需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

硬骨鱼类模型日本青鳉（Oryzias latipes）的精子采集与计算机辅助精子分析

4.6K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/64326

⸱

2022年10月6日

 ,  , 
1Department of Preclinical Sciences and Pathology, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences, 2Department of Production Animal Clinical Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences

本文内容

摘要

本文介绍了两种快速高效收集小型模式鱼类青鳉（Oryzias latipes）精子的方法，以及利用计算机辅助精子分析（CASA）可靠评估精子质量的实验方案。

摘要

日本青鳉（Oryzias latipes）是一种辐鳍鱼类，也是生态毒理学、发育生物学、遗传学和生理学研究中日益重要的脊椎动物模型。 青鳉还被广泛用于研究脊椎动物的繁殖过程，因为繁殖是物种延续的关键生物学功能。精子质量是衡量雄性生育能力的重要指标，因而直接影响繁殖成功率。目前已有多种物种（包括辐鳍鱼类）的精子采集与分析技术的详细文献记录。对于体型较大的鱼类，精子采集相对简单；但对于产精量较少且身体更为脆弱的小型模式鱼类，采集过程则更为复杂。因此，本文介绍了两种适用于小型模式鱼类日本青鳉的精子采集方法：睾丸解剖法和腹部按摩法。本文证明，这两种方法均适用于青鳉，并且由于个体在操作后能迅速恢复，腹部按摩法可重复多次进行。此外，本文还描述了一种用于青鳉的计算机辅助精子分析方案，以客观评估青鳉精子质量的多个关键指标（包括运动性、前进性、运动持续时间及相对浓度）。这些针对这一重要小型辐鳍鱼类模型所优化的技术，将显著增进我们对影响脊椎动物雄性生育能力的环境、生理和遗传因素的理解。

引言

日本青鳉是一种原产于东亚的小型卵生淡水硬骨鱼类。青鳉已成为生态毒理学、发育遗传学、基因组学以及进化生物学和生理学研究中一种优秀的脊椎动物模型系统1,2。与常用的斑马鱼类似，青鳉相对易于繁殖，并对多种常见鱼类疾病具有较强的抗性1,2。使用青鳉作为模型的优势包括世代周期短、胚胎透明1,2，以及已完成基因组测序3。与斑马鱼不同，青鳉具有明确的性别决定基因4 ，并且对温度（4–40 °C） 和盐度（广盐性物种）具有较强的耐受能力5。此外，目前已开发出多种遗传学和解剖学工具及实验方案6,7,8,9,10,11,12，以促进对青鳉生物学特性的研究。

繁殖是一种重要的生理功能，因为它使物种得以延续。脊椎动物的繁殖需要一系列精确协调的事件，包括雌性产生卵母细胞和雄性产生精子。精子是一类独特的细胞，通过复杂的精子发生过程产生，在此过程中存在多个质量控制检查点，以确保最终产生高质量的精子13。由于配子质量直接影响受精成功率和幼体存活率，它已成为水产养殖和鱼类种群研究中的关注重点。因此，精子质量是衡量脊椎动物雄性生育力的重要指标。

评估鱼类精子质量的三个有用指标是活力、前向运动能力和存活时间。精子活力百分比和前向运动能力是精子质量的常用指标，因为前向运动对于受精成功至关重要，并且与其密切相关14,15。运动持续时间在鱼类中也是一个重要指标，因为在大多数硬骨鱼类中，精子完全活跃的时间少于2分钟，且其运动轨迹通常不如哺乳动物线性明显15。然而，过去许多评估精子活力的研究依赖于主观或半定量的分析方法15,16。例如，过去曾通过显微镜下目视观察来估计青鳉的精子活力17。也有人通过记录精子运动并使用成像软件合并帧图像，以测量其游动路径和速度来进行评估18,19,20。这类方法往往缺乏稳健性，不同分析人员可能得出不同的结果15,21。

计算机辅助精子分析（CASA）最初是为哺乳动物开发的。CASA 是一种快速定量评估精子质量的方法，通过自动记录和测量精子的运动速度与轨迹来实现15。在鱼类中，该技术已被应用于多种物种，用于监测多种水污染物对精子质量的影响，筛选优良亲本以提高种群繁殖性能，提升冷冻保存与储存效率，以及优化受精条件15。因此，CASA 是一种可靠评估不同脊椎动物物种精子质量的有力工具。然而，由于鱼类在繁殖策略上存在显著多样性，硬骨鱼类的精子在结构上既不同于哺乳动物，也因鱼种而异。硬骨鱼类主要通过将配子释放到水中进行体外受精，其精子浓度高，结构相对简单，且无顶体；而哺乳动物为体内受精，无需应对水中稀释的问题，但需耐受更为黏稠的体液环境14。此外，大多数鱼类的精子激活后运动迅速，但完全活跃的时间通常少于 2 分钟，尽管存在若干例外情况15,22。由于大多数鱼类精子活力下降迅速，在制定鱼类精子分析方案时，必须极其注意激活后分析的时间点。

在生物学研究领域中，硬骨鱼类和青鳉被广泛用作模式生物来研究繁殖。事实上，雄性青鳉表现出多种有趣的生殖与社会行为，例如交配守护23,24。此外，已有多个转基因品系可用于研究该物种生殖的神经内分泌调控机制25,26,27。精子采集在体型较大的鱼类中是一项相对简单的操作，但在小型模式鱼类中则更具挑战性，因其产生的精子量较少且个体更为脆弱。因此，目前大多数涉及青鳉精子采集的研究均通过碾碎解剖所得的睾丸来获取精液（鱼类精液）17,28,29,30。少数研究采用改良的腹部按摩法，将精液直接挤入激活液中18,19,20；然而，该方法难以观察所采集精液的量和颜色。在斑马鱼中，通常采用腹部按摩法挤出精液，并立即用毛细管收集31,32,33。该方法可估测精液体积，并观察射出精液的颜色，后者是评估精子质量的一种快速而简便的指标32,33。因此，目前尚缺乏针对青鳉精子采集与分析的清晰且详尽描述的操作方案。

因此，本文介绍了在小型模式鱼类日本青鳉中采集精子的两种方法：睾丸解剖法和利用毛细管进行腹部按摩法。文章证明了这两种方法在青鳉中均是可行的，并表明由于鱼类在操作后能迅速恢复，腹部按摩法可重复多次进行。本文还描述了一种适用于青鳉的计算机辅助精子分析方案，可用于可靠地测定青鳉精子质量的多个重要指标（包括运动性、前进性、持续时间和相对精子浓度）。这些针对这一重要的小型硬骨鱼模型所优化的技术，将极大促进人们对影响脊椎动物雄性生育力的环境、生理及遗传因素的理解。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

所有实验操作和动物处理均遵循挪威生命科学大学（NMBU）关于实验动物福利的建议进行。实验使用在挪威生命科学大学（NMBU，Ås，挪威）饲养的成年雄性日本青鳉鱼（Hd-rR品系，6-9月龄）。此外，在法国农业、食品与环境国家研究所（INRAE，雷恩，法国）饲养的9月龄雄性日本青鳉鱼（CAB品系）中也对这些方法进行了简要测试。

1. 仪器与溶液准备

  1. 制备麻醉剂储备液（0.6% 三卡因）。
    1. 将 0.6 g 三卡因（MS-222）溶于 100 mL 10× 磷酸盐缓冲液（PBS）中。
    2. 将麻醉剂储备液分装为每管 2 mL，共 50 管，置于 2 mL 塑料管中，于 -20 °C 保存，用于后续麻醉或安乐死。
  2. 制备复苏用水（0.9% 氯化钠 [NaCl] 溶液）。
    1. 将 27 g NaCl 加入 3 L 水族箱水中。
    2. 室温（RT）保存，待用。
  3. 必要时调整激活液（Hank's 平衡盐溶液 [HBSS]）。
    注：HBSS 可商业购买或在实验室中配制（材料表）。
    1. 使用 pH 计测定 HBSS 的 pH 值，必要时用盐酸或氢氧化钠调节，使最终 pH 值为 7.1–7.3。
    2. 使用渗透压计测定 HBSS 的渗透压，以供后续报告。
      注：市售产品的渗透压范围为 266–294 mOsmol/kg；本研究中渗透压为 287 mOsmol/kg。如需降低渗透压，可用蒸馏水稀释，但并非必需，因为在 150–300 mOsmol/kg 的 HBSS 中，青鳉精子的激活无显著差异。
    3. 室温（RT）保存，待用。
  4. 制备固定海绵。
    1. 将一块软海绵裁剪至可紧密贴合培养皿。
    2. 在海绵中央切一条直线切口，长度足以容纳鱼体（3–4 cm），深度约 1 cm（图 1A）。该切口用于将鱼体腹侧朝上固定，以暴露泄殖腔。

2. 精子采集

注意：精子采集可通过两种不同方法实现：腹部按摩法或睾丸解剖法。

  1. 通过腹部按摩采集精子
    1. 在100 mL玻璃容器中，将一管Tricaine原液（0.6%）加入38 mL水族箱水中，稀释配制成0.03%的麻醉溶液。
    2. 准备器械，包括钝头平滑镊子和一支10 µL一次性校准玻璃微量移液管及吸管组件（图1A）。用麻醉溶液润湿第1.4步中准备的固定海绵。
    3. 准备含有36 µL激活液的离心管，用于立即分析。将激活液置于设定为27 °C的水浴或培养箱中预热至少5分钟。
      注：尽管可对单条鱼的样本进行分析，但将多条雄鱼的样本混合在同一份激活液中可减少个体差异。当合并多条鱼的样本时，每条鱼使用36 µL激活液。此稀释比例可能需要根据所用青鳉的品系或饲养条件进行调整，因为这些因素会影响精子浓度和体积。CASA程序将提示精子浓度过高而无法识别的情况。
    4. 将鱼放入麻醉溶液中麻醉30–90秒。
      注：麻醉时间需根据鱼体大小进行调整。为确保鱼已完全麻醉，可用镊子轻轻夹压尾柄部。若鱼无反应，即可开始按摩。
    5. 将鱼从麻醉液中取出，用纸巾或轻轻擦拭的方式擦干鱼体腹部。将鱼腹面朝上放置于湿润的固定海绵凹槽中，使其鳃部接触海绵中的麻醉液（图1B）。
    6. 若泄殖腔周围潮湿，用一次性擦拭纸巾轻轻擦干鱼体腹侧。
    7. 将鱼置于固定海绵上，在解剖显微镜下操作，并将连接吸管组件的微量移液管抵住鱼的泄殖腔（图1C）。
    8. 用钝头平滑镊子沿头尾方向轻轻挤压鱼腹部，同时通过吸管组件抽吸，将排出的精液收集至移液管中（图1D）。
    9. 将鱼从海绵中取出，放回恢复用水中。让其在溶液中恢复至少15分钟后再放回水族系统。
    10. 将精液转移至已预热激活液的准备管中，并通过反复吹吸吸管组件数次使样本混匀。
    11. 分析前轻轻弹击管壁，使稀释后的精子均匀悬浮。
      注：为获得最佳结果，建议在激活后立即（例如5秒内）进行样本分析。在青鳉中，若有必要可稍延迟分析，因为精子可保持数小时的运动能力，但各样本间的分析时间应保持一致，因精子活力随时间延长而下降。
  2. 通过睾丸解剖采集精子
    1. 在100 mL玻璃容器中，将两管Tricaine原液（0.6%）加入26 mL水族箱水中，稀释配制成0.08%的安乐死溶液。
    2. 准备解剖工具，包括钝头和精细镊子以及小型解剖剪刀（图1E）。
    3. 为每个样本准备一支含有120 µL激活液的离心管，用于立即分析。将激活液置于设定为27 °C的水浴或培养箱中预热至少5分钟。
      注：尽管可对单条鱼的样本进行分析，但将多条雄鱼的样本混合在同一份激活液中可减少个体差异。当合并多条鱼的样本时，每条鱼使用120 µL激活液。此稀释比例可能需要根据所用青鳉的品系或饲养条件进行调整，因为这些因素会影响精子浓度和体积。CASA程序将提示精子浓度过高而无法识别的情况。
    4. 将鱼放入0.08%麻醉溶液中30–90秒以实施安乐死。
      注：处理时间取决于鱼体大小。为确认鱼已死亡，需等待鳃盖运动完全停止，且用镊子触碰时无任何反应。
    5. 将鱼从安乐死溶液中取出，用纸巾轻轻擦干鱼体。
      注：在此步骤中可对鱼进行称重，以便后续计算性腺体指数（GSI，性腺重量 / 体重）。
    6. 将鱼置于解剖显微镜下，使其左侧面向上（图1F）。
    7. 使用小型解剖剪刀，从泄殖腔处向背部剪开一个皮瓣，再沿肋骨剪至鳃部，以暴露内部器官（图1G）。
    8. 找到睾丸，用精细镊子剪断其两端连接组织，并取出睾丸（图1H）。
      注：若需计算GSI，可在本步骤中对睾丸进行称重。操作应迅速，避免组织干燥。
    9. 将睾丸转移至含有预热激活液的准备管中。
    10. 用镊子在管壁上反复碾压睾丸数次，以释放精子。精子释放通常可见，会使溶液略显浑浊。
    11. 分析前轻轻弹击管壁，使稀释后的精子均匀悬浮。
      注：为获得最佳结果，建议在激活后立即（例如5秒内）进行样本分析。在青鳉中，若有必要可稍延迟分析，因为精子可保持数小时的运动能力，但各样本间的分析时间应保持一致，因精子活力随时间延长而下降。

鱼精液提取与解剖；微量移液器、镊子和剪刀；实验过程。
图 1：通过腹部按摩（A-D）和睾丸解剖（E-H）收集精液。（A）用于腹部按摩的器械：固定用海绵、钝头平滑镊子，以及配有吸液管组件的10 µL一次性校准玻璃微量移液器；（B）鱼在固定海绵中的位置，鳃部暴露于海绵中的麻醉剂，泄殖腔朝上；（C）钝头平滑镊子置于腹部，微量移液器紧贴泄殖腔；（D）经轻柔按摩并吸取后，微量移液器中的精液。（E）用于睾丸解剖的器械：钝头镊子、精细镊子和小型解剖剪；（F）进行睾丸解剖时鱼的位置；（G）内脏器官的侧面观；（H）用精细镊子剪断两端连接组织以取出睾丸。比例尺：2 mm。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 使用 CASA 系统进行精子分析

  1. 根据使用手册设置CASA系统（SCA Evolution），显微镜需配备绿色滤光片，并使用10倍相衬物镜。
  2. 将一次性20 µm计数室载玻片置于预热板或设定为27 °C的培养箱中至少预热5分钟。
  3. 打开精子分析软件，并选择运动性分析模块。
  4. 按照图2B所示，设置适用于青鳉的参数配置。
  5. 将预热过的一次性20 µm计数室载玻片放置于显微镜下，载物台加热装置设定为27 °C。
  6. 用移液器将样品加入载玻片的计数室内，直至充满但不溢出。用棉签轻轻擦拭进样口处多余的样品，或小心擦拭以防止细胞漂浮。
  7. 点击分析以在显微镜下观察样品。
    注意：若显微镜图标为红色，则需调整显微镜照明，以便程序准确追踪精子。调节显微镜亮度，使精子尾部运动清晰可见，此时图标应变为蓝色。
  8. 确保显微镜聚焦清晰，再次点击分析以记录视野中的精子。移动载玻片，使样品的新区域进入视野，重复此操作以采集3-5个不同视野。避免选择含有气泡、细胞团块或伪影的视野。
  9. 点击结果查看分析结果。
    注意：若结果页面中的某些视野区域以红色边框标出，请根据系统提示删除浓度或运动性差异过大的数据。
  10. 双击某一视野可查看该视野的单独结果，或手动检查是否存在标记错误或未被追踪的精子。必要时，可右键点击单个精子以重新标注其运动性（图2A）。

精子分析软件界面；运动能力数据、参数配置、结果可视化图表。
图2：SCA Evolution 软件截图。 （A）一个视野的精子追踪结果。在右侧查看视野数据，双击精子可查看个体数据；（B）所有视野的结果汇总，配置菜单已打开。请点击此处查看此图的放大版本。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

获得的数据类型
SCA Evolution 软件提供的精子运动分析数据包括精子活力（活动精子与不活动精子的百分比）、前向性（前向运动与非前向运动精子的百分比）以及运动速度（快速、中速和慢速运动精子的百分比）。此外，该软件还结合前向性与速度进行分类（快速前向、中速前向、非前向）。这些分类依据的是程序所提供的精子运动轨迹的测量结果（图3A）和计算方法（图3B），详见（补充表1）。对于青鳉，以下阈值参考了先前文献中推荐的斑马鱼参数19,34,35，并结合来自18个个体的青鳉数据分布进行调整。活力分类基于曲线速度（VCL）：不活动 < 10 µm/s ≤ 慢速 < 20 µm/s ≤ 中速 ≤ 40 µm/s < 快速。当直线性指数（STR）> 68...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

渗透压是影响鱼类精子活化的重要因素36,37。通常情况下，精子在睾丸内处于不活动状态，而在海水鱼类中，当环境介质相对于精浆为高渗时，精子被激活并开始运动；在淡水鱼类中，则是在相对于精浆为低渗的介质中激活37。与血液类似，淡水鱼类精浆的渗透压通常低于海水鱼类（约为300 mOsmol/kg，而海水鱼类约为400 mOsmol/kg）22,37。因此，鱼类精子通常在接触到其生存水体时即被激活，而该水体也是进行精子分析时最适宜且最具生物学意义的激活介质。然而，在两个不同实验室饲养的Hd-rR和CAB品系青鳉鱼中，通过腹部按摩和睾丸解剖采集的精子在养殖用水中并未表现出运动能力（图4A）。此外，在287 mOsmol/kg的HBSS溶液中，精子的运动能力高于在36 mOsmol/kg的HBSS溶液中的表现（<...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由挪威生命科学大学和美国富布赖特项目资助。作者感谢NMBU的Anthony Peltier和Lourdes Carreon G Tan在鱼类养殖设施维护方面的支持，以及法国国家农业、食品和环境研究院（INRAE）ISC LPGP的Guillaume Gourmelin提供鱼类和实验室空间，以进一步测试这些方法。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 离心管AxygenMCT-150-C可使用任何标准品牌
10 µL 一次性校准玻璃微量移液器及吸管组件Drummond2-000-010
带相差功能的 10x 物镜NikonMRP90100
2 mL 离心管AxygenMCT-200-c-s可使用任何标准品牌
钝头镊子Fine Science Tools11000-12
钝头平滑镊子MilliporeXX6200006P
一次性 20 微米计数板载玻片Microptic20.2.25 Leja 双腔计数载玻片
解剖显微镜OlympusSZX7可使用任何标准品牌
精细镊子Fine Science Tools11253-20
HBSSSigmaaldrichH8264-1L
固定海绵自制
倒置显微镜NikonEclipse Ts2R
SCA EvolutionMicroptic
小型解剖剪刀Fine Science Tools14090-09
氯化钠 (NaCl)SigmaaldrichS9888
台式涡旋振荡器LabnetC1301B
TricaineSigmaaldrichA5040

参考文献

  1. Shima, A., Mitani, H. Medaka as a research organism: past, present and future. Mechanisms of Development. 121 (7-8), 599-604 (2004).
  2. Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka - a model organism from the far east. Nature Reviews Genetics. 3 (1), 53-64 (2001).
  3. Kasahara, M., et al. The medaka draft genome and insights into vertebrate genome evolution. Nature. 447 (7145), 714-719 (2007).
  4. Matsuda, M., et al. DMY is a Y-specific DM-domain gene required for male development in the medaka fish. Nature. 417 (6888), 559-563 (2002).
  5. Sakamoto, T., Kozaka, T., Takahashi, A., Kawauchi, H., Ando, M. Medaka (Oryzias latipes) as a model for hypoosmoregulation of euryhaline fishes. Aquaculture. 193 (3-4), 347-354 (2001).
  6. Royan, M. R., et al. 3D atlas of the pituitary gland of the model fish medaka (Oryzias latipes). Frontiers in Endocrinology. 12, 719843(2021).
  7. Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. Healthy brain-pituitary slices for electrophysiological investigations of pituitary cells in teleost fish. Journal of Visualized Experiments. (138), e57790(2018).
  8. Fontaine, R., Weltzien, F. -A. Labeling of blood vessels in the teleost brain and pituitary using cardiac perfusion with a dii-fixative. Journal of Visualized Experiments. (148), e59768(2019).
  9. Ager-Wick, E., et al. Preparation of a high-quality primary cell culture from fish pituitaries. Journal of Visualized Experiments. (138), e58159(2018).
  10. Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. Journal of Visualized Experiments. (46), e1937(2010).
  11. Wiley-Blackwell. Medaka: Biology, Management, and Experimental Protocols. , Wiley-Blackwell. (2019).
  12. Royan, M. R., et al. Gonadectomy and blood sampling procedures in the small size teleost model japanese medaka (Oryzias latipes). Journal of Visualized Experiments. (166), e62006(2020).
  13. Bhat, I. A., et al. Testicular development and spermatogenesis in fish: insights into molecular aspects and regulation of gene expression by different exogenous factors. Reviews in Aquaculture. 13 (4), 2142-2168 (2021).
  14. vander Horst, G., Garcia Alvarez, O., Garde, J. J., Soler, A. J., Jones, D. Status of sperm functionality assessment in wildlife species: From fish to primates. Animals. 11 (6), 1491(2021).
  15. Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 130 (4), 425-433 (2001).
  16. Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish. Aquaculture. 234 (1-4), 1-28 (2004).
  17. Yang, H., Tiersch, T. R. Sperm motility initiation and duration in a euryhaline fish, medaka (Oryzias latipes). Theriogenology. 72 (3), 386-392 (2009).
  18. Hashimoto, S., et al. Effects of ethinylestradiol on medaka (Oryzias latipes) as measured by sperm motility and fertilization success. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 56 (2), 253-259 (2009).
  19. Hara, Y., Strüssmann, C. A., Hashimoto, S. Assessment of short-term exposure to nonylphenol in Japanese medaka using sperm velocity and frequency of motile sperm. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 53 (3), 406-410 (2007).
  20. Kawana, R., Strüssmann, C. A., Hashimoto, S. Effect of p-Nonylphenol on sperm motility in Japanese medaka (Oryzias latipes). Fish Physiology and Biochemistry. 28, 213-214 (2003).
  21. Gallego, V., Herranz-Jusdado, J. G., Rozenfeld, C., Pérez, L., Asturiano, J. F. Subjective and objective assessment of fish sperm motility: when the technique and technicians matter. Fish Physiology and Biochemistry. 44 (6), 1457-1467 (2018).
  22. Browne, R. K., et al. Sperm motility of externally fertilizing fish and amphibians. Theriogenology. 83 (1), 1-13 (2015).
  23. Arias Padilla, L. F., et al. Cystic proliferation of germline stem cells is necessary to reproductive success and normal mating behavior in medaka. eLife. 10, 62757(2021).
  24. Okuyama, T., Yokoi, S., Takeuchi, H. Molecular basis of social competence in medaka fish. Development, Growth, and Differentiation. 59 (4), 211-218 (2017).
  25. Okubo, K., et al. Forebrain Gonadotropin-releasing hormone neuronal development: Insights from transgenic medaka and the relevance to X-linked Kallmann syndrome. Endocrinology. 147 (3), 1076-1084 (2006).
  26. Hodne, K., Fontaine, R., Ager-Wick, E., Weltzien, F. A. Gnrh1-induced responses are indirect in female Medaka Fsh cells, generated through cellular networks. Endocrinology. 160 (12), 3018-3032 (2019).
  27. Karigo, T., et al. Whole brain-pituitary in vitro preparation of the transgenic Medaka (Oryzias latipes) as a tool for analyzing the differential regulatory mechanisms of LH and FSH release. Endocrinology. 155 (2), 536-547 (2014).
  28. Kowalska, A., Kowalski, R., Zakęś, Z. The effect of selective cyclooxygenase (COX) inhibitors on japanese medaka (Oryzias latipes) reproduction parameters. World Academy of Science, Engineering and Technology. 77, 19-23 (2011).
  29. Kowalska, A., Siwicki, A. K., Kowalski, R. K. Dietary resveratrol improves immunity but reduces reproduction of broodstock medaka Oryzias latipes (Temminck & Schlegel). Fish Physiology and Biochemistry. 43 (1), 27-37 (2007).
  30. Tan, E., Yang, H., Tiersch, T. R. Determination of sperm concentration for small-bodied biomedical model fishes by use of microspectrophotometry. Zebrafish. 7 (2), 233-240 (2010).
  31. Harvey, B., Kelley, R. N., Ashwood-Smith, M. J. Cryopreservation of zebra fish spermatozoa using methanol. Canadian Journal of Zoology. 60 (8), 1867-1870 (1982).
  32. Wasden, M. B., Roberts, R. L., DeLaurier, A. Optimizing sperm collection procedures in Zebrafish. Journal of the South Carolina Academy of Science. 15 (2), 7(2017).
  33. Draper, B. W., Moens, C. B. A High-throughput method for Zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiments. (29), e1395(2009).
  34. Castellini, C., Dal Bosco, A., Ruggeri, S., Collodel, G. What is the best frame rate for evaluation of sperm motility in different species by computer-assisted sperm analysis. Fertility and Sterility. 96 (1), 24-27 (2011).
  35. Acosta, I. B., et al. Effects of exposure to cadmium in sperm cells of zebrafish, Danio rerio. Toxicology Reports. 3, 696-700 (2016).
  36. Wilson-Leedy, J. G., Kanuga, M. K., Ingermann, R. L. Influence of osmolality and ions on the activation and characteristics of zebrafish sperm motility. Theriogenology. 71 (7), 1054-1062 (2009).
  37. Alavi, S. M. H., Cosson, J. Sperm motility in fishes. (II) Effects of ions and osmolality: A review. Cell Biology International. 30 (1), 1-14 (2006).
  38. Kowalska, A., Kamaszews ki, M., Czarnowska-Kujawska, M., Podlasz, P., Kowalski, R. K. Dietary ARA improves COX activity in broodstock and offspring survival fitness of a model organism (Medaka Oryzias latipes). Animals. 10 (11), 2174(2020).
  39. Inoue, K., Takei, Y. Asian medaka fishes offer new models for studying mechanisms of seawater adaptation. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 136 (4), 635-645 (2003).
  40. Zadmajid, V., Myers, J. N., Sørensen, S. R., Ernest Butts, I. A. Ovarian fluid and its impacts on spermatozoa performance in fish: A review. Theriogenology. 132, 144-152 (2019).
  41. Poli, F., Immler, S., Gasparini, C. Effects of ovarian fluid on sperm traits and its implications for cryptic female choice in zebrafish. Behavioral Ecology. 30 (5), 1298-1305 (2019).
  42. Cosson, J., Groison, A. L., Suquet, M., Fauvel, C., Dreanno, C., Billard, R. Studying sperm motility in marine fish: An overview on the state of the art. Journal of Applied Ichthyology. 24 (4), 460-486 (2008).
  43. Beirão, J., Soares, F., Herráez, M. P., Dinis, M. T., Cabrita, E. Sperm quality evaluation in Solea senegalensis during the reproductive season at cellular level. Theriogenology. 72 (9), 1251-1261 (2009).
  44. Beirão, J., et al. Sperm handling in aquatic animals for artificial reproduction. Theriogenology. 133, 161-178 (2019).
  45. Yang, H., Tiersch, T. R. Current status of sperm cryopreservation in biomedical research fish models: Zebrafish, medaka, and Xiphophorus. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 149 (2), 224-232 (2009).
  46. Yang, H., Tiersch, T. R. Sperm cryopreservation in biomedical research fish models. Cryopreservation in Aquatic Species. 2, 439-454 (2011).
  47. Viveiros, A., Fessehaye, Y., ter Veld, M., Schulz, R., Komen, H. Hand-stripping of semen and semen quality after maturational hormone treatments, in African catfish Clarias gariepinus. Aquaculture. 213 (1-4), 373-386 (2002).
  48. Ransom, D. G., Zon, L. I. Appendix 3 collection, storage, and use of Zebrafish sperm. Methods in Cell Biology. 60, 365-372 (1998).
  49. Cosson, J. Frenetic activation of fish spermatozoa flagella entails short-term motility, portending their precocious decadence. Journal of Fish Biology. 76 (1), 240-279 (2010).
  50. Kowalski, R. K., Cejko, B. I. Sperm quality in fish: Determinants and affecting factors. Theriogenology. 135, 94-108 (2019).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

硬骨鱼类腹部按摩睾丸解剖精子活力精子质量生育力评估生态毒理学模型
硬骨鱼类模型日本青鳉（Oryzias latipes）的精子采集与计算机辅助精子分析
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。