硬骨模型日本青鳉鱼（Oryzias latipes）中的精子收集和计算机辅助精子分析

摘要

本文介绍了两种从小型模式鱼青鳉鱼（Oryzias latipes）收集精子的快速有效方法，以及使用计算机辅助精子分析（CASA）可靠地评估精子质量的方案。

摘要

日本青鳉鱼（Oryzias latipes）是一种硬骨鱼类，也是用于生态毒理学、发育、遗传学和生理学研究的新兴脊椎动物模型。青鳉鱼还广泛用于研究脊椎动物的繁殖，这是一项基本的生物学功能，因为它允许物种永存。精子质量是男性生育能力的重要指标，因此也是生殖成功的重要指标。提取精子和精子分析的技术在许多物种（包括硬骨鱼）中都有很好的记录。收集精子在较大的鱼中相对简单，但在小型模型鱼中可能更复杂，因为它们产生的精子更少并且更脆弱。因此，本文介绍了日本青鳉鱼小型模型鱼的两种精子收集方法:睾丸解剖和腹部按摩。本文表明这两种方法对青鳉鱼都是可行的，并表明随着鱼从手术中快速恢复，腹部按摩可以重复进行多次。本文还描述了一种在青鳉鱼中进行计算机辅助精子分析的协议，以客观地评估青鳉鱼精子质量的几个重要指标（活力、渐进性、运动持续时间、相对浓度）。这些程序，为这个有用的小型硬骨模型指定，将大大增强对影响脊椎动物雄性生育能力的环境，生理和遗传因素的理解。

引言

日本青鳉鱼是一种产卵的小型淡水硬骨鱼，原产于东亚。青鳉鱼已成为生态毒理学，发育遗传学，基因组学以及进化生物学和生理学研究的优秀脊椎动物模型系统^1，2。与流行的斑马鱼类似，它们相对容易繁殖，并且对许多常见的鱼类疾病具有很强的抵抗力^1，2。使用青鳉鱼作为模型有几个优点，包括生成时间短、透明胚胎^1，2 和测序基因组³。与斑马鱼不同，青鳉鱼具有性别决定基因4以及高温（4-40°C）和盐度（欧盐碱物种）耐受^性5。此外，青鳉鱼还开发了许多遗传和解剖学工具，以及协议⁶，⁷，⁸，⁹，¹⁰，^{11，12，以促进}其生物学研究。

繁殖是一项基本的生理功能，因为它允许物种永存。脊椎动物的繁殖需要无数精确协调的事件，包括雌性卵母细胞的产生和雄性精子的产生。精子是独特的细胞，通过复杂的精子发生过程产生，其中有许多检查点来保证高质量产品的交付¹³。配子质量因其对受精成功率和幼虫存活的影响而成为水产养殖和鱼类种群研究的重点。因此，精子质量是脊椎动物雄性生育能力的重要指标。

评估鱼精子质量的三个有用因素是活力、渐进性和寿命。活力百分比和渐进运动是精子质量的常见指标，因为渐进运动是受精成功的必要条件，并且与受精成功密切相关^14，15。运动的持续时间也是鱼类的一个重要指标，因为在大多数硬骨动物中，精子保持完全活动的时间不到2分钟，并且精子的轨迹通常不如哺乳动物线性¹⁵。然而，过去许多评估精子活力的研究依赖于分析精子的主观或半定量方法^15，16。例如，青鳉鱼的精子活力过去曾在显微镜下目视估计¹⁷。通过记录精子运动和使用成像软件合并帧并测量游泳路径和速度¹⁸，¹⁹，^20，也进行了估计。这种方法通常缺乏稳健性，根据执行分析的人提供不同的结果^15，21。

计算机辅助精子分析（CASA）最初是为哺乳动物开发的。CASA是一种快速定量的方法，通过以自动方式记录和测量速度和轨迹来评估精子质量¹⁵。在鱼类中，它已被用于不同的物种，以监测几种水污染物对精子质量的影响，用于识别有趣的祖细胞以改善亲鱼，提高冷冻保存和储存的效率，并优化受精条件¹⁵。因此，它是可靠评估不同脊椎动物物种精子质量的有力工具。然而，由于鱼类之间繁殖策略的重要多样性，硬骨鱼的精子与哺乳动物的精子以及不同鱼类的精子不同。硬骨鱼主要通过将配子释放到水中来使卵子受精，精子高度浓缩，结构相对简单，没有顶体，不像哺乳动物在内部受精，因此不必补偿水中的稀释，但必须承受更粘稠的流体¹⁴。此外，大多数鱼的精子移动迅速，但在激活后不到 2 分钟即可完全活动，尽管有几个例外^15，22。由于大多数鱼类的运动能力会迅速下降，因此在确定鱼类的精子分析方案时，应格外小心地考虑激活后的分析时间。

繁殖是生物学领域之一，其中硬骨和青鳉鱼被广泛用作模式生物。事实上，青鳉鱼雄性表现出有趣的生殖和社会行为，例如配偶守卫^23，24。此外，存在几种转基因品系来研究该物种繁殖的神经内分泌控制²⁵，^26，27。精子采样是大型鱼类相对简单的程序，但在小型模型鱼中可能更复杂，因为它们产生的精子更少并且更脆弱。出于这个原因，大多数涉及青鳉鱼精子采样的研究通过粉碎解剖的睾丸¹⁷，^28，29，30来提取milt（鱼精液）。一些研究还使用改良的腹部按摩将喷雾直接表达到活化培养基¹⁸，^19，20中;然而，使用这种方法很难可视化提取的小米的数量和颜色。在斑马鱼中，腹部按摩通常用于表达milt，其立即收集在毛细管^31，32，33中。该方法可以估计精子的体积，以及观察射精的颜色，这是精子质量的快速而简单的指标^32，33。因此，青鳉鱼缺乏清晰且描述良好的精子收集和分析方案。

因此，本文介绍了日本青鳉鱼小模式鱼的两种精子采集方法:睾丸解剖和毛细管腹部按摩。它表明这两种方法对青鳉鱼都是可行的，并且表明随着鱼从手术中快速恢复，腹部按摩可以重复进行多次。它还描述了一种用于青鳉鱼计算机辅助精子分析的协议，以可靠地测量青鳉鱼精子质量的几个重要指标（活力、渐进性、寿命和相对精子浓度）。这些程序，为这个有用的小型硬骨模型指定，将大大增强对影响脊椎动物雄性生育能力的环境，生理和遗传因素的理解。

方案

所有实验和动物处理均按照挪威生命科学大学（NMBU）关于实验动物福利的建议进行。实验使用在NMBU（挪威Ås）饲养的成年（6-9个月大）雄性日本青鳉鱼（Hd-rR菌株）进行。这些方法还在国家农业，食品和环境研究所（INRAE，法国雷恩）饲养的9个月大的雄性日本青鳉鱼（CAB菌株）中进行了简短测试。

1. 仪器和溶液制备

1. 准备麻醉储备溶液（0.6%三卡因）。
   1. 在 100 mL 的 10x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中稀释 0.6 g 三卡因 （MS-222）。
   2. 将2mL麻醉储备溶液分装到50 2mL塑料管中，并储存在-20°C直至用于麻醉或安乐死。
2. 准备回收水（0.9%氯化钠[NaCl]溶液）。
   1. 将 27 克氯化钠加入 3 升水族箱水中。
   2. 将溶液储存在室温（RT）下直至使用。
3. 如有必要，调整活化剂（汉克平衡盐溶液[HBSS]）。
   注意:HBSS可以商业购买或在实验室制造（材料表）。
   1. 使用pH计测量HBSS的pH值。必要时使用盐酸或氢氧化钠调节pH值，因此最终pH值为7.1-7.3。
   2. 使用渗透压计测量HBSS的渗透压，以便将来报告。
      注意:商业产品的范围为 266-294 mOsmol/kg;在目前的研究中，渗透压浓度为287 mOsmol/kg。如果需要，可以用蒸馏水稀释以降低渗透压，但这不是必需的，因为在150-300mOsmol / kg HBSS中青鳉鱼精子的活化没有太大差异。
   3. 将溶液储存在室温下直至使用。
4. 准备保温海绵。
   1. 切一块柔软的海绵，使其紧贴在培养皿中。
   2. 在海绵中间切一条直线，该直线足够长以接收鱼（3-4厘米），深约1厘米（图1A）。海绵上的这个缝隙将保持鱼腹侧向上以暴露泄殖腔。

2. 精子采集

注意:精子收集可以通过两种不同的方法实现:腹部按摩或睾丸解剖。

1. 通过腹部按摩收集精子
   1. 通过将一管三卡因原液 （0.6%） 稀释在 100 mL 玻璃容器中的 38 mL 水族箱水中来制备 0.03% 麻醉液。
   2. 准备仪器，包括钝端光滑镊子和10μL一次性校准玻璃微量移液器和吸气管组件（图1A）。用麻醉液润湿在步骤1.4中制备的保持海绵。
   3. 用 36 μL 活化溶液制备试管，以便立即分析。在设置为27°C的水浴或培养箱中预热活化溶液至少5分钟。
      注意:虽然可以从单个鱼中分析样品，但可以通过在同一活化溶液中汇集来自多个雄性的样品来减少个体差异。合并来自多条鱼的样品时，每条鱼使用 36 μL 活化溶液。这种稀释可能需要根据所用青鳉鱼的菌株或饲养条件进行调整，因为这些因素会影响精子浓度和体积。CASA程序将指示浓度是否过高而无法识别精子。
   4. 通过将鱼放入麻醉溶液中30-90秒来麻醉鱼。
      注意:麻醉持续时间必须调整，因为它根据鱼的大小而变化。为确保鱼完全麻醉，请用镊子轻轻捏住尾柄。如果鱼没有反应，可以开始按摩。
   5. 将鱼从麻醉液中取出，用纸巾或轻轻擦干鱼的腹部。将鱼放在潮湿的保持海绵腹侧朝上的槽中，使其鳃暴露于海绵中的麻醉溶液中（图1B）。
   6. 如果泄殖腔周围的区域是湿的，请用一次性纸巾擦干鱼的底部。
   7. 将鱼放在解剖显微镜下的保持海绵中，并将微量移液管与吸引器管连接到鱼的泄殖腔上（图1C）。
   8. 按摩鱼的腹部，用钝端光滑的镊子轻轻挤压，同时吸吮以将排出的小米收集到移液管中（图1D）。
   9. 将鱼从海绵中释放到回收水中。让它们在溶液中恢复至少15分钟，然后再将它们返回到水族箱系统。
   10. 将小米转移到装有预热活化溶液的准备好的管中，并通过吸气管组件吸气和吹气上下移液数次。
   11. 在分析前，通过轻弹试管轻轻地匀浆稀释的精子。
       注意:为获得最佳结果，请在激活后立即（例如5秒）分析样品。在青鳉鱼中，如有必要，分析可能会延迟，因为精子会保持运动数小时，但随着运动性随时间而降低，样品之间的时间应保持一致。
2. 通过睾丸解剖收集精子
   1. 通过将两管三卡因原液 （0.6%） 稀释在 100 mL 玻璃容器中的 26 mL 水族箱水中来制备 0.08% 安乐死溶液。
   2. 准备解剖工具，包括钝钝和细镊子和小解剖剪刀（图1E）。
   3. 用 120 μL 活化溶液为每个样品准备一个试管，以便立即分析。在设置为27°C的水浴或培养箱中预热活化溶液至少5分钟。
      注意:虽然可以从单个鱼中分析样品，但可以通过在同一活化溶液中汇集来自多个雄性的样品来减少个体差异。要混合来自多条鱼的样品，每条鱼使用 120 μL 活化溶液。这种稀释可能需要根据所用青鳉鱼的菌株或饲养条件进行调整，因为这些因素会影响精子浓度和体积。CASA程序将指示浓度是否过高而无法识别精子。
   4. 通过将鱼放入0.08%麻醉液中30-90秒来对鱼实施安乐死。
      注意:持续时间取决于鱼的大小。为了确保鱼被安乐死，请等待盖膜运动停止。鱼不应该对镊子的触摸做出反应。
   5. 从安乐死溶液中取出鱼，用纸巾轻轻擦干鱼或轻轻擦拭。
      注意:在此步骤中，可以对鱼进行称重，以稍后计算性腺体指数（GSI，性腺重量/体重）。
   6. 将鱼放在解剖显微镜下，其左侧朝上（图1F）。
   7. 使用小解剖剪刀，从泄殖腔背侧切一个皮瓣，然后穿过肋骨到鳃以暴露内脏（图1G）。
   8. 找到睾丸，用细镊子切开两端的附件，然后取出睾丸（图1H）。
      注意:要计算GSI，可以在此步骤中称量睾丸。快速工作以避免组织干燥。
   9. 将睾丸转移到装有预热活化溶液的准备好的管中。
   10. 用镊子将睾丸压在管子的侧面几次以释放精子。精子释放通常可以可视化，并且会使解决方案略微浑浊。
   11. 在分析前，通过轻弹试管轻轻地匀浆稀释的精子。
       注意:为获得最佳结果，请在激活后立即（例如5秒）分析样品。在青鳉鱼中，如有必要，分析可能会延迟，因为精子会保持运动数小时，但随着运动性随时间而降低，样品之间的时间应保持一致。

图1:通过腹部按摩（A-D）和睾丸夹层（E-H）收集的。 （A） 腹部按摩器械:握住海绵、钝光滑镊子和带吸气管组件的 10 μL 一次性校准玻璃微量移液器;（B）鱼在保持海绵中的位置，鳃暴露在海绵中的麻醉下，泄殖腔朝上;（C）腹部钝性光滑镊子和微量移液器对泄殖腔的位置;（D）轻轻按摩和吸吮后用微量移液器涂抹。（五）睾丸清扫器具:钝钳、细镊、小解剖剪刀;（六）鱼解剖睾丸的位置;（G） 内脏的侧视图;（H）用细镊子切割两端的附件来去除睾丸。比例尺:2毫米。 请点击此处查看此图的大图。

3. 使用CASA系统进行精子分析

1. CASA系统（SCA演化）应根据手册使用显微镜进行设置，使用绿色滤光片和带相差的10倍物镜。
2. 通过在加热板上或在设置为27°C的培养箱中预热至少5分钟来制备一次性20μm计数室载玻片。
3. 打开精子分析软件并选择运动模块。
4. 设置青鳉鱼的配置，如图 2B 所示。
5. 将预热的一次性20μm计数室载玻片放在显微镜下设置为27°C的加热载物台上。
6. 将样品移液到载玻片上的腔室中，直到它充满腔室而不会过度填充。用棉签小心地擦去腔室入口处多余的样品，或轻轻擦拭以防止细胞漂浮。
7. 选择 "分析" 以在显微镜下观察样品。
   注意:如果显微镜图标为红色，则需要调整显微镜照明以使程序准确跟踪精子。调整显微镜的亮度，以便清楚地看到精子的尾巴运动。图标应为蓝色。
8. 确保显微镜聚焦，然后再次选择 分析 以记录田野中的精子。移动幻灯片，使样本的新区域位于框架中，然后重复以捕获 3-5 个不同的视野。避免有气泡、细胞团或伪影的磁场。
9. 选择"结果"以查看 结果 。
   注意:如果结果页面上的字段以红色突出显示，请按照系统的提示删除浓度或运动性差异太大的字段。
10. 双击字段以查看单个字段的结果，或手动检查是否有任何错误标记或未跟踪的精子。如有必要，右键单击单个精子以重新标记运动性（图2A）。

图 2:SCA 演进软件截图。 （A）一个领域的精子跟踪结果。右侧查看田间数据，双击精子查看单个数据;（B） 打开配置菜单的所有字段的结果摘要。请点击此处查看此图的大图。

结果

获得的数据类型
SCA Evolution软件的精子活力分析提供了有关运动性（活动和非活动精子的百分比）以及渐进性（进行性和非进行性精子的百分比）和速度（快速，中等和缓慢移动精子的百分比）的数据。它还结合了渐进性和速度（快速渐进，中等渐进，非渐进）。这些标签基于程序提供的精子运动的测量（图3A）和计算（图3B）（补充表1）。对于青鳉鱼，以下阈值是根据基于先前文献19，^34，35的推荐斑马鱼参数和来自¹⁸个个体的青鳉鱼数据分布改编的。运动性基于曲线速度（VCL），不动<10μm/s≤慢速<20μm/s≤中等≤40μm/s<快速。如果直线指数 （STR） > 68%，则认为精子是渐进...

讨论

渗透压是鱼精子活化的重要因素^36，37。一般来说，精子在睾丸中是不动的，并且在相对于海洋鱼类的具有高渗性的介质中变得活跃，对于淡水鱼而言，相对于具有低渗透性³⁷。与血液类似，淡水鱼的精浆通常低于海洋鱼类（约300 mOsmol/kg，而400 mOsmol/kg）^22，37。因此，鱼精子通常在与它们生活的水接触时被激活，这种水是精子分析的最佳和最生物活化介质。然而，通过腹部按摩和睾丸解剖采样的青鳉鱼精子在两个不同实验室饲养的Hd-rR或CAB菌株青鳉鱼的水族箱水中（图4A）中不运动。此外，287 mOsmol/kg HBSS的运动性高于36 mOsmol/kg HBSS（图4C），这对于淡水鱼来说是不寻常的。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 试管	Axygen	MCT-150-C	任何标准品牌均可使用
10 µL 一次性校准玻璃微量移液器和吸气管组件	Drummond	2-000-010
10 10 倍相差物镜	尼康	MRP90100
2 mL 管	Axygen	MCT-200-c-s	任何标准品牌都可以使用
钝镊子	Fine Science Tools	11000-12
钝光滑镊子	Millipore	XX6200006P
一次性 20 微米计数室载玻片	Microptic	20.2.25	Leja 2 腔载玻片
解剖显微镜	奥林巴斯	SZX7	任何标准品牌都可以使用
精细镊子	精细科学工具	11253-20
HBSS	Sigmaaldrich	H8264-1L
固定海绵	自制
倒置显微镜	尼康	Eclipse Ts2R
SCA Evolution	Microptic
小型解剖剪刀	精细科学工具	14090-09
氯化钠 （NaCl）	Sigmaaldrich	S9888
台式涡旋	Labnet	C1301B
三卡因	Sigmaaldrich	A5040