从临床样本中自动分离与收集癌症相关物质

摘要

本文介绍了利用自动化设备从全血中简便高效地分离和收集无细胞DNA及循环肿瘤细胞等物质的方法。

摘要

近年来，液体活检已被用于诊断多种疾病，包括癌症。体液中含有许多物质，这些物质来源于正常组织，包括细胞、蛋白质和核酸，但也有一些物质来源于病变区域。对体液中这些物质的检测与分析在多种疾病的诊断中发挥着关键作用。因此，准确分离所需物质至关重要，目前已有多种技术被开发用于实现这一目的。

我们开发了一种名为CD-PRIME的光盘式实验室设备与平台。该设备具有自动化优势，在样本污染和样本稳定性方面表现良好。此外，它还具备提取得率高、操作时间短以及重复性高的优点。同时，根据所安装光盘的类型，可分离含有游离DNA的血浆、循环肿瘤细胞、外周血单个核细胞或血沉棕黄层。因此，可从体液中获取多种材料，用于包括组学研究在内的多种下游应用。

引言

多种疾病（包括癌症）的早期和准确检测是制定治疗策略的最重要因素^1,2,3,4。特别是癌症的早期检测与患者生存几率的提高密切相关^5,6,7,8。近年来，液体活检在癌症早期检测中备受关注。实体瘤会经历血管生成，并向血液中释放多种物质。特别是已在癌症患者血液中检测到循环DNA（ctDNA）、循环RNA（ctRNA）、蛋白质、外泌体等囊泡以及循环肿瘤细胞（CTCs）^2,9。尽管这些物质的含量存在个体差异，但它们不仅在疾病早期阶段，而且在晚期阶段也持续存在^6,10。然而，个体间差异非常显著；例如，含有ctDNA的游离DNA（cfDNA）含量低于1,000 ng，而在10 mL癌症患者的全血中，CTC数量....

方案

所有全血样本均来自肺癌患者。Clinomics 公司的癌症基因组学研究所负责开展研究与分析工作，政府机构的 IRB 研究审批由阿山医疗中心机构审查委员会（IRB 编号：2021-0802）主导，并已注册 Clinomics 研究所用的 IRB 编号。

1. 样品制备

1. 将9 mL全血收集至EDTA或cfDNA稳定型采血管中。
2. 通过上下颠倒混匀约10次，充分混匀。
3. 将样本储存在室温（RT；用于短期储存）或4 °C（用于长期储存）。禁止反复冻融。

2. 设备准备

1. 按下电源开关以开启仪器。
   注意：触摸屏上将显示加载界面，仪器开始初始化。初始化过程中请勿将手靠近仪器。仪器初始化完成后，将出现试剂盒选择界面。
2. 选择要使用的样本模式。通过按箭头按钮更改样本数量。

3. 设备操作与样本采集

1. LBx-1 载样卡盒的装载
   1. 在仪器的触摸屏面板上选择卡盒类型。通过按压箭头按钮更改样本数量。
   2. 打开仪器门，按照卡盒支架上的编号顺序插入所有要使用的卡盒。务必正确插入卡盒和卡盒支架....

结果

该技术的目标是从全血中简便、自动地分离出与癌症相关的物质。尤其适用于任何人在各类合适的研究和分析领域中使用。在单个血液样本中同时且可重复地分离多种物质，对于液体活检具有重要意义。LBx-1 和 LBx-2 碟片用于从全血中分离血浆以及血沉棕黄层或外周血单个核细胞（PBMC）。图1展示了该装置分离出的物质。首先，使用 LBx-1 从 10 mL 血液中获取血浆，或使用 LBx-2 获取 PBMC。其次，将分离出的 3 mL 血沉棕黄层用 PBS 重新注入 FAST-auto 中，循环肿瘤细胞（CTC）通过膜被过滤出来。第三步，将膜转移至装有保存缓冲液的试管中，或立即用于染色。对于其他应用或长期保存，可通过涡旋振荡轻松将 CTC 从膜上洗脱下来。

使用基于磁珠的DNA分离方法从血浆中提取cfDNA，该方法能够通过调节磁珠浓度实现按大小捕获DNA。采用Bioanalyzer检测cfDNA的浓度和纯度。众所周知，包括ctDNA在内的cfDNA浓度因癌症类型和分期的不同而有所差异¹⁸。.......

讨论

循环游离DNA（cfDNA）和循环肿瘤细胞（CTC）的含量和浓度取决于个体差异、癌症的分期及类型，同时也受患者身体状况的影响^2,4,5,10,20。特别是在癌症的早期或癌前阶段，与癌症相关的物质浓度极低，因此存在难以被检测到的高风险。然而，早期发现对患者的生存率以及治疗策略的制定具有极为积极的作用。由于cfDNA和CTC在血液中的半衰期较短，它们能够反映癌症的实时状态^{21,22,23,24,25}

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1% BSA（牛血清白蛋白）	Sigma-Aldrich	A3059
1.5 mL 微量离心管	Axygen	MCT-150-C-S
15 mL 锥形管	SPL	50015
4150 TapeStation 系统	Agilent	G2992AA	无细胞 DNA 筛查胶带（Agilent，5067-5630），无细胞 DNA 样本缓冲液（Agilent，5067-5633）
Apostle MiniMax 高效无细胞 DNA 分离试剂盒	Apostle	A17622-250	5 mL × 50 样本制备版本
BD Vacutainer 血液采集管	BD	367525	EDTA 血液采集管（10 mL）
BioViewCCBS	Clinomics		BioView Clinomics 定制化 Bioview 系统。基于 Allegro Plus 显微镜的定制设备
CD45 单克隆抗体（HI30），PE-Alexa Fluor 610	Invitrogen	MHCD4522
FAST Auto 芯片	Clinomics	CLX-M3001
LBx-1 芯片	Clinomics	CLX-M4101
LBx-2 芯片	Clinomics	CLX-M4201
OPR-2000 仪器	Clinomics	CLX-I2001
盖玻片	Marienfeld Superior	HSU-0101040
DynaMag 2 磁力架	Thermo Fisher Scientific	12321D
Ficoll Paque 溶液	GE healthcare	17-1440-03	密度梯度溶液
带滤芯吸头，10 µL	Axygen	AX-TF-10	建议使用带气溶胶屏障的移液吸头，以帮助防止交叉污染。
带滤芯吸头，200 µL	Axygen	AX-TF-200	建议使用带气溶胶屏障的移液吸头，以帮助防止交叉污染。
带滤芯吸头，100 µL	Axygen	AX-TF-100	建议使用带气溶胶屏障的移液吸头，以帮助防止交叉污染。
带滤芯吸头，1000 µL	Axygen	AX-TF-1000	建议使用带气溶胶屏障的移液吸头，以帮助防止交叉污染。
FITC 抗人 CD326（EpCAM）抗体	BioLegend	324204
FITC 小鼠抗人细胞角蛋白抗体	BD Biosciences	347653
甲醛溶液（35 wt. % 水溶液）	Sigma Aldrich	433284
Kimtech Science 擦拭纸	Yuhan-Kimberly	41117
乳胶手套	Microflex	63-754
磁珠分离架	V&P Scientific	VP 772F2M-2
手动移液器 （0.5–10 µL）	Eppendorf	3120000020
手动移液器 （2–20 µL）	Eppendorf	3120000038
手动移液器 （10–100 µL）	Eppendorf	3120000046
手动移液器 （20–200 µL）	Eppendorf	3120000054
手动移液器 （100–1000 µL）	Eppendorf	3120000062
含 DAPI 的封片剂 — 水性，Fluoroshield	abcam	ab104139
正常人 IgG 对照	R&D Systems	1-001-A
OLYMPUS BX-UCB	Olympus	9217316
广谱细胞角蛋白单克隆抗体（AE1/AE3），Alexa Fluor 488	Invitrogen	53-9003-82
PBS（磷酸盐缓冲液）	Corning	21-040CVC
便携式移液辅助器	Drummond	4-000-201
载玻片	Marienfeld Superior	HSU-1000612
StainTray 染色盒	Simport	M920
无菌移液管（10 mL）	SPL	91010
Triton X-100 溶液	Sigma Aldrich	93443
TWEEN 20	Sigma Aldrich	P7949
全血			采集于 EDTA 或无细胞 DNA 稳定管中，于 4–8 °C 保存：若全血量不足 9 mL，需加入适量 PBS（磷酸盐缓冲液）。
X-Cite 120Q（荧光灯照明装置）	Excelitas	010-00157