可能不理想。

如果在FSEC谱图中观察到一个非常晚洗脱的峰（例如，18–24 mL），这表明荧光蛋白的分子量远低于预期值。这可能是由于目标膜蛋白发生降解，导致出现"游离"GFP。应通过凝胶内GFP荧光检测，在增溶前和增溶后检查目标蛋白是否保持完整。如果发现目标蛋白确实发生降解或蛋白水解，可将蛋白酶抑制剂的用量增加至原来的两到四倍。然而，若蛋白在增溶前即表现出对蛋白酶高度敏感或已发生降解，则提示该蛋白可能特别不稳定，因此所选构建体可能并非理想选择。

FSEC 的改进与进一步应用
通常，FSEC 中使用的荧光标签为 GFP 或 eGFP，如本方案所述。然而，目前已有多种不同的荧光蛋白标签可供选择。所选用的荧光标签取决于是否具备能够实现该标签所需激发和发射参数的酶标仪，以及所选荧光基团在不同环境条件下量子产率是否稳定、变化极小或无变化。此外，FSEC 不仅限于使用荧光蛋白，同样适用于经荧光染料标记的蛋白质。例如，可使用 NTA 染料，其可优先结合带有组氨酸标签的膜蛋白构建体。此外，也可通过荧光标记的抗体对目标蛋白进行间接标记，该抗体经化学方法连接荧光染料，并特异性结合目标膜蛋白，或利用膜蛋白构建体中包含的纯化标签进行间接荧光标记，从而实现 FSEC 检测。

在使用FSEC进行去垢剂筛选时，可以选择在运行SEC色谱柱时所用的缓冲液中是否含有使目标蛋白溶解的对应去垢剂，或者在所有运行中统一使用一种标准去垢剂。如果整个实验全程使用与蛋白溶解相匹配的去垢剂，则能更准确地反映蛋白的行为特性。然而，若每次运行前都需要用新的去垢剂重新平衡色谱柱，则可能耗时且浪费去垢剂。此外，由于去垢剂筛选的主要目的是比较洗脱图谱，即使条件并非理想，图谱中的趋势仍会保持一致。因此，可采取折中方案：将蛋白在目标去垢剂中溶解，但在所有运行中均使用含单一标准去垢剂（例如DDM）的缓冲液进行色谱柱分离11，从而节省时间和去垢剂消耗。

通过调整所使用的FLPC设备，FSEC方案的通量可显著提高，同时最小化样品需求量。例如，可为FPLC或HPLC系统配备自动进样器、较小床体积的分析柱（如3.2 mL的分析型SEC柱）以及在线荧光检测器，以直接监测来自色谱柱的连续FSEC图谱。该配置可实现在更短时间内完成更多FSEC运行，并省去手动绘图步骤，从而在更短的时间内测试更多实验条件。此外，样品需求量将进一步减少，因为每次运行所需的样品制备和上样量均减少。这将为表达培养体系转向基于培养板的格式提供可能，因为分析所需材料极少。

与其它方法相比，FSEC 的优势与局限性
FSEC 的一个缺点是需要对膜蛋白构建体进行设计以引入荧光标记，而标记的引入存在较小的可能性会干扰目标膜蛋白的功能或折叠。此外，本文所述的 FSEC 方案是在细胞裂解液（一种粗提的蛋白质混合物）存在的情况下监测膜蛋白的特性。在这种环境中，膜蛋白的行为可能与其在纯化末期经制备型 SEC 柱完全分离于其他蛋白后的行为有所不同。此外，FSEC 对蛋白质量的评估在一定程度上是定性的。然而，如方案中第 4.3.3 步所述，通过将 FSEC 谱图转换为单分散性指数，可以获得对蛋白质量的定量评估。

FSEC 并非唯一可用于膜蛋白构建体、溶解条件及纯化缓冲液组成的早期分析方法。其他替代方法相较于 FSEC 各有优缺点。例如，已有基于荧光探针的热稳定性检测方法，特别是使用染料 7-二乙氨基-3-(4′-马来酰亚胺基苯基)-4-甲基香豆素（CPM）16,17。该方法的优点在于，与 FSEC 仅能提供蛋白质量的定性评估不同，热稳定性检测可提供以相对熔解温度形式呈现的定量结果。此外，该方法无需在蛋白构建体上引入荧光标签。然而，与 FSEC 相比，热稳定性检测的缺点在于必须使用纯化的蛋白，且该检测并非适用于所有蛋白构建体，因其依赖于天然半胱氨酸残基在折叠蛋白中的有利位置。

另一种与FSEC和基于荧光团的热稳定性检测方法相似的技术是测量膜蛋白温度敏感性的检测方法。在该方法中，蛋白经受不同温度处理后，通过离心保留于上清液中的蛋白被检测出来。该方法的检测可通过多种方式进行，包括测量溶液中的荧光信号18、SDS-PAGE凝胶条带的荧光19，或Western印迹中的信号强度20。然而，这些方法的一个显著缺点是实验过程非常耗时，且结果容易产生较高背景噪声，因为每个温度点都必须独立收集数据。

最后，还可以采用几种更高级的生物物理技术以类似于FSEC的方式评估膜蛋白的质量，例如流动诱导分散分析21、微尺度热泳22或表面等离子共振（SPR）。尽管这些方法非常强大，但其缺点在于需要使用高度专业化的仪器来进行分析。

总之，FSEC 为膜蛋白生产提供了极为宝贵的工具。尽管它并非唯一的选择，但相较于其他方法具有若干显著优势，如上所述。建议始终通过正交检测对结果进行交叉验证，且上述各种方法之间并非相互排斥。

披露

Peak Proteins 是一家合同研究组织，提供有偿的蛋白质表达、纯化、质谱分析和结构测定服务。

致谢

我们谨向整个Peak Proteins团队提供的帮助与支持表示感谢。来自细胞科学团队的成员中，我们特别感谢Ian Hampton在昆虫细胞表达方面提供的宝贵见解和指导。我们还要感谢Mark Abbott为开展本项目所提供的资源和机会。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 mL 和 5 mL 塑料注射器 Generic - 用于样品转移的注射器 
10x 无EDTA蛋白酶抑制剂混合液Abcamab201111蛋白酶抑制剂
15 mL 离心管  Generic - 用于沉淀制备和溶解的 15 mL 离心管  
2 mL 超速离心管Beckman Coulter 344625 适用于超速离心转子的离心管 
50 mL 离心管Generic - 用于细胞收集的 50 mL 离心管 
96 孔深孔板 Greiner15922302用于收集 0.2 mL SEC 洗脱组分 
ÄKTA  V9-L 样品环阀Cytiva 29011358用于 ÄKTA FPLC 系统的五位样品环阀 
ÄKTA F9-C 组分收集器Cytiva 29027743用于 ÄKTA FPLC 系统的六位板式组分收集器
ÄKTA pure 25 LCytiva 29018224 用于运行实验的 FPLC 系统 
台式离心机（例如 Fisherbrand GT4 3L）  Fisher Scientific 15828722 用于低速离心的离心机 
钝头填充针 Generic - 用于样品转移 
瓶顶式真空过滤器 Corning10005490用于过滤 SEC 缓冲液的瓶顶式真空过滤器
胆固醇半琥珀酸酯（CHS） Generon CH210-5GM 用于去垢剂溶解的添加剂  
一次性多通道储液槽 Generic - 用于向 96 孔微孔板中添加水或缓冲液的储液槽
十二烷基麦芽糖苷（DDM） Glycon D97002-C-25g 用于溶解的去垢剂 
eGFP 蛋白标准品BioVisionK815-100用于荧光校准曲线的 eGFP 标准品 
甘油Thermo Scientific 11443297用于缓冲液配制的甘油
HEPESThermo Scientific 10411451用于缓冲液配制的 HEPES
高分子量 SEC 校准标准品试剂盒Cytiva 28403842用于 SEC 的分子量校准试剂盒
月桂基麦芽糖新戊二醇（LMNG） Generon NB-19-0055-5G 用于溶解的去垢剂 
低分子量 SEC 校准标准品试剂盒 Cytiva 28403841用于 SEC 的分子量校准试剂盒
MLA-130 超速离心转子Beckman Coulter 367114 适用于 2 mL 容量离心管的超速离心转子
不透明平底 96 孔微孔板 Corning10656853用于在酶标仪中读取荧光信号的 96 孔板 
Optima MAX-XP 超速离心机Beckman Coulter 393315 用于高速离心的离心机 
pH 计Generic - 用于在缓冲液配制过程中调节 pH
PrismGraphPad- 用于绘制曲线图的绘图软件
旋转混合仪 Fisher Scientific 12027144 用于低温下翻转混合的混合仪 
氯化钠Fisher Scientific 10316943用于缓冲液配制的氯化钠
氢氧化钠Fisher Scientific 10488790用于缓冲液配制的氢氧化钠
Spectramax ID3 酶标仪Molecular Devices735-0391可读取荧光信号的微孔板读板仪
磁力搅拌器Generic - 用于在缓冲液配制过程中进行搅拌
苯乙烯-马来酸（SMA） Orbiscope SMALP 300 用于无去垢剂提取的聚合物 
Superdex 200 Increase 10/300 GL Cytiva 28990944 用于运行实验的 SEC 色谱柱。该色谱柱的柱床体积为 24 mL。推荐流速为 0.9 mL/min（以水为流动相，4 °C）。该色谱柱的最大耐压为 5 MPa。
真空泵Sartorius16694-2-50-06用于缓冲液的过滤和脱气

参考文献

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快速评估膜蛋白质量的荧光尺寸排阻色谱法
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