本文介绍了一种用于清醒、头部固定的 rats 功能成像的详细新方法。
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本文内容
摘要
摘要
麻醉剂在临床前和基础科学研究中常用，但会对大脑的代谢、神经元和血管功能产生抑制作用，可能对神经生理学研究结果产生不利影响。使用清醒动物进行研究具有优势，但主要挑战在于如何使动物保持安静和静止，以最大限度地减少数据采集过程中的运动伪影。清醒状态下成像在体型较小的啮齿类动物（如小鼠）中较为常见，但在大鼠中仍较少见，因为大鼠体型更大、力量更强，且在成像所需的较长时间内更倾向于抗拒运动限制和头部固定。本文介绍了一种针对清醒、头部固定的 rats 的新型神经成像模型，该模型采用定制的手工缝制吊带、3D打印的头部植入物、头帽和头架。单次单根胡须刺激试验所获得的结果表明，诱发的功能性反应强度有所增强。与麻醉状态下的大鼠相比，从清醒、头部固定的大鼠获取诱发功能性反应的速度更快，结果可靠、可重复，并可用于多次纵向研究。
引言
大多数基础性、临床前及转化神经影像学研究的数据均来自麻醉状态下的动物1,2。麻醉虽便于实验操作，但会持续影响大脑和机体的代谢、血压及心率3。麻醉剂的种类、给药持续时间及给药途径会引入混杂变量，可能影响研究结果的可重复性及转化应用的成功率4。清醒状态下固定头部的大鼠神经影像学研究面临的主要瓶颈在于，需要在整个准备过程和数据采集过程中保持大鼠静止且镇静。微小的运动即可产生不必要的运动伪影，从而对数据分析与结果解释产生不利影响。
一种利用定制吊带、三维（3D）打印的颅骨植入物、头帽和头架，在清醒且头部固定的的大鼠中进行神经影像学研究的新模型已被开发出来，该模型具有多项优势，便于实验操作。该3D颅骨植入物重量轻，仅覆盖固定所需的颅骨小部分区域。3D打印的颅骨植入物和头帽均使用计算机辅助设计（CAD）软件进行设计。有关胡须刺激、数据采集、数据分析以及在麻醉大鼠中获得的结果的详细实验方案已在先前的研究中进行了描述5,6,7。
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方案
所有操作均符合美国国立卫生研究院指南，并经加州大学欧文分校动物护理和使用委员会批准。本研究使用了七只雄性大鼠和一只雌性大鼠（Sprague-Dawley品系，体重：185–350 g）。研究结束后，采用过量二氧化碳处死大鼠。
1. 不同组分的设计
- 头植入物的设计：
- 使用CAD软件设计头植入物（图1C），并将其设计为可对前囟后方、靠近中线且以体感皮层为中心的区域进行成像。确保头植入物在颅骨上覆盖距离成像区域0.9 mm至1.9 mm的范围。
- 仅使用三颗螺钉将头植入物固定在大鼠颅骨上。所有螺钉孔应设计在成像半球对侧半球的中线对侧，以保持在中线的相反一侧。
- 在头植入物的上部设置一根内部中空的横杆，以便通过导线将头帽固定在头植入物上，如图1D所示。
- 头帽的设计：
- 确保头帽完全覆盖成像区域，并保护其免受任何形式的创伤，如图1A、B所示。为头帽添加弧度，使其与头部形状贴合，同时不影响动物在标准丰富化笼具中的日常活动。
- 将头帽内侧切割成较宽的矩形，以便头植入物的上....
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结果
单次试验中麻醉大鼠的代表性光学成像信号以及清醒大鼠40次试验的叠加反应结果如（图4）所示。清醒大鼠单根胡须刺激所产生的信号强度可在比麻醉大鼠更高的阈值下被观察到，表明清醒动物的信号更强。实验中以5 Hz频率对大鼠C2胡须刺激1秒，功能反应以相对于基线的信号变化率表示。图像中较暗的区域（低于负阈值）代表主要的神经元活动区域，而较亮的白色区域（高于正阈值）则显示刺激引发的氧合血红蛋白反应9。图像方位已对齐，从左至右为头端到尾端（C），从上至下为内侧到外侧（L），如箭头所示。
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讨论
使用清醒状态下头部固定的的大鼠进行成像在操作便捷性和可定制性方面具有诸多优势。定制设计的吊带可通过透气的网状材料将大鼠包裹，从而避免将动物长时间封闭在密闭的塑料固定装置中10,11。在整个连续成像过程中，通过使用远低于大鼠轻度镇静剂量的乙酰丙嗪（1.0–2.5 mg/kg），可使大鼠保持镇静且无应激状态12。为了保持大鼠稳定并进一步消除成像过程中的运动伪影，采用魔术贴条带进行固定。魔术贴条带之间的间距设置为3–6 mm，以避免长时间束缚导致的身体过度受限。大鼠在幼龄阶段即开始接受吊带训练和适应，以确保其在准备阶段和数据采集期间能够安静、舒适地静卧于吊带中。根据初步实验结果，体重约为150–175 g的幼龄大鼠相比成年大鼠更易于且更快完成训练。
大鼠头部的植入物重量仅为0.174 g，可拆卸的头帽重量为1.483 g。植入物覆盖单侧半球0.5 cm至1.5 cm的区域，使对侧半球完全可用于神经影像学检查。头帽的尺寸可确保.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
感谢Clara Jones、James Stirwalt、Linh Hoang、Young Joon Ha和Amirsoheil Zareh在大鼠训练及吊带制备过程中的帮助。本研究由美国国立卫生研究院（NIH，资助号：NS119852）和Leducq基金会（资助号：15CVD02）提供资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 大鼠 | 查尔斯河实验室 | 斯普拉格-道利 | |
| 异氟烷 | Pivetal | 21295098 | 全身麻醉药 |
| 盐酸利多卡因2%注射液 | 凤凰 | L-2000-04 | 局部麻醉药 |
| 硫酸阿托品注射液 | Vedco | 5098907512 | 呼吸支持 |
| 乳酸林格氏注射液 | Vedco | 50989088317 | |
| 氟尼辛注射液 | Vedco | 6064408670 | 疼痛管理 |
| 恩诺沙星注射液（恩诺沙星 2.27%） | VetOne | 501084 | 避免感染 |
| PromAce 注射液（马来酸乙酰丙嗪） | 勃林格殷格翰 | 136059 | |
| Animax 软膏 | 德克拉动物保健产品 | 122-75 | 每克含制霉菌素1000单位、硫酸新霉素2.5mg、硫链丝菌素2500单位和曲安奈德1mg |
| Puralube 眼科软膏 | 德克拉动物保健产品 | 211-38 | |
| 聚维酮碘（PVP-I）消毒垫 | Medline | MDS093917 | 聚维酮碘通用名 |
| 异丙醇擦拭棉片 | BD | 326895 | |
| Vetbond 组织粘合剂 | 3M | 1469SB | |
| 钻头（牙科车针），标准牙科用碳化钨 | SS White 磨头 | 14829 | #3 钻头 |
| 螺丝，00-90 × 1/8，平头，不锈钢 | J.I. Morris | F0090CE125 | 锚定螺钉 |
| 立体定位系统 | Kopf Instruments | 1430 | |
| 恒温加热毯 | 哈佛仪器 | 50-7220-F | |
| 脉搏血氧仪 &和心率监测器 | Kent Scientific | MouseStat Jr. | |
| 凡士林 | Fisher Scientific | P66-1LB | 凡士林通用型 |
| 裸铜线 | Fisher Scientific | 15-545-2C | 20 号 |
| Teets感冒冲剂粉末 | Pearson Dental | C73-0054 | 活性成分：甲基丙烯酸甲酯 |
| Teets感冒灵口服液 | Pearson Dental | C73-0078 | 活性成分：甲基丙烯酸甲酯 |
| 硅胶模具橡胶 | Smooth-On | 身体双倍快速 | 硅聚合物 |
| MetriCide 28（杀菌剂） | Metrex | 10月5日 | |
| 印度墨水，黑色 | Pelikan | 301051 | |
| 牙科钻头 | NSK Dental | Ultimate XL-F | |
| 3D 打印机 | Prusa Research | i3 MK3S+ | |
| 缝合固定装置 | 魔术贴 | 90030 | |
| 宠物筛查实用织物 | 乔安 | 10173334 | 网状材料 |
| 钻头（牙科车针），标准牙科碳化钨钻头 | SS White 磨头 | 14829 | #1 bur |
参考文献
- Cicero, L., Fazzotta, S., Palumbo, V. D., Cassata, G., Lo Monte, A. I. Anesthesia protocols in laboratory animals used for scientific purposes. Acta Biomedica. 89 (3), 337-342 (2018).
- Lythgoe, M. F., Sibson, N. R., Harris, N. G. Neuroimaging of animal models of brain disease. B....
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重印与许可
