免疫荧光染色过程中使用酪胺信号放大技术，可灵敏地检测 HSV-1 感染后 ZBP1 介导的坏死性凋亡过程中磷酸化的 RIPK3 和 MLKL。
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本文内容
摘要
摘要
受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3（RIPK3）及其底物混合谱系激酶结构域样蛋白（MLKL）是坏死性凋亡的关键调控因子，坏死性凋亡是一种具有重要抗病毒功能的炎症性细胞死亡形式。RIPK3的自磷酸化可诱导MLKL（坏死性凋亡的成孔效应蛋白）的磷酸化和活化。磷酸化的MLKL在细胞膜上转运并寡聚化，最终导致细胞裂解，这是坏死性凋亡的典型特征。核酸传感器ZBP1在感染RNA病毒和DNA病毒后，通过结合左旋Z型双链RNA（Z-RNA）而被激活。ZBP1的激活可通过诱导受感染宿主细胞发生程序性细胞死亡（包括坏死性凋亡）来限制病毒感染。免疫荧光显微镜技术可在单细胞水平上可视化ZBP1介导的坏死性凋亡下游的不同信号转导步骤。然而，使用目前市售的针对人RIPK3和MLKL的磷酸化特异性抗体进行常规荧光显微镜检测时，其灵敏度不足以实现这些标志物的可重复成像。本文中，我们描述了一种优化的染色方法，用于检测单纯疱疹病毒1型（HSV-1）感染的人HT-29细胞中丝氨酸（S）位点磷酸化的RIPK3（S227）和MLKL（S358）。在免疫荧光染色流程中引入酪胺信号放大（TSA）步骤，可实现对S227位点磷酸化RIPK3的特异性检测。此外，TSA显著提高了S358位点磷酸化MLKL的检测灵敏度。该方法整体上实现了对ZBP1诱导坏死性凋亡过程中这两个关键信号事件的可视化。
引言
受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3（RIPK3）和混合谱系激酶结构域样蛋白（MLKL）是调控坏死性凋亡的关键分子1,2。坏死性凋亡是一种溶细胞性、促炎性的程序性细胞死亡方式，参与抗病毒免疫和自身炎症反应。病毒感染细胞发生坏死性凋亡可迅速终止病毒复制。坏死性凋亡引发的细胞裂解还会释放损伤相关分子模式（DAMPs），从而激活抗病毒免疫应答3,4。坏死性凋亡的启动依赖于RIPK3的活化，该过程由RIP同源相互作用基序（RHIM）介导，与三种上游激活分子之一结合：RIPK1（在肿瘤坏死因子受体1 [TNFR1] 激活时）、含TIR结构域的干扰素β诱导衔接蛋白（TRIF；在Toll样受体3和4激活时）或抗病毒核酸传感器Z-DNA结合蛋白1（ZBP1）1,2。坏死性凋亡信号通路通过一系列磷酸化事件传递，起始于RIPK3的自磷酸化。人RIPK3在其激酶结构域内丝氨酸（S）227位点的自磷酸化是其与MLKL相互作用的前提条件，也是人RIPK3活化及坏死性凋亡发生的常用生化标志1,5....
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方案
1. 生物素化酪胺的制备
- 从生物素-酪胺开始制备生物素化酪胺。配制10 mM储存液时，将3.6 mg生物素-酪胺溶解于1 mL DMSO中。为保持其质量，将溶解后的产物分装后于−20 °C保存。
2. 培养 HT-29 细胞的维持
注意：表达 ZBP1 的 HT-29 细胞系通过携带编码人源 ZBP1 基因的慢病毒载体转导而获得27。
- 将表达 ZBP1 的 HT-29 细胞培养于添加了 L-谷氨酰胺、丙酮酸钠和 10% 胎牛血清的 McCoy's 5A 培养基中（以下简称完全培养基），并在 37 °C、5% 二氧化碳的培养箱中维持培养。建议使用低代次细胞（低于 10 代）。细胞复苏后需在实验开始前至少恢复培养 5 天。
- 为使细胞从培养瓶中脱落，先吸去培养基，用 5 mL 预热至 37 °C 的 PBS 洗涤细胞。随后向细胞中加入适量预热至 37 °C 的胰蛋白酶/EDTA 溶液（分别为 0.05% 胰蛋白酶和 0.032% EDTA）（T75 培养瓶加 2 mL，T175 培养瓶加 3 mL）。
- 将细胞在 37 °C、5% 二氧化碳的培养箱中孵育最多 10 分钟。之后轻敲培养瓶，并在显微镜下使用 4x–20....
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结果
在人类细胞中，MLKL 磷酸化以及特别是 RIPK3 磷酸化的免疫荧光检测在技术上具有挑战性26。本文介绍了一种在 ZBP1 激活后检测人源 p-RIPK3 (S227) 和 p-MLKL (S358) 的改进染色方案。该方案包含一个 TSA 步骤，以提高荧光信号的检测限和灵敏度。为验证该方法，我们对 TSA 介导的免疫荧光染色与标准的间接荧光染色法在 p-RIPK3 (S227) 和 p-MLKL (S358) 检测中的效果进行了平行对照比较。
表达人源 ZBP1 的 HT-29 细胞感染 ICP6 RHIM 突变型 HSV-1 毒株（HSV-1 ICP6mutRHIM) 以诱导ZBP1介导的坏死性凋亡及RIPK3磷酸化。HSV-1 ICP6mutRHIM 该毒株在 ICP6 RHIM 区域内携带 VQCG 至 AAAA 的突变，无法阻断 ZBP1 下游的坏死性凋亡信号传导14,15<.......
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讨论
本免疫荧光染色方案描述了使用酪胺信号放大（tyramide signal amplification, TSA）技术来提高对人坏死性凋亡信号通路中难以检测的信号事件的灵敏度，包括RIPK3和MLKL的磷酸化26。引入TSA步骤显著改善了p-RIPK3（S227）和p-MLKL（S358）的检测阈值，并提高了p-MLKL（S358）染色的灵敏度。TSA揭示出在模拟处理（mock-treated）样本中已存在p-RIPK3（S227）信号。在人细胞中，RIPK3在S227位点的自磷酸化是坏死性凋亡激活的前提，因其可促进与MLKL形成稳定的相互作用。该过程在基础状态下即已发生，并在坏死性凋亡诱导前导致稳定的非活性p-RIPK3（S227）/MLKL二聚体的形成2,5,31。类似地，本研究中使用的抗p-RIPK3抗体亦可通过Western印迹在未处理细胞中检测到p-RIPK3（S227）
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢VIB生物成像中心 提供的培训、支持以及仪器平台的使用权限。J.N. 获得了佛兰德研究基金会（FWO）博士奖学金的资助。J.M. 课题组的研究得到了奥德修斯II项目（G0H8618N）、EOS INFLADIS（40007512）、佛兰德研究基金会（FWO）青年研究基金（G031022N）、CRIG青年研究者概念验证基金以及根特大学的资助。P.V. 课题组的研究得到了EOS MODEL-IDI（30826052）、EOS INFLADIS（40007512）、FWO高级研究基金（G.0C76.18N、G.0B71.18N、G.0B96.20N、G.0A9322N）、梅瑟瑟姆计划（BOF16/MET_V/007）、iBOF20/IBF/039 ATLANTIS、抗癌基金会（F/2016/865、F/2020/1505）、CRIG和GIGG合作项目以及VIB的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗体 | |||
| 抗兔 HRP | Agilent Technologies Belgium | K4002 | Envision+ System-HRP 标记聚合物抗兔抗体 |
| 山羊抗小鼠 DyLight 633 | Thermofisher | 35513 | 二抗 |
| HSV-1 ICP0 | Santa Cruz | sc-53070 | 小鼠抗 ICP0（HSV-1）抗体 |
| IAV-PR8 小鼠血清 | 实验室自制 | xx | 小鼠抗 IAV-PR8 多克隆抗体 |
| pMLKL | Abcam | ab187091 | 兔抗 MLKL-磷酸化 S358 抗体 |
| pRIPK3 | Abcam | ab209384 | 兔抗 RIPK3-磷酸化 S227 抗体 |
| 荧光染料 | |||
| DAPI | Thermofisher | D21490 | 用于显示细胞核 |
| 与 Alexa Fluor 568 偶联的链霉亲和素 | Thermofisher | S11226 | 用于显示生物素分子 |
| 化合物 | |||
| 30% H2O2 | Sigma | H1009 | 氧化底物，HRP 活性所必需 |
| 4% PFA | SANBIO | AR1068 | 用于固定/交联细胞 |
| 生物素化酪胺 | R&D Systems | 6241 | 用于信号放大，HRP 底物 |
| BV-6 | Selleckchem | S7597 | BV6 IAP 抑制剂 |
| 用于细胞培养：使细胞脱离 | |||
| 8.0 g/L NaCl | |||
| 0.4 g/L EDTA 二钠盐 | |||
| EDTA 0.04% | 实验室配制 | 1.1 g/L Na2HPO4 | |
| 0.2 g/L NaH2PO4 | |||
| 0.2 g/L KCl | |||
| 0.2 g/L 葡萄糖 | |||
| 胎牛血清 | TICO | FBS EU XXX | 用于细胞培养，维持细胞生长；批号：90439 |
| GSK'840 | Aobious | AOB0917 | RIPK3 激酶抑制剂 |
| L-谷氨酰胺 | Sigma-Aldrich | G7513 | 用于细胞培养，维持细胞生长 |
| MAXblock | Active Motif | 15252 | 封闭液 |
| PBS | Gibco | 10444402 | |
| 丙酮酸钠 | Sigma-Aldrich | S8636 | 用于细胞培养，维持细胞生长 |
| TNF-α | 实验室自制 | - | 信号分子，可与 BV6 和 zVAD 联合触发细胞死亡 |
| 吐温 X-100 | Sigma Aldrich | T8787-50ML | 用于细胞透化 |
| 台盼蓝 | Merck | 11732 | 用于细胞计数，作为活/死细胞标记物，使用浓度为 0.1% |
| 胰蛋白酶 | Sigma-Aldrich | T4424 | 用于细胞培养：使细胞脱离 |
| zVAD | Bachem | BACE4026865.0005 | Z-Val-Ala-DL-Asp-氟甲基酮 |
| 材料 | |||
| µ-载玻片 8 孔高玻璃底 | iBidi | 80807 | 用于细胞培养 |
| 棉签球-中号 | Electron Microscopy Sciences | 71001-10 | 用于清洁物镜 |
| Immersol 518 F / 30 °C | ZEISS | 444970-9000-000 | 用于高倍镜下观察样本 |
| 镜头清洁剂 | ZEISS | 000000-0105-200 | 用于清洁物镜 |
| LSM880 Fast Airyscan 共聚焦显微镜 | 用于观察样本 | ||
| 软件 | |||
| Excel | Office | xx | 用于数据处理 |
| Prism 9 | Graphpad | xx | 用于数据分析——统计检验与图表生成 |
| Volocity 6.3 | Volocity | xx | 用于定量分析 |
| Zen black | ZEISS | xx | 用于图像采集与处理 |
| Zen blue | ZEISS | xx | 用于图像观察 |
| 病毒 | |||
| HSV-1（mutRHIM）F 株 | 由 Dr. Jiahuai Han 制备 | 实验室扩增 | HSV-1 作为坏死性凋亡的诱导剂；UL39/ICP6 的 RHIM 核心结构域发生突变（VQCG>AAAA） |
| HSV-1（WT）F 株 | 由 Dr. Jiahuai Han 制备 | 实验室扩增 | HSV-1（野生型）作为坏死性凋亡诱导的阴性对照（ICP6 抑制） |
| IAV PR8 | 实验室库存 | 实验室扩增 | IAV 作为坏死性凋亡的诱导剂 |
参考文献
- Meng, Y., Sandow, J. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The regulation of necroptosis by post-translational modifications. Cell Death & Differentiation. 28 (3), 861-883 (2021).
- Petrie, E. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The structural basis of necroptotic c....
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重印与许可
