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从临床样本中自动分离与收集癌症相关物质

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DOI：

10.3791/64325

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2023年1月13日

 ,  ,  , 
1Clinomics Inc.

本文内容

摘要

本文介绍了利用自动化设备从全血中简便高效地分离和收集无细胞DNA及循环肿瘤细胞等物质的方法。

摘要

近年来，液体活检已被用于诊断多种疾病，包括癌症。体液中含有许多物质，这些物质来源于正常组织，包括细胞、蛋白质和核酸，但也有一些物质来源于病变区域。对体液中这些物质的检测与分析在多种疾病的诊断中发挥着关键作用。因此，准确分离所需物质至关重要，目前已有多种技术被开发用于实现这一目的。

我们开发了一种名为CD-PRIME的光盘式实验室设备与平台。该设备具有自动化优势，在样本污染和样本稳定性方面表现良好。此外，它还具备提取得率高、操作时间短以及重复性高的优点。同时，根据所安装光盘的类型，可分离含有游离DNA的血浆、循环肿瘤细胞、外周血单个核细胞或血沉棕黄层。因此，可从体液中获取多种材料，用于包括组学研究在内的多种下游应用。

引言

多种疾病（包括癌症）的早期和准确检测是制定治疗策略的最重要因素1,2,3,4。特别是癌症的早期检测与患者生存几率的提高密切相关5,6,7,8。近年来，液体活检在癌症早期检测中备受关注。实体瘤会经历血管生成，并向血液中释放多种物质。特别是已在癌症患者血液中检测到循环DNA（ctDNA）、循环RNA（ctRNA）、蛋白质、外泌体等囊泡以及循环肿瘤细胞（CTCs）2,9。尽管这些物质的含量存在个体差异，但它们不仅在疾病早期阶段，而且在晚期阶段也持续存在6,10。然而，个体间差异非常显著；例如，含有ctDNA的游离DNA（cfDNA）含量低于1,000 ng，而在10 mL癌症患者的全血中，CTC数量少于100个11,12,13。许多研究利用这些含量较低的物质（即cfDNA、ctDNA和CTCs）对癌症进行表征。为了获得准确的结果，高纯度地精确分离微量物质至关重要13,14。传统离心法虽被广泛使用，但操作难度较大，且纯度受操作者技术水平影响较大。自CTCs被发现以来，已发展出多种分离技术，如离心法或密度梯度分离法、免疫磁珠法以及微流控技术。尽管如此，这些技术在需要从用于分离的各种芯片和膜中回收细胞时常常受到限制15。此外，标记方法需要流式细胞分选仪（FACS）等设备，且由于标记物污染，会对下游分析过程造成限制。

近年来，液体活检的应用日益增多，多项研究正在致力于癌症的早期检测。尽管该方法操作简便，但在下游分析方面仍存在困难，目前已有多种研究试图克服这些难题16,17。此外，包括医院在内的许多机构都需要自动化、可重复且高纯度、使用便捷的方法。本文中，我们开发了一种基于芯片实验室（lab-on-a-disc）的技术，用于液体活检后从血液样本中自动分离物质。该装置基于离心、微流控以及孔径大小依赖的细胞捕获原理。共有三种类型的芯片：LBx-1 可从全血中获取血浆和白膜层；LBx-2 可从体积小于 10 mL 的全血中分离血浆和外周血单个核细胞（PBMC）；FAST-auto 则可通过可从芯片上移除的膜进一步捕获循环肿瘤细胞（CTCs）。每次运行最多可同时使用四种芯片中的任意一种四个重复。最重要的是，该装置和方法的优势在于仅需少量血液即可从同一样本中获得多种癌症相关物质，这意味着患者只需接受一次采血。此外，该方法还能避免因不同时间点采血所导致的误差。该平台操作简便，可为液体活检及其下游应用提供准确结果。本实验方案将介绍该装置及配套 cartridge 的使用方法。

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方案

所有全血样本均来自肺癌患者。Clinomics 公司的癌症基因组学研究所负责开展研究与分析工作，政府机构的 IRB 研究审批由阿山医疗中心机构审查委员会（IRB 编号：2021-0802）主导，并已注册 Clinomics 研究所用的 IRB 编号。

1. 样品制备

  1. 将9 mL全血收集至EDTA或cfDNA稳定型采血管中。
  2. 通过上下颠倒混匀约10次，充分混匀。
  3. 将样本储存在室温（RT；用于短期储存）或4 °C（用于长期储存）。禁止反复冻融。

2. 设备准备

  1. 按下电源开关以开启仪器。
    注意：触摸屏上将显示加载界面，仪器开始初始化。初始化过程中请勿将手靠近仪器。仪器初始化完成后，将出现试剂盒选择界面。
  2. 选择要使用的样本模式。通过按箭头按钮更改样本数量。

3. 设备操作与样本采集

  1. LBx-1 载样卡盒的装载
    1. 在仪器的触摸屏面板上选择卡盒类型。通过按压箭头按钮更改样本数量。
    2. 打开仪器门，按照卡盒支架上的编号顺序插入所有要使用的卡盒。务必正确插入卡盒和卡盒支架。如果卡盒未正确插入，可能会对仪器造成严重损坏。
    3. 若总共使用四个卡盒，请在卡盒支架的空位中放置一个虚拟卡盒（dummy cartridge）。
    4. 使用支撑轮安装卡盒，并拧紧锁紧螺母以固定卡盒。
    5. 关闭门并按下触控屏上的 RUN 按钮。仪器将关闭卡盒上的阀门，此过程约需 30 秒。
    6. 根据屏幕提示打开门，取下支撑轮，并从卡盒支架中取出已关闭阀门的卡盒。
    7. 将卡盒放置在实验台上，准备注入全血样本。使用血清移液管最多吸取 10 mL 全血样本。
      警告：处理血液的危险性。在整个血液样本和试剂操作过程中，必须穿戴实验服和实验室手套。实验室工作人员应仔细阅读所提供的材料安全数据表（MSDS）。
    8. 将移液管吸头深入插入卡盒的样本入口，并缓慢注入全血样本。
      注意：当使用 ≥9 mL 全血样本时，无需添加磷酸盐缓冲液（PBS）。当使用 <9 mL 全血样本时，需添加 PBS 使总体积达到 9 mL。例如，若使用 7.2 mL 全血，请向样本入口加入 1.8 mL PBS。可使用血清移液管或移液管吸头进行全血和 PBS 的注入。当使用 <8 mL 全血样本时，即使添加 1 mL PBS，也可能无法回收到白膜层（buffy coat）。对于基因组 DNA 制备，请使用此前步骤中已分离的 200 µL 全血。
    9. 按照卡盒支架上的编号顺序插入要使用的卡盒。使用支撑轮安装卡盒，并拧紧锁紧螺母以固定卡盒。关闭门并按下 OK 按钮。
      注意：血浆和白膜层将从全血中自动分离，过程约需 30 分钟。
      警告：操作过程中的危险。在高速旋转运行期间打开门或触碰仪器可能导致严重伤害。转子不对称装载也存在受伤风险。若仪器在辅助细胞富集模式或专家模式启动时出现异常振动或噪音，可能是卡盒安装不对称所致。请立即按下电源键停止运行，并正确安装卡盒。
    10. 当血浆与白膜层分离完成后，注意观察屏幕显示的信息及伴随的警报声。
    11. 通过打开门或按下 STOP 按钮停止警报。打开门，取出卡盒并放置于实验台上。
    12. 使用 1 mL 移液管吸头从血浆出口回收 3 mL 血浆。使用 1 mL 移液管吸头从白膜层出口回收 3 mL 白膜层。
  2. LBx-2 载样卡盒的装载
    1. 在仪器的触摸屏面板上选择卡盒名称。通过按压箭头按钮更改样本数量。
    2. 打开门，按照卡盒支架上的编号顺序插入要使用的卡盒。
    3. 若总共使用四个卡盒，请在卡盒支架的空位中放置一个虚拟卡盒（dummy cartridge）。
    4. 使用支撑轮安装卡盒，并拧紧锁紧螺母以固定卡盒。确保将卡盒正确插入卡盒支架中。如果卡盒未正确插入，可能会对仪器造成严重损坏。
    5. 关闭门并按下触控屏上的 RUN 按钮。仪器将关闭卡盒上的阀门，此过程约需 30 秒。
    6. 根据屏幕提示打开门，取下支撑轮，并从卡盒支架中取出已关闭阀门的卡盒，放置于实验台上。
    7. 将卡盒放置在实验台上，准备注入密度梯度溶液和全血样本。根据全血样本体积，检查需注入的密度梯度溶液和 PBS 的体积（参见补充表 1）。
    8. 使用血清移液管吸取密度梯度溶液。将移液管吸头深入插入卡盒入口，并缓慢注入密度梯度溶液。
    9. 注入密度梯度溶液后，使用血清移液管吸取全血样本。将移液管吸头深入插入卡盒的样本入口，并缓慢注入全血样本。
      注意：当使用 <9 mL 全血样本时，请参考该表格（补充表 1）添加 PBS。
    10. 按照卡盒支架上的编号顺序插入要使用的卡盒。使用支撑轮安装卡盒，并拧紧锁紧螺母以固定卡盒。关闭门并按下 OK 按钮。
    11. 血浆和外周血单个核细胞（PBMC）将从全血中自动分离，过程约需 30 分钟。当血浆与 PBMC 分离完成后，注意观察伴随警报声出现的屏幕提示信息。
    12. 通过打开门或按下 STOP 按钮停止警报。打开门，取出卡盒并放置于实验台上。
    13. 使用 1 mL 移液管吸头从血浆出口回收 3 mL 血浆。使用 1 mL 移液管吸头从 PBMC 出口回收 3 mL PBMC。
  3. FAST-auto 卡盒的装载
    1. 在仪器的触摸屏面板上选择卡盒类型。通过按压箭头按钮更改样本数量。
    2. 打开门，按照卡盒支架上的编号顺序插入要使用的卡盒。若总共使用四个卡盒，请在卡盒支架的空位中放置一个虚拟卡盒（dummy cartridge）。
    3. 使用支撑轮安装卡盒，并拧紧锁紧螺母以固定卡盒。
    4. 关闭门并按下触控屏上的 RUN 按钮。仪器将关闭卡盒上的阀门，此过程约需 30 秒。
    5. 根据屏幕提示打开门，取下支撑轮，并从卡盒支架中取出已关闭阀门的卡盒。
    6. 将卡盒放置在实验台上，准备注入 PBS 溶液和全血样本。使用血清移液管吸取 6 mL PBS 溶液。将移液管吸头深入插入卡盒的 PBS 入口，并缓慢注入 6 mL PBS 溶液。
    7. 注入 PBS 溶液后，使用血清移液管吸取 3 mL 全血或从 LBx-2 获得的 PBMC 样本（此前需用 1% BSA 冲洗移液管以防止残留物粘附）。将移液管吸头深入插入卡盒的样本入口，并缓慢注入全血样本。
    8. 按照卡盒支架上的编号顺序插入要使用的卡盒。使用支撑轮安装卡盒，并拧紧锁紧螺母以固定卡盒。关闭门并按下 OK 按钮。
    9. 循环肿瘤细胞（CTC）将从全血中自动富集，过程约需 15 分钟。当 CTC 富集完成后，注意观察伴随警报声出现的屏幕提示信息。通过打开门或按下 STOP 按钮停止警报。
    10. 打开门，取出卡盒并放置于实验台上。将背板移除器（BPR）插入卡盒前端的四个孔中。用双手拇指按压深蓝色翼片，然后按压浅蓝色主体直至听到咔嗒声。
    11. 小心地向上提起，取下卡盒主体。使用镊子极其轻柔地夹住滤膜边缘。请务必使用滤膜外缘（1 mm 宽的边缘部分）夹持滤膜。
    12. 小心地将载有富集后 CTC 的滤膜放入 1.5 mL 离心管中，用于核酸提取。如有需要，可使用 1 mL 移液管吸头从血液出口回收滤过的血液。

4. 系统的维护

  1. 仪器清洁与消毒的准备工作
    1. 每周使用乙醇和干燥的纸巾清洁仪器及附件的所有可接触表面，若发生污染则需立即清洁。
    2. 定期使用酒精（乙醇和异丙醇）或含酒精的消毒剂清洁离心碗和转子轴。
  2. 仪器的清洁与消毒
    注意：有关仪器的一般故障排除及其他注意事项，请参见补充表2。
    1. 使用主电源开关关闭仪器，并将电源插头从电源插座上拔下。
    2. 打开门，使用湿布和推荐的清洁剂清洁仪器所有可接触的表面（包括电源线），并进行消毒。
    3. 检查转子轴是否有损坏，检查仪器是否存在腐蚀或损坏情况。
    4. 仅当仪器内外完全干燥后，方可将其重新连接至电源。
  3. 断开主电源插头并取出保险丝盒。保险丝盒位于电源插座上方。将已使用的保险丝更换为容器中的备用保险丝。

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结果

该技术的目标是从全血中简便、自动地分离出与癌症相关的物质。尤其适用于任何人在各类合适的研究和分析领域中使用。在单个血液样本中同时且可重复地分离多种物质，对于液体活检具有重要意义。LBx-1 和 LBx-2 碟片用于从全血中分离血浆以及血沉棕黄层或外周血单个核细胞（PBMC）。图1展示了该装置分离出的物质。首先，使用 LBx-1 从 10 mL 血液中获取血浆，或使用 LBx-2 获取 PBMC。其次，将分离出的 3 mL 血沉棕黄层用 PBS 重新注入 FAST-auto 中，循环肿瘤细胞（CTC）通过膜被过滤出来。第三步，将膜转移至装有保存缓冲液的试管中，或立即用于染色。对于其他应用或长期保存，可通过涡旋振荡轻松将 CTC 从膜上洗脱下来。

使用基于磁珠的DNA分离方法从血浆中提取cfDNA，该方法能够通过调节磁珠浓度实现按大小捕获DNA。采用Bioanalyzer检测cfDNA的浓度和纯度。众所周知，包括ctDNA在内的cfDNA浓度因癌症类型和分期的不同而有所差异18。...

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讨论

循环游离DNA（cfDNA）和循环肿瘤细胞（CTC）的含量和浓度取决于个体差异、癌症的分期及类型，同时也受患者身体状况的影响2,4,5,10,20。特别是在癌症的早期或癌前阶段，与癌症相关的物质浓度极低，因此存在难以被检测到的高风险。然而，早期发现对患者的生存率以及治疗策略的制定具有极为积极的作用。由于cfDNA和CTC在血液中的半衰期较短，它们能够反映癌症的实时状态21,22,23,24,25

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披露

作者与本研究无任何利益冲突。

致谢

本手稿部分得到了韩国医疗器械开发基金（KMDF，资助编号：RS-2020-KD000019）和韩国保健产业振兴院（KHIDI，资助编号：HI19C0521020020）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1% BSA（牛血清白蛋白）Sigma-AldrichA3059
1.5 mL 微量离心管AxygenMCT-150-C-S
15 mL 锥形管SPL50015
4150 TapeStation 系统AgilentG2992AA无细胞 DNA 筛查胶带（Agilent，5067-5630），无细胞 DNA 样本缓冲液（Agilent，5067-5633）
Apostle MiniMax 高效无细胞 DNA 分离试剂盒 ApostleA17622-2505 mL × 50 样本制备版本
BD Vacutainer 血液采集管BD367525EDTA 血液采集管（10 mL）
BioViewCCBSClinomicsBioView Clinomics 定制化 Bioview 系统。基于 Allegro Plus 显微镜的定制设备
CD45 单克隆抗体（HI30），PE-Alexa Fluor 610InvitrogenMHCD4522
FAST Auto 芯片ClinomicsCLX-M3001
LBx-1 芯片ClinomicsCLX-M4101
LBx-2 芯片ClinomicsCLX-M4201
OPR-2000 仪器ClinomicsCLX-I2001
盖玻片Marienfeld SuperiorHSU-0101040
DynaMag 2 磁力架Thermo Fisher Scientific12321D
Ficoll Paque 溶液GE healthcare17-1440-03密度梯度溶液
带滤芯吸头，10 µLAxygenAX-TF-10建议使用带气溶胶屏障的移液吸头，以帮助防止交叉污染。
带滤芯吸头，200 µLAxygenAX-TF-200建议使用带气溶胶屏障的移液吸头，以帮助防止交叉污染。
带滤芯吸头，100 µLAxygenAX-TF-100建议使用带气溶胶屏障的移液吸头，以帮助防止交叉污染。
带滤芯吸头，1000 µLAxygenAX-TF-1000建议使用带气溶胶屏障的移液吸头，以帮助防止交叉污染。
FITC 抗人 CD326（EpCAM）抗体BioLegend324204
FITC 小鼠抗人细胞角蛋白抗体BD Biosciences347653
甲醛溶液（35 wt. % 水溶液）Sigma Aldrich433284
Kimtech Science 擦拭纸Yuhan-Kimberly41117
乳胶手套Microflex63-754
磁珠分离架V&P ScientificVP 772F2M-2
手动移液器 （0.5–10 µL）Eppendorf3120000020
手动移液器 （2–20 µL）Eppendorf3120000038
手动移液器 （10–100 µL）Eppendorf3120000046
手动移液器 （20–200 µL）Eppendorf3120000054
手动移液器 （100–1000 µL）Eppendorf3120000062
含 DAPI 的封片剂 — 水性，Fluoroshieldabcamab104139
正常人 IgG 对照R&D Systems1-001-A
OLYMPUS BX-UCBOlympus9217316
广谱细胞角蛋白单克隆抗体（AE1/AE3），Alexa Fluor 488Invitrogen53-9003-82
PBS（磷酸盐缓冲液）Corning21-040CVC
便携式移液辅助器Drummond4-000-201
载玻片Marienfeld SuperiorHSU-1000612
StainTray 染色盒SimportM920
无菌移液管（10 mL）SPL91010
Triton X-100 溶液Sigma Aldrich93443
TWEEN 20Sigma AldrichP7949
全血采集于 EDTA 或无细胞 DNA 稳定管中，于 4–8 °C 保存：若全血量不足 9 mL，需加入适量 PBS（磷酸盐缓冲液）。
X-Cite 120Q（荧光灯照明装置）Excelitas010-00157

参考文献

  1. Babayan, A., Pantel, K. Advances in liquid biopsy approaches for early detection and monitoring of cancer. Genome Medicine. 10 (1), 21(2018).
  2. Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nature Reviews Clinical Oncology. 10 (8), 472-484 (2013).
  3. Bardelli, A., Pantel, K. Liquid biopsies, what we do not know (yet). Cancer Cell. 31 (2), 172-179 (2017).
  4. Mattox, A. K., et al. Applications of liquid biopsies for cancer. Science Translational Medicine. 11 (507), (2019).
  5. Heitzer, E., Perakis, S., Geigl, J. B., Speicher, M. R. The potential of liquid biopsies for the early detection of cancer. NPJ Precision Oncology. 1 (1), 36(2017).
  6. Scudellari, M. Myths that will not die. Nature. 582 (7582), 322-326 (2015).
  7. Prasad, V., Fojo, T., Brada, M. Precision oncology: origins, optimism, and potential. The Lancet Oncology. 17 (2), 81-86 (2016).
  8. Prasad, V. Perspective: The precision-oncology illusion. Nature. 537 (7619), 63(2016).
  9. Siravegna, G., Marsoni, S., Siena, S., Bardelli, A. Integrating liquid biopsies into the management of cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (9), 531-548 (2017).
  10. Bettegowda, C., et al. Detection of circulating tumor DNA in early-and late-stage human malignancies. Science Translational Medicine. 6 (224), 24(2014).
  11. Udomruk, S., Orrapin, S., Pruksakorn, D., Chaiyawat, P. Size distribution of cell-free DNA in oncology. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 166, 103455(2021).
  12. Paterlini-Brechot, P., Benali, N. L. Circulating tumor cells (CTC) detection: clinical impact and future directions. Cancer Letters. 253 (2), 180-204 (2007).
  13. Loeian, M. S., et al. Liquid biopsy using the nanotube-CTC-chip: capture of invasive CTCs with high purity using preferential adherence in breast cancer patients. Lab on a Chip. 19 (11), 1899-1915 (2019).
  14. Rikkert, L. G., Van Der Pol, E., Van Leeuwen, T. G., Nieuwland, R., Coumans, F. A. W. Centrifugation affects the purity of liquid biopsy-based tumor biomarkers. Cytometry Part A. 93 (12), 1207-1212 (2018).
  15. Sharma, S., et al. Circulating tumor cell isolation, culture, and downstream molecular analysis. Biotechnology advances. 36 (4), 1063-1078 (2018).
  16. Bennett, C. W., Berchem, G., Kim, Y. J., El-Khoury, V. Cell-free DNA and next-generation sequencing in the service of personalized medicine for lung cancer. Oncotarget. 7 (43), 71013(2016).
  17. Lowes, L. E., et al. Circulating tumor cells (CTC) and cell-free DNA (cfDNA) workshop 2016: scientific opportunities and logistics for cancer clinical trial incorporation. International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1505(2016).
  18. Bryzgunova, O. E., Konoshenko, M. Y., Laktionov, P. P. Concentration of cell-free DNA in different tumor types. Expert Review of Molecular Diagnostics. 21 (1), 63-75 (2021).
  19. Park, Y., et al. Circulating tumour cells as an indicator of early and systemic recurrence after surgical resection in pancreatic ductal adenocarcinoma. Scientific Reports. 11 (1), 1-12 (2021).
  20. Heidrich, I., Ačkar, L., Mossahebi Mohammadi, P., Pantel, K. Liquid biopsies: Potential and challenges. International Journal of Cancer. 148 (3), 528-545 (2021).
  21. Celec, P., Vlková, B., Lauková, L., Bábíčková, J., Boor, P. Cell-free DNA: the role in pathophysiology and as a biomarker in kidney diseases. Expert Reviews in Molecular Medicine. 20, 1(2018).
  22. Thierry, A. R., et al. Origin and quantification of circulating DNA in mice with human colorectal cancer xenografts. Nucleic Acids Research. 38 (18), 6159-6175 (2010).
  23. Moreira, V. G., de la Cera Martínez, T., Gonzalez, E. G., Garcia, B. P., Menendez, F. V. A. Increase in and clearance of cell-free plasma DNA in hemodialysis quantified by real-time PCR. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM). 44 (12), 1410-1415 (2006).
  24. Gauthier, V. J., Tyler, L. N., Mannik, M. Blood clearance kinetics and liver uptake of mononucleosomes in mice. Journal of Immunology. 156 (3), 1151-1156 (1996).
  25. Meng, S., et al. Circulating tumor cells in patients with breast cancer dormancy. Clinical Cancer Research. 10 (24), 8152-8162 (2004).
  26. Alix-Panabières, C., Pantel, K. Challenges in circulating tumour cell research. Nature Reviews Cancer. 14 (9), 623-631 (2014).
  27. Zhou, J., et al. Isolation of circulating tumor cells in non-small-cell-lung-cancer patients using a multi-flow microfluidic channel. Microsystems & Nanoengineering. 5 (1), 8(2019).
  28. Sajay, B. N. G., et al. Towards an optimal and unbiased approach for tumor cell isolation. Biomedical Microdevices. 15 (4), 699-709 (2013).
  29. Bailey, P. C., Martin, S. S. Insights on CTC biology and clinical impact emerging from advances in capture technology. Cells. 8 (6), 553(2019).
  30. Ahn, S. M., Simpson, R. J. Body fluid proteomics: Prospects for biomarker discovery. Proteomics-Clinical Applications. 1 (9), 1004-1015 (2007).

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