基于流式细胞术的心肌B细胞定量与分析

摘要

本文报道了一种基于心肌B淋巴细胞在血管内或内皮空间位置，利用流式细胞术对其进行定量和区分的实验方案。

摘要

越来越多的证据表明，B淋巴细胞在心肌生理学以及心肌对损伤的适应过程中发挥着重要作用。然而，文献中关于心肌B细胞存在比例的报道存在相互矛盾的数据。有研究报道B细胞是啮齿类动物心脏中最常见的免疫细胞之一，也有研究指出B细胞虽然存在，但其比例明显低于髓系细胞，甚至极为稀少。类似地，多个研究团队描述了急性缺血性心肌损伤后心肌B细胞数量增加的现象，但也有一个团队报告称损伤心肌中的B细胞数量并无变化。建立一种统一且可重复的方法来评估心肌B细胞的比例，对于协调不同研究团队之间的观察结果、推动B细胞与心肌相互作用研究的发展至关重要。根据我们的经验，文献中看似矛盾的观察结果很可能源于以下事实：小鼠心肌中的B细胞主要位于血管内，并与微血管内皮细胞相连。因此，从小鼠心脏中回收的B细胞数量对用于清洗器官的灌注条件以及所采用的消化方法极为敏感。本文介绍了一种针对这两个关键变量进行专门优化的实验方案。该方案能够实现对小鼠心肌B细胞数量进行可重复的、基于流式细胞术的分析，并使研究人员能够区分血管外与血管内的心肌B细胞。

引言

B淋巴细胞是一类高度特化的免疫细胞，在适应性免疫和固有免疫应答中均发挥重要作用¹。B细胞主要有两种群体：数量较少的B1细胞，主要在胚胎期产生；以及占主导地位的B2细胞，在成体生命阶段由骨髓产生¹。B细胞在骨髓中成熟后，迁移至初级和次级淋巴器官，并从此在淋巴器官之间持续循环，经由血管和淋巴管进行迁移²。B细胞在其表面表达特异性抗体，这些抗体作为受体发挥作用。当B细胞遇到与其受体结合的抗原时，可触发激活信号。活化的B细胞或迁移至抗原所在组织，或返回骨髓，在骨髓中可进一步分化为产生抗体的浆细胞^3,4。

近年来，人们逐渐认识到心脏中存在大量B细胞。在啮齿类动物中的研究表明，B细胞在胚胎发育早期即定植于心脏⁵，且与心肌相关的B细胞主要为附着于血管内皮的血管内幼稚B2细胞^6,7，其中仅含少量B1细胞⁷。尽管目前仍存在诸多未明确的领域，但现有数据表明，B细胞在正常心脏以及心肌对损伤的适应性反应中均发挥着重要作用。

....

方案

本手稿中描述的所有实验均经约翰斯·霍普金斯大学医学院动物护理和使用委员会（IACUC）批准后进行。

1. 准备工作

1. 按照表1所述配制FACS缓冲液。
2. 确保有足够的CO₂ 用于安乐死动物。
3. 准备解剖区域（放置实验台垫，并将胶带和解剖工具放在附近）。
4. 标记15 mL离心管，每管加入3 mL含钙和镁的HBSS（参见材料表），并将离心管置于冰上（每颗心脏对应一管，另加一管用于对照组/流式细胞术对照）。同时，向小号（35 mm）培养皿中加入HBSS。
5. 打开温控摇床，设置温度为37 °C，并将离心机预冷至4 °C。
6. 准备注射泵并将流速设为3 mL/min。用20 mL注射器吸取HBSS，用缓冲液预冲管路，并排除所有气泡。

2. 血管内B细胞染色（体内）

1. 称取一只12周龄的雄性C57BL/6J品系小鼠。用100 µL B220抗体稀释液（1:10，溶于PBS）装填一支3/10 cc胰岛素注射器。用铝箔包裹注射器以避光。
2. 麻醉一只小鼠。
   1. 以400 mg/kg剂量经腹腔注射2% 2....

结果

采集完成后，收集所有事件，应根据标准流式细胞术实践进行数据分析。分析的重点将根据每个实验的具体目标而有所不同。本实验旨在定量分析血管内和血管外B细胞，并以每毫克组织中的细胞数量表示。

使用光谱流式细胞仪时，建议首先进行初步设门分析，以去除尺寸不在免疫细胞范围内的碎片，随后去除活死染料阳性信号。这有助于检测到干净的CD45阳性细胞群体，对应于白细胞（图1）。在去除双联体后，在未受伤的 naive 心脏中，预期约有20%的CD45+细胞为CD19+ B细胞（图2A，本代表性实验中为18.1%的B细胞）。在这些细胞中，平均约5.5%位于间质空间，而94.5%位于血管内空间（图2B）。从心脏中发现的全部B细胞群体来看，仅约1.6%的细胞基于表面标志物CD11b被归类为B1细胞（通常认为该标志物足以以较高置信度将小鼠CD19+细胞鉴定为B1细胞^1,

讨论

越来越多的证据表明，B细胞在心肌生理以及心肌对损伤的重塑/适应过程中发挥着重要作用^{7,8,9,10,11,12,13,36}。流式细胞术是研究任何组织中免疫细胞群体的极佳工具，对于专注于心脏B细胞的研究而言，几乎已成为必备手段。

关于B细胞与心脏的新兴文献已在一些非常基础的方面报道了相互矛盾的研究结果，例如心脏中B细胞的数量以及心肌损伤后B细胞数量的变化。有研究报道称B细胞是啮齿类动物心脏中最丰富的免疫细胞⁷.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Alexa Fluor 700 抗小鼠/人 CD11b 抗体	101222	BioLegend	100 µg 200 µL
(CellTreat 29481) 细胞滤筛，40 µm，蓝色	QBIAP303	Southern Labware
0.5 mL 无色微量离心管	1605-0000	SealRite, USA Scientific
0.9% 氯化钠注射液，USP	114-055-101	Quality Biological	0.90%
1.5 mL 无色微量离心管	1615-5500	SealRite, USA Scientific
10 µL 带刻度 TipOne 滤芯吸头	11213810	USA Scientific
1000 µL 带刻度 TipOne 滤芯吸头	11267810	USA Scientific
15 mL 离心管，插塞密封盖，聚丙烯材质，无 RNase/DNase	430052	Corning
单向止流阀，聚碳酸酯材质	SVPT951	ECT Manufacturing
2,2,2-三溴乙醇	T48402	Sigma-Aldrich
200 µL 带刻度 TipOne 滤芯吸头	11208810	USA Scientific
三通止流阀，聚碳酸酯材质	SVPT953	ECT Manufacturing
5 mL 聚苯乙烯圆底管，12 x 75 mm 规格	352054	Falcon, a Corning Brand
50 mL 离心管，插塞密封盖，聚丙烯材质，无 RNase/DNase	430290	Corning
ACK（氯化铵-氯化钾）裂解缓冲液	118-156-101	Quality Biological	渗透压：290 ± 5% mOsm/Kg H2O
适配器 4x50 mL，用于转子 A-4-63 的 250 mL 矩形吊篮	5810759005	Eppendorf
15 mL 离心管适配器，每个适配器可容纳 9 支管，锥形底，适用于转子型号 A-4-62	22638289	Eppendorf
适配器，用于 15 支圆底管（2.6 – 7 mL），适用于转子 A-4-62 的 250 mL 矩形吊篮	22638246	Eppendorf
铝箔，12 英寸 x 75 英尺卷，厚度 0.0007 英寸	UPC 109153	Reynolds Wrap
麻醉诱导室 - 小鼠用	RWD-AICMV-100	Conduct Science
BD 鲁尔滑动针头注射器，附带 25 G × 5/8 英寸针头，无菌，一次性使用，1 mL	309626	BD Becton, Dickinson and Company
Brandzig 超细胰岛素注射器，29G，1 cc，1/2"，100 支装	CMD 2613	Brandzig
Brilliant Violet 421 抗小鼠 CD19 抗体	115537	BioLegend	50 µg/mL
带滤网（35 µm）的流式管盖，适用于 12 x 75 mm 管的双位置设计，无菌	T9009	Southern Labware
二氧化碳 USP E CGA 940	CD USPE	AirGas USA
Cole-Parmer Essentials 低型烧杯，玻璃材质，500 mL	UX-34502-46	Cole-Parmer
胶原酶 2	LS004176	Sigma-Aldrich
黄铜镀铬接头，1/4" 内螺纹 NPT × 1/4" 插管	Y992611-AG	AirGas USA
Cytek Aurora 流式细胞仪		Cytek Biosciences
Diss 1080 接头 1/4 BARB CP	M-08-12	AirGas USA
DNase I - 40,000 U	D4527	Sigma-Aldrich
Easypet 3 - 电子移液控制器	4430000018	Eppendorf
电子天平，AX223/E	30100606	Ohaus Corp.
Eppendorf 5810R 离心机	5810R	Eppendorf
Eppendorf Research plus 单通道可调移液器		Eppendorf
FlowJo 10.8.1		BD Becton, Dickinson and Company
GLACIERbrand 三层密度冰盒（IPAN-3100）	Z740287	Heathrow Scientific
HBSS (1x) - 含 Ca2+ 和 Mg2+	14025076	gibco	1x
透明质酸酶	H3506	Sigma-Aldrich
Kelly 止血钳，直型	13018-14	Fine Science Tools
鲁尔滑动注射器，无菌，一次性使用，20 mL	302831	BD Becton, Dickinson and Company
M1 可调减压阀 0-100 PSI/CGA940	M1-940-PG	AirGas USA
McKesson 中等吸收垫	4033-CS150	McKesson
Navigator 多功能便携式天平	NV2201	Ohaus Corp.
PBS pH 7.4 (1X) 无 Ca2+ 和 Mg2+	10010023	gibco	1x
PE 抗小鼠/人 CD45R/B220 抗体	103208	BioLegend	200 µg/mL
PerCP/Cyanine5.5 抗小鼠 CD45 抗体	103132	BioLegend	100 µg 500 uL
培养皿，可堆叠，35 mm × 10 mm，无菌聚苯乙烯	FB0875711YZ	Fisher Scientific
包装：Diss 1080 螺母/CO2/CO2-02	M08-1	AirGas USA
6 瓦高亮度 LED 双蛇形颈照明灯	LED-6W	AmScope
PrecisionGlide 针头 25 G × 5/8 (0.5 mm × 16 mm)	305122	BD Becton, Dickinson and Company
纯化大鼠抗小鼠 CD16/CD32（小鼠 BD Fc 阻断剂）克隆 2.4G2（RUO）	553141	BD Becton, Dickinson and Company Biosciences	0.5 mg/mL
R 4.1.1		The R Foundation
剃须刀片	9501250000	Accutec Blades Inc
分析级双级调节器，0-25 psi 输出，CGA320 接口，3500 psi 输入	Y12244A320-AG	AirGas USA
转子 A-4-62，包含 4 个 250 mL 矩形吊篮	转子 A-4-62	Eppendorf
带滤芯移液管，10 mL，无菌，无热原/内毒素，无细胞毒性，每片独立包装	86.1254.001	Sarstedt AG & Co KG
Sigma 标签胶带	L8394	Sigma-Aldrich
SpectroFlo 3.0.0		Cytek Biosciences
Spex VapLock 鲁尔接头，聚丙烯材质，直型，公鲁尔锁 × 1/8" 软管插管；1 个/每件	MTLL230-6005	Spex
标准壁实验室软管，S2 规格，Excelon，内径 1/8" × 外径 3/16" × 壁厚 1/32" × 长度 50 英尺	CG-730-003	Excelon Laboratory
无针聚丙烯/聚乙烯注射器，3 mL	Z683566	Millipore Sigma
注射泵	55-1199 (95-240)	Harvard Apparatus
Thomas 三通道报警计时器 TM10500	9371W13	Thomas Scientific
试管架，12 孔位，其中 6 孔用于 5.0 mL 和 15 mL 试管，6 孔用于 25 mL 和 50 mL 试管，聚丙烯材质，带编号孔位，可高压灭菌	30119835	Eppendorf
试管架，12 孔位，用于 5.0 mL 和 15 mL 试管，聚丙烯材质，带编号孔位，可高压灭菌	30119827	Eppendorf
TYGON R-3603 实验室软管，内径 × 外径 1/4 英寸 × 3/8 英寸	T8913 (Millipore Sigma)	Tygon, Saint-Gobain
Vortex-Genie 2 涡旋振荡器	SI-0236	Scientific Industries, Inc.
VWR 带导向销解剖镊，弯曲尖端	89259-946	Avantor, by VWR
VWR 解剖剪，锐利尖端，4½"	82027-578	Avantor, by VWR
VWR 恒温轨道摇床，型号 3500I	12620-946	Avantor, by VWR
Zombie Aqua 可固定活力检测试剂盒	423102	BioLegend