一种用于研究膜曲率感应蛋白的纳米棒支撑脂双层系统 体外

摘要

在此，开发了一种基于纳米棒支撑的脂质双层系统，以构建具有确定曲率的合成膜，从而实现对具有曲率感知能力的蛋白质进行表征 体外.

摘要

膜曲率发挥着重要作用 在细胞的多种基本过程中，如细胞迁移、细胞分裂和囊泡运输中发挥重要作用。它不仅由细胞活动被动产生，还能主动调控蛋白质相互作用，并参与多种细胞内信号传导。因此，研究膜曲率在调控蛋白质与脂质分布及动态行为中的作用具有重要意义。近年来，已发展出多种技术用于研究弯曲膜与蛋白质之间的关系 体外与传统技术相比，新开发的纳米条支撑脂质双层（SLB）通过在具有预定义膜曲率和局部平坦对照的纳米条图案化阵列上形成连续的脂质双层，实现了高通量和更精确的膜曲率生成。利用荧光显微成像，可对脂质流动性及蛋白质对曲率膜的敏感性进行定量表征。本文详细介绍了在含有纳米条阵列的制备玻璃表面形成SLB的具体操作步骤。 并介绍了在该类支持性脂双层（SLB）上曲率敏感蛋白的表征方法。此外，还涵盖了纳米芯片重复使用及图像处理的实验方案。除纳米条形SLB外，本方案可直接适用于各类用于曲率感知研究的纳米结构化玻璃芯片。

引言

膜曲率是细胞的一个关键物理参数，在形态发生、细胞分裂和细胞迁移等多种细胞过程中均会呈现¹。目前普遍认为，膜曲率不仅仅是细胞活动的简单结果，而已被证实可有效调控蛋白质相互作用和细胞内信号传导。例如，研究发现参与网格蛋白介导的内吞作用的多种蛋白质更倾向于结合弯曲的膜结构，从而形成内吞作用的热点区域²。导致膜变形的原因多种多样，包括细胞骨架作用力对膜的牵拉、具有不同大小头部基团的脂质不对称分布、呈圆锥形的跨膜蛋白的存在、BAR结构域蛋白（以Bin、amphiphysin和Rvs蛋白命名）等膜塑形蛋白的聚集，以及两亲性螺旋结构域插入膜中¹。有趣的是，这些蛋白质和脂质不仅能引起膜变形，还可感知膜曲率并表现出优先富集的特性¹。因此，研究不同曲率的膜是否以及如何改变其上附着的蛋白质和脂质的分布与动态行为，及其对相关细胞内过程的潜在影响，具有重要意义。

已开发出多种技术用于分析活细胞和固定细胞中弯曲膜与蛋白质之间的相互作用 体外 系统。活细胞系统提供了具有丰富脂质多样性和动态蛋白质信号调控的真实细胞环境^2,3,4....

方案

1. 纳米芯片的清洗

1. 将纳米芯片置于10 mL烧杯中，有图案的一面朝上。
   注意：该石英纳米芯片已经制备完成 通过 电子束光刻，如前所述²¹芯片上纳米结构的几何形状和排列方式可进行定制化设计。此处使用的梯度纳米条尺寸为：长度2000 nm，高度600 nm，宽度范围100至1000 nm（步长100 nm）。
2. 小心地将1 mL 98%硫酸加入烧杯中，确保酸液完全覆盖芯片的正面和背面。
   注意：98% 硫酸具有极强腐蚀性，接触皮肤或眼睛后可迅速造成组织损伤和严重的化学灼伤。应在通风橱中使用，并做好适当防护。
3. 缓慢旋转烧杯，并逐滴加入200 µL 30%过氧化氢，直至整个烧杯变热。确保硫酸与过氧化氢充分混合，形成芬顿溶液，以去除纳米芯片上的有机分子¹⁷在洁净的亲水性表面上制备SLB还有其他可选技术，例如前文所述的紫外光和臭氧处理。²³.
   注意：该反应为强放热反应，可能导致溶液沸腾，因此需将过氧化氢逐滴加入硫酸中，并持续旋转容器。
4. 将烧杯放入次级玻璃容器中，并使纳米芯片在piranha溶液中浸泡过夜，以彻底清除杂质。
   注意：将烧杯置于通风橱内，不要加盖，以防反应产生气体。
5. 将烧杯取出，小心地....

结果

建议使用纳米棒结构来研究感知正曲率的蛋白质，该结构两端各包含一个半圆形，其曲率由纳米棒的宽度定义，并在中心局部设有一个平坦/零曲率的对照区域（图2A，B）。在纳米棒上成功形成支持性脂双层（SLB）后，脂质标记信号在整个纳米棒表面均匀分布，如图2C所示。通过平均多个单独纳米棒的图像，可将多个纳米棒的信号合并（图2D），从而最小化不同纳米棒之间的随机差异。此前的一项电子显微镜研究表明，细胞质膜能够完全贴合地包裹整个纳米结构²⁴。因此，合成脂双层也被认为能紧密附着于纳米结构表面，这在200 nm纳米棒上形成了衍射极限宽度的线条，如图4E所示。此外，纳米棒曲面SLB上的膜流动性还可通过荧光漂白恢复（FRAP）实验进行表征，其中单个纳米棒上的荧光信号可被单独漂白，以实现对膜流动性的分析（

讨论

本文所述的纳米棒-支持性脂双层（nanobar-SLB）系统结合了多种现有体外（in vitro）检测方法的优势。该系统能够高效揭示蛋白质对高度弯曲膜的优先结合特性，类似于脂质体漂浮或沉降实验，但所需样品量显著减少，并且在单个纳米棒上可提供更精确控制的曲率^8,29。它还像SLiC实验一样，可在同一平台上实现多种精确调控曲率的并行比较，同时由于SLB具有流动性并能紧密覆盖所有尺寸的纳米棒，因此无需担忧不同曲率下脂质组成的变化，也避免了因结构尺寸低于光衍射极限而无法检测到的形貌或曲率变化³⁰。nanobar-SLB还允许观察蛋白质在弯曲膜上的动态行为，类似于拴绳拉拔实验，但不受制备膜管通量的限制，也无需依赖光镊操作的技术经验¹³。尽管SMrT实验可高通量生成膜纳米管，但膜管上的曲率沿长度方向变化，使得研究蛋白质对曲率的敏感性更加困难¹⁶。更有意义的是，与其他基于图案.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无水乙醇	Sigma-Aldrich	100983
铝箔	Diamond	RN0879999FU
棕色小瓶	Sigma-Aldrich	27115-U
脑源性磷脂酰丝氨酸：L-α-磷脂酰丝氨酸（脑组织，猪源）（钠盐）	Avanti Polar Lipids, Inc.	840032
10 mL 烧杯	Schott-Duran	SCOT211060804
50 mL 烧杯	Schott-Duran	SCOT211061706
1000 mL 烧杯	Schott-Duran	SCOT211065408	第二个容器
氯仿	Sigma-Aldrich	V800117
棉签	Watsons
18:1 DGS-NTA(Ni)：1,2-二油酰基-sn-甘油-3-[(N-(5-氨基-1-羧基戊基)亚氨基二乙酸)琥珀酰基]（镍盐）	Avanti Polar Lipids, Inc.	790404
蛋源性磷脂酰胆碱：L-α-磷脂酰胆碱（蛋黄，鸡源）	Avanti Polar Lipids, Inc.	840051
F-BAR	新加坡南洋理工大学生物科学学院蛋白质生产平台		蛋白质与多肽
F-BAR+IDR	新加坡南洋理工大学生物科学学院蛋白质生产平台		蛋白质与多肽
GFP	新加坡南洋理工大学生物科学学院蛋白质生产平台		蛋白质与多肽
GFP-His	新加坡南洋理工大学生物科学学院蛋白质生产平台		蛋白质与多肽
GraphPad Prism	GraphPad	V9.0.0
过氧化氢，30%（ACS认证）	Thermo Scientific	H325-500
人源FBP17的IDR片段	上海桑谷生物医药有限公司
ImageJ	美国国立卫生研究院	1.50d
激光扫描共聚焦显微镜	Zeiss	LSM 800 配备 Airyscan	100倍（数值孔径1.4）油镜
甲醇	Fisher scientific	10010240
微型挤出器	Avanti Polar Lipids, Inc.	610000-1EA
1.5 mL 微量离心管	Greiner	616201
MATLAB	Mathworks	R2018b
Nuclepore 亲水性膜，0.1 μm	Whatman	800309
磷酸盐缓冲液（PBS）	Life Technologies Holdings Pte Ltd.	70013
聚二甲基硅氧烷（PDMS）基础剂	Dow Corning Corporation	SYLGARD 184
聚二甲基硅氧烷（PDMS）交联剂	Dow Corning Corporation	SYLGARD 184
等离子清洗机	HARRICK PLASMA	PDC-002-HP
石英纳米芯片	东海县阿尔法石英制品有限公司
氢氧化钠	Sigma-Aldrich	795429
硫酸	Sigma-Aldrich	258105
Texas Red DHPE：Texas Red 1,2-二十六酰基-sn-甘油-3-磷脂乙醇胺，三乙基铵盐	Life Technologies Holdings Pte Ltd.	T1395MP
镊子	Gooi	PDC-002-HP
超声波清洗器	Elma	D-78224
Voterx	Scientific Industries	G560E
真空干燥器	NUCERITE	5312
水浴锅	Julabo	TW8