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方法文章

清醒固定头部大鼠神经成像用头部植入装置

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DOI：

10.3791/64324

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2022年9月7日

 ,  ,  , 
1Department of Neurobiology and Behavior, School of Biological Sciences, University of California Irvine, 2Department of Biomedical Engineering, School of Engineering, University of California, Irvine, 33Center for Neurobiology of Learning and Memory, University of California, Irvine

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于清醒、头部固定的 rats 功能成像的详细新方法。

摘要

麻醉剂在临床前和基础科学研究中常用，但会对大脑的代谢、神经元和血管功能产生抑制作用，可能对神经生理学研究结果产生不利影响。使用清醒动物进行研究具有优势，但主要挑战在于如何使动物保持安静和静止，以最大限度地减少数据采集过程中的运动伪影。清醒状态下成像在体型较小的啮齿类动物（如小鼠）中较为常见，但在大鼠中仍较少见，因为大鼠体型更大、力量更强，且在成像所需的较长时间内更倾向于抗拒运动限制和头部固定。本文介绍了一种针对清醒、头部固定的 rats 的新型神经成像模型，该模型采用定制的手工缝制吊带、3D打印的头部植入物、头帽和头架。单次单根胡须刺激试验所获得的结果表明，诱发的功能性反应强度有所增强。与麻醉状态下的大鼠相比，从清醒、头部固定的大鼠获取诱发功能性反应的速度更快，结果可靠、可重复，并可用于多次纵向研究。

引言

大多数基础性、临床前及转化神经影像学研究的数据均来自麻醉状态下的动物1,2。麻醉虽便于实验操作，但会持续影响大脑和机体的代谢、血压及心率3。麻醉剂的种类、给药持续时间及给药途径会引入混杂变量，可能影响研究结果的可重复性及转化应用的成功率4。清醒状态下固定头部的大鼠神经影像学研究面临的主要瓶颈在于，需要在整个准备过程和数据采集过程中保持大鼠静止且镇静。微小的运动即可产生不必要的运动伪影，从而对数据分析与结果解释产生不利影响。

一种利用定制吊带、三维（3D）打印的颅骨植入物、头帽和头架，在清醒且头部固定的的大鼠中进行神经影像学研究的新模型已被开发出来，该模型具有多项优势，便于实验操作。该3D颅骨植入物重量轻，仅覆盖固定所需的颅骨小部分区域。3D打印的颅骨植入物和头帽均使用计算机辅助设计（CAD）软件进行设计。有关胡须刺激、数据采集、数据分析以及在麻醉大鼠中获得的结果的详细实验方案已在先前的研究中进行了描述5,6,7。

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方案

所有操作均符合美国国立卫生研究院指南，并经加州大学欧文分校动物护理和使用委员会批准。本研究使用了七只雄性大鼠和一只雌性大鼠（Sprague-Dawley品系，体重：185–350 g）。研究结束后，采用过量二氧化碳处死大鼠。

1. 不同组分的设计

  1. 头植入物的设计：
    1. 使用CAD软件设计头植入物（图1C），并将其设计为可对前囟后方、靠近中线且以体感皮层为中心的区域进行成像。确保头植入物在颅骨上覆盖距离成像区域0.9 mm至1.9 mm的范围。
    2. 仅使用三颗螺钉将头植入物固定在大鼠颅骨上。所有螺钉孔应设计在成像半球对侧半球的中线对侧，以保持在中线的相反一侧。
    3. 在头植入物的上部设置一根内部中空的横杆，以便通过导线将头帽固定在头植入物上，如图1D所示。
  2. 头帽的设计：
    1. 确保头帽完全覆盖成像区域，并保护其免受任何形式的创伤，如图1A、B所示。为头帽添加弧度，使其与头部形状贴合，同时不影响动物在标准丰富化笼具中的日常活动。
    2. 将头帽内侧切割成较宽的矩形，以便头植入物的上部可嵌入其中，如图1E所示。垂直于该矩形，再切割两个矩形区域，用于将头帽固定在头植入物上。
    3. 将一根导线穿过头植入物上方的中空横杆，以将头帽固定在大鼠头部，如图1E-G所示。以相同方式穿入第二根导线。
      注：这些导线可使用钳子或镊子轻松移除。3D打印文件（文件格式：STL）作为补充文件1和补充文件2提供。
  3. 头架的设计：
    1. 设计头架时，使其一个切口部分能够穿过头植入物的上部横杆，并通过夹具固定。
    2. 将另一个切口部分倾斜，以增强固定大鼠头部的稳定性，使对侧完全暴露以便成像。在本研究中，使用剪钳切割钢板以制作头架（图1H、I）。
      注：该部件也可采用3D打印方式制作。

2. 大鼠初始训练

  1. 将大鼠置于笼中，在动物房环境中适应 2-3 天。
  2. 在安静的房间内开始对大鼠进行抓取训练。打开笼子，实验人员将手放入笼内靠近大鼠处，持续 15-20 分钟，使大鼠逐渐习惯。
  3. 当大鼠不再受惊或躲避实验人员的手，并表现出平静状态时，可轻柔地将其抓起进行操作。在吊带训练前，每天抓取操作 30-45 分钟。

3. 悬吊训练

  1. 在植入头部装置和头帽手术前，至少对大鼠进行2-3天的吊带训练。
  2. 按照图2A所示布置吊带装置，并使用乙醇擦拭清洁吊带装置。
    注意：所有吊带均为手工缝制，底部或两侧均采用网状材料，如图2A、B所示。
  3. 进行吊带训练时，使用4%异氟烷诱导麻醉，1%维持麻醉，直至大鼠后肢无夹趾反射。
  4. 在异氟烷麻醉下，将大鼠置于一块尺寸为20 cm × 8 cm（长×宽）的柔性塑料片上，其中10 cm × 8 cm的区域完全覆盖有尼龙搭扣的柔软部分。
    注意：对大鼠进行吊带训练时实施麻醉为可选步骤，主要用于减轻其应激和焦虑。
  5. 训练的前两天，将大鼠头部从婴儿袜（尺寸0-3个月）末端剪开的小孔中穿出，身体 snug 地套入袜中。
  6. 用一小块吸水垫包裹大鼠下半身，以保持干燥并收集排泄物。
  7. 用一块透气棉布（尺寸：25 cm × 25 cm）将大鼠包裹起来，并将其放置在粘有尼龙搭扣条的塑料片上。
  8. 使用宽0.5 cm的尼龙搭扣条，以彼此间隔3-6 mm的距离进一步将大鼠固定在塑料片上。
  9. 将大鼠稳妥固定在吊带中，撤除气体麻醉，让大鼠在吊带中恢复清醒。
  10. 当大鼠开始运动胡须时，每隔10-15分钟给予几滴10%蔗糖溶液作为奖励。
  11. 随机向大鼠呈现成像过程中将使用的感官刺激（此处为胡须刺激，每15-25分钟一次），使其适应这些感官刺激。在随机时间间隔手动刺激其胡须。
  12. 如图2C所示，第1天训练1小时，第2天训练2小时，第3天训练3小时。

4. 术前准备

  1. 使用3D打印机打印头部植入物和头帽（图1）。
  2. 将所有手术器械和头部组件（植入物和头帽）浸入Metricide28 消毒剂中10小时进行灭菌。手术前用无菌水彻底冲洗器械。
  3. 用4%异氟烷暴露大鼠，随后维持在1%-2%异氟烷浓度，直至后肢足底夹捏反射消失。 本手术可采用多种麻醉方式，例如异氟烷、戊巴比妥钠或氯胺酮-赛拉嗪组合。
  4. 肌肉注射阿托品（0.05 mg/kg），以减少黏液分泌，辅助呼吸。
  5. 使用修毛器从两眼之间至耳后区域，沿中线为中心剃除大鼠头部约5 mm范围的毛发。
  6. 将脉搏血氧仪和心率监测探头固定于大鼠后肢，持续监测血氧饱和度和心率。
  7. 使用聚维酮碘和70%酒精棉片交替擦拭大鼠头部及周围区域，共擦拭三次。
  8. 将大鼠固定于立体定位仪中。
  9. 插入凡士林润滑的直肠探头，测量大鼠体温，并通过加热毯的反馈系统维持体温，防止麻醉后低体温。
  10. 在手术部位皮下注射盐酸利多卡因局部麻醉剂，浓度为20 mg/mL，剂量为0.07 mg/kg ±0.2体重。
  11. 在双眼涂抹眼用软膏，防止角膜干燥。
  12. 在手术区域皮下注射2%局部麻醉剂。
  13. 皮下注射3 mL室温乳酸林格液，以预防脱水并在手术期间提供营养支持。

5. 手术

  1. 使用锋利的手术剪在头部中线中心位置去除手术区域的皮肤（直径4 mm），并在头部颞区耳眼之间去除左侧体感皮层上方的部分皮肤（约2 mm直径）。
  2. 使用手术刀去除下方的皮肤（骨膜）组织以暴露颅骨。用无菌棉纱布清洁颅骨。
  3. 剥离或切除颞肌，以暴露成像区域所需的大小[本研究为7.5 mm × 7.5 mm]。 
  4. 暴露对侧半球的颅骨以安装头件。将头件放置在颅骨上，以确定头件固定螺钉的位置，如图2D-F所示。
  5. 使用印度墨水和钻头1在颅骨上标记螺钉钻孔位置。使用牙科钻头3钻出螺钉用的骨孔，并将头件用螺钉固定。
  6. 用无菌纱布干燥颅骨。在头件周围及下方涂抹一层薄薄的组织粘合剂，将其粘附于颅骨上。再涂布一层牙科水泥以进一步加固头件，并让水泥干燥2–3分钟。
    注：使用组织粘合剂结合牙科水泥可确保牢固固定8。
  7. 使用牙科钻头3，在颅骨左侧、前囟后方且偏离中线的区域，磨薄一块7.5 mm × 7.5 mm的区域。将颅骨磨薄至约50 µm，如图3A所示。
  8. 在手术区域涂抹局部抗生素软膏，然后覆盖一层薄的硅橡胶以保护磨薄的颅骨，如图3B所示。使用头帽覆盖手术区域，如图3C所示。通过两根细金属丝穿过头件和头帽将其固定，如图3D、E所示。再涂抹硅橡胶覆盖头帽和颅骨，以进一步稳定大鼠头部的头帽，如图3F所示。
    注：硅橡胶为磨薄的颅骨提供额外保护。
  9. 皮下注射氟尼辛葡甲胺（2.5 mg/kg）以控制大鼠的疼痛和炎症。 为预防感染，腹腔注射Enrosite抗生素恩诺沙星（22.7 mg/mL，10 mg/kg ± 0.01）。
  10. 将大鼠转移至恢复室，使用加热毯和加热灯帮助维持其体温。持续监测大鼠，直至其恢复意识并能维持胸卧位。
  11. 待大鼠完全恢复后，将其放回单独的笼子中。
  12. 术后连续3天，每天两次给予氟尼辛和布托啡诺以减轻炎症和疼痛，并给予Enrosite以预防感染。

6. 清醒状态成像

  1. 使用4%异氟烷进行诱导麻醉，当无后肢足垫夹捏反射时，以1%异氟烷维持麻醉。皮下注射乙酰丙嗪（0.3–0.5 mg/kg）。
    注意：该浓度的乙酰丙嗪低于轻度镇静水平，仅有助于在整个成像过程中保持大鼠镇静。
  2. 使用定制的维可牢尼龙搭扣条带，将大鼠固定在训练过程中使用的塑料板上。用吸水垫包裹大鼠下半身，并将其稳妥地置于吊带中。
  3. 移除硅橡胶。通过拆除固定钢丝取下头部帽。将头架固定在头颅植入物中，如图2G所示。
  4. 将头架锁紧在夹具中，如图2H、I所示。
  5. 停止气体麻醉。用生理盐水冲洗成像区域3次，并用湿纱布清洁。干燥成像区域，并使用凡士林在成像区域周围构建一个围堰。将围堰内充满灭菌生理盐水，并覆盖盖玻片（图2E）。
  6. 有关内在信号光学成像的采集流程、胡须刺激方案以及数据分析与呈现方法，请参见先前详细讨论的文献6,7。
  7. 在整个实验过程中，监测大鼠是否出现躁动和不安迹象；可通过使用软布或纱布覆盖大鼠眼睛进一步减轻此类行为（可选）。

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结果

单次试验中麻醉大鼠的代表性光学成像信号以及清醒大鼠40次试验的叠加反应结果如（图4）所示。清醒大鼠单根胡须刺激所产生的信号强度可在比麻醉大鼠更高的阈值下被观察到，表明清醒动物的信号更强。实验中以5 Hz频率对大鼠C2胡须刺激1秒，功能反应以相对于基线的信号变化率表示。图像中较暗的区域（低于负阈值）代表主要的神经元活动区域，而较亮的白色区域（高于正阈值）则显示刺激引发的氧合血红蛋白反应9。图像方位已对齐，从左至右为头端到尾端（C），从上至下为内侧到外侧（L），如箭头所示。

3D打印机校准，红色塑料部件，精密测量，公差测试，原型零件

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讨论

使用清醒状态下头部固定的的大鼠进行成像在操作便捷性和可定制性方面具有诸多优势。定制设计的吊带可通过透气的网状材料将大鼠包裹，从而避免将动物长时间封闭在密闭的塑料固定装置中10,11。在整个连续成像过程中，通过使用远低于大鼠轻度镇静剂量的乙酰丙嗪（1.0–2.5 mg/kg），可使大鼠保持镇静且无应激状态12。为了保持大鼠稳定并进一步消除成像过程中的运动伪影，采用魔术贴条带进行固定。魔术贴条带之间的间距设置为3–6 mm，以避免长时间束缚导致的身体过度受限。大鼠在幼龄阶段即开始接受吊带训练和适应，以确保其在准备阶段和数据采集期间能够安静、舒适地静卧于吊带中。根据初步实验结果，体重约为150–175 g的幼龄大鼠相比成年大鼠更易于且更快完成训练。

大鼠头部的植入物重量仅为0.174 g，可拆卸的头帽重量为1.483 g。植入物覆盖单侧半球0.5 cm至1.5 cm的区域，使对侧半球完全可用于神经影像学检查。头帽的尺寸可确保...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

感谢Clara Jones、James Stirwalt、Linh Hoang、Young Joon Ha和Amirsoheil Zareh在大鼠训练及吊带制备过程中的帮助。本研究由美国国立卫生研究院（NIH，资助号：NS119852）和Leducq基金会（资助号：15CVD02）提供资金支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
大鼠查尔斯河实验室斯普拉格-道利
异氟烷Pivetal21295098全身麻醉药
盐酸利多卡因2%注射液凤凰L-2000-04局部麻醉药
硫酸阿托品注射液Vedco5098907512呼吸支持
乳酸林格氏注射液Vedco50989088317
氟尼辛注射液Vedco6064408670疼痛管理
恩诺沙星注射液（恩诺沙星 2.27%）VetOne501084避免感染
PromAce 注射液（马来酸乙酰丙嗪）勃林格殷格翰136059
Animax 软膏德克拉动物保健产品122-75每克含制霉菌素1000单位、硫酸新霉素2.5mg、硫链丝菌素2500单位和曲安奈德1mg
Puralube 眼科软膏德克拉动物保健产品211-38
聚维酮碘（PVP-I）消毒垫MedlineMDS093917聚维酮碘通用名
异丙醇擦拭棉片BD326895
Vetbond 组织粘合剂3M1469SB
钻头（牙科车针），标准牙科用碳化钨SS White 磨头14829#3 钻头
螺丝，00-90 × 1/8，平头，不锈钢J.I. MorrisF0090CE125锚定螺钉
立体定位系统Kopf Instruments1430
恒温加热毯哈佛仪器50-7220-F
脉搏血氧仪 &和心率监测器Kent ScientificMouseStat Jr.
凡士林Fisher ScientificP66-1LB凡士林通用型
裸铜线Fisher Scientific15-545-2C20 号
Teets感冒冲剂粉末Pearson DentalC73-0054 活性成分：甲基丙烯酸甲酯
Teets感冒灵口服液Pearson DentalC73-0078 活性成分：甲基丙烯酸甲酯
硅胶模具橡胶Smooth-On身体双倍快速硅聚合物
MetriCide 28（杀菌剂）Metrex10月5日
印度墨水，黑色Pelikan301051
牙科钻头NSK DentalUltimate XL-F
3D 打印机Prusa Researchi3 MK3S+
缝合固定装置魔术贴90030
宠物筛查实用织物乔安10173334网状材料
钻头（牙科车针），标准牙科碳化钨钻头SS White 磨头14829#1 bur

参考文献

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