关节液分析用于识别骨关节炎

摘要

通过透射光、偏振光和补偿光显微镜对滑膜液进行分析，可利用简单的步骤评估样本的炎症性或非炎症性特征。该方法在骨关节炎中尤为有用，可用于检测钙盐结晶，并识别出更严重的骨关节炎亚型。

摘要

关节液（SF）分析在骨关节炎（OA）的诊断中具有重要意义。宏观和微观特征，包括白细胞（WBC）总数及分类计数，有助于界定关节液的非炎症性特征，这是OA的典型标志。在OA患者中，关节液样本中的白细胞计数通常不超过每微升2000个细胞，且中性粒细胞等炎症细胞的比例极低或缺如。钙盐结晶在OA患者的关节液中较为常见。尽管其在OA发病机制中的作用尚不明确，但已发现其与轻度炎症过程及更严重的疾病进展相关。近期研究发现，钙盐结晶可出现在OA的早期和晚期阶段，提示其可能在诊断OA不同临床亚型及指导药物治疗方面发挥重要作用。总体而言，OA中关节液分析的目标有两个：一是确定关节液的非炎症程度，二是明确是否存在钙盐结晶。

引言

骨关节炎（OA）是一种复杂且多因素的慢性关节疾病，在15岁及以上人群中全球汇总患病率估计为16%，在40岁及以上人群中则为23%¹。由于人口老龄化以及肥胖和代谢综合征等危险因素的增加，OA的发病率预计将进一步上升²。

骨关节炎（OA）的主要问题包括早期诊断困难，以及目前可用的治疗手段仅限于疼痛管理和症状缓解性慢作用药物（SYSADOAs），例如氨基葡萄糖。OA的诊断依赖于临床症状和影像学检查结果。然而，这两种评估方法之间缺乏相关性，可能导致OA诊断和治疗启动延迟数年²。OA的特征是退行性过程和低度炎症，这些可通过滑膜液（SF）分析进行有效研究。via 滑膜液分析。滑膜液是一种富含透明质酸的黏稠血浆渗出液，可润滑关节腔，为软骨提供营养和氧气，并清除代谢废物。滑膜液还具有减震功能，可在关节承受压力和张力时起到保护作用³。

滑膜液分析是一种简单且可靠的检测方法，在对出现肌肉骨骼症状和关节积液的患者进行初次评估时，必须始终执行该检查³。美国风湿病学会、英国风湿病学会及其他机构发布的指南均建议，将滑膜液分析作为风湿性疾病诊断检测的一部分，尤其在评估急性单关节炎时必须开展^4,5。通过滑膜液分析获得的白细胞总数及分类计数，能够反映关节内病理过程的现状，从而判断炎症程度。在偏振光显微镜下识别致病性晶体，如单钠尿酸盐（MSU）和焦磷酸钙（CPP）晶体，对于晶体性关节炎（例如痛风和假性痛风）的诊断与治疗至关重要。此外，若发现微生物，则提示可能存在感染性关节炎的诊断。

钙盐结晶在骨关节炎（OA）患者的样本中较为常见⁶。据报道，在OA患者的滑液（SF）样本中，约有22%存在碱性磷酸钙（BCP）结晶，23%存在焦磷酸钙（CPP）结晶⁶。尽管其具体作用尚不明确，但这些结晶已被认为与更严重的OA表型相关⁷，并被视为疾病病理过程本身的伴随现象。在接受膝关节置换术的OA患者组织样本中，钙盐结晶的检出率高达100%⁸。此外，已有研究假设钙盐结晶可能通过其促炎效应参与OA的发病机制，这一效应已在多项研究中得到证实⁹，并至少部分由NLRP3炎症小体介导¹⁰。

最近，钙盐结晶在骨关节炎（OA）的早期和晚期阶段均有发现⁶，表明其在诊断不同临床亚型的OA以及药物治疗中可能发挥关键作用。

滑液分析的总体目标有两个：一是确定滑液的炎症程度，二是通过识别特定晶体或微生物来诊断晶体性或感染性关节炎。由于骨关节炎通常表现为非炎症性特征，中性粒细胞比例极低或完全缺失，滑液分析在诊断骨关节炎时尤为有用，是一种简单且可靠的工具。

相较于其他技术的优势
滑膜液（SF）分析包含一系列简单操作，如总白细胞计数、白细胞分类计数以及结晶体检测。由经验丰富的实验室技术人员进行的手工细胞计数^3,11 仍是滑膜液及其他体液细胞学分析的金标准。然而，由于该方法耗时较长，且存在观察者间和观察者内变异，自动化细胞计数仪已逐渐在大型常规临床实验室中取代手工计数，其中血液和尿液分析仪已被改造用于滑膜液分析^11,12。尽管如此，手工计数在某些特定情况下仍具优势：（1）在门诊环境中，可及时获得总白细胞及分类计数结果；（2）可识别自动化计数仪无法辨认的细胞类型，例如吞噬性单核细胞（Reiter细胞）或非造血细胞（如滑膜细胞）；（3）当样本量过少，无法由仪器处理时；（4）便于建立本地实验室登记系统，便于研究使用。手工计数的另一优势在于活体染色技术，该方法可在玻片制备后立即快速区分细胞类型。相比之下，传统的染色方法（如Wright染色和May-Grünwald-Giemsa染色）需要将滑膜液涂片空气干燥，并耗费一定时间完成染色¹³。尽管这些染色方法不适用于时间敏感的常规分析，但它们能更清晰地显示样本中的各类细胞成分，包括红细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、多形核白细胞、淋巴细胞和血小板。

最后，通过基于偏振光显微镜的简单技术对晶体进行常规滑膜液分析，可快速获得结果¹⁴。其他方法（如扫描电镜和电子显微镜）虽然能够提供更准确和更敏感的结果，但由于成本高昂，且样品制备与分析过程耗时，难以在日常临床实践中应用。

方案

本方案符合帕多瓦大学医院伦理委员会的指导原则。滑膜液（SF）是在患者初次就诊或因关节炎发作而接受治疗性关节穿刺时，经患者知情同意后从膝关节采集的。该操作的禁忌症包括：凝血功能障碍、使用抗凝药物、关节区域皮肤病变、皮炎或蜂窝织炎。所有滑膜液样本均已去标识化。

1. 滑膜液制备

1. 转移关节穿刺术中采集的肿胀关节滑液样本¹⁵ 加入含有抗凝剂（首选EDTA；参见 材料表）以及另一管不含添加剂的（图1).
2. 在疑似感染的情况下，无菌操作将部分关节液样本（约 1 mL）转移至培养瓶中，用于微生物学检测。
   注意：感染可通过临床特征（严重肿胀、疼痛、发热、功能障碍，有时伴有发热）和关节液（SF）的肉眼外观（浑浊、颜色改变）怀疑。在此情况下，医生会开具微生物学分析医嘱，由微生物学实验室进行检测。
3. 样本采集后应立即进行SF分析（步骤2-5）。

2. 宏观检查

注意：滑膜液样本的宏观评估包括主观、定性及半定量评估。目前尚无参考标准量表，且不使用对照样本。

1. 记录关节滑液（SF）的体积，单位为毫升。描述样本的颜色，颜色范围可从淡黄色至深黄色。记录是否存在血液。
2. 通过背光观察样本，并判断透过液体管能否清晰阅读印刷文字，以此评估样本的透明度（图 2A）。
3. 使用一次性移液管滴加样本，评估其黏稠度。若液滴形成长丝，表明黏稠度良好；若呈滴状下落，则表明黏稠度较差（图 2B）。
4. 通过观察液体管内样本及其背光下的状态，评估是否存在颗粒状物质，包括组织碎片或纤维蛋白。

3. 显微镜检查

注意：滑膜液（SF）显微镜检查包括细胞学检查，如白细胞（WBC）总数及分类计数，以及晶体搜寻。

1. 按照以下步骤确定总细胞数。
   1. 使用血细胞计数器（见材料表）测定EDTA管中收集的滑膜液（SF）中的白细胞总数。
   2. 使用Malassez-Potain移液管（标记0.5；见材料表）从EDTA管中吸取0.5 µL的滑膜液（补充图1）。使用同一移液管吸取9.5 µL的0.1%亚甲蓝溶液（标记11）。最终稀释倍数为20倍。
   3. 轻轻翻转混匀移液管，弃去最初几滴，将滑膜液与亚甲蓝溶液混合液注入计数室中。
   4. 计数九个方格中的连续两个方格内的细胞数，并将所得数值乘以100（简化公式；补充图2）。以每立方毫米中的白细胞数表示结果。
      注：简化公式：白细胞数（N/mm³）= 连续两个方格中计数的细胞数 × 100。
   5. 根据先前发表的研究报告^16,17，依据白细胞总数对滑膜液进行分类（表1）。
2. 进行白细胞分类计数。
   1. 使用活体染色或传统染色法^13,18测定多形核（PMN）细胞、单核细胞和淋巴细胞的百分比。
   2. 进行活体染色时，将一滴少量滑膜液置于预先涂有甲酚紫和亚甲蓝的即用型载玻片中央（补充图3；见材料表）。
   3. 加盖盖玻片，并滴加一滴显微镜浸油。
   4. 制备空气干燥的滑膜液涂片用于传统染色（不适用于常规分析）。在洁净载玻片一端滴加一小滴滑膜液，使用另一张载玻片或盖玻片向前推移涂布均匀。让涂片自然风干。
   5. 按照标准的May-Grünwald-Giemsa染色程序¹⁸对样本进行染色。
   6. 在油镜下（1,000倍）观察玻片。
   7. 连续计数100个细胞，并区分多形核细胞、单核细胞和淋巴细胞（图3，补充图4）。
   8. 以百分比形式表示每类细胞的总数。
      ​注：为获得准确结果，细胞学检查应在滑膜液采集后立即进行，或在关节穿刺后24–48小时内（妥善储存于4 °C条件下）完成。

4. 晶体检测

1. 使用配备附加偏振滤光片和红色补偿器的偏光显微镜检测病理性晶体的存在¹⁹（参见材料表）。
2. 进行载玻片制备以检测晶体。
   1. 用浸有乙醇的光学纸或软纸小心清洁玻璃载玻片。在载玻片上滴加少量滑膜液（SF）。
   2. 盖上盖玻片，并将载玻片置于显微镜下。
3. 鉴定晶体。
   1. 在显微镜下使用低倍物镜对焦载玻片。用40倍物镜在明场下仔细检查载玻片，观察细胞内外。
   2. 根据晶体的大小和形状（例如菱形、针状、杆状）进行鉴定。
   3. 将偏振滤光片插入光源与标本之间。旋转偏振器，使其光轴与分析器（位于物镜上方）垂直，以形成暗背景。
   4. 一旦识别出双折射晶体，将补偿器插入偏振器与标本之间，并将其沿晶体光轴方向平行或垂直移动。
   5. 观察晶体所呈现的颜色（表2）。
      注：尿酸钠（MSU）晶体呈针状，在暗场中具有强双折射性，当其轴与补偿器平行时呈黄色/橙色；当其轴与补偿器垂直时则呈蓝色（负性）（表2；图4）。焦磷酸钙（CPP）晶体呈杆状或菱形，偏振光下双折射性较弱，当其轴与补偿器平行时呈蓝色，垂直时呈黄色（正性）（表2；图5）。

5. 茜素红染色

1. 配制2%的茜素红S溶液（pH 4.1–4.3），用0.22 µm滤膜过滤，并避光保存。
   1. 制片时，在洁净的载玻片上将一滴滑膜液（SF）与等体积的茜素红S溶液（1:1）混合，盖上盖玻片，在400倍显微镜下观察。
   2. 在显微镜下识别晶体。
      注意：当在透射光下可见明亮、深红色、圆形且具有同心层状结构的沉淀物时，结果为阳性。在偏振光下，这些晶体呈现强双折射性²⁰ （图6）。

结果

受骨关节炎影响的大关节常出现肿胀，并产生大量滑液，需进行引流 通过 关节穿刺术¹⁵关节穿刺术后立即评估的滑液宏观特征主要包括量、颜色、透明度和黏稠度¹⁷尽管其特异性较低，但可提供有关炎症程度的初步数据。颜色取决于滑液细胞数量和细胞外基质大分子的降解程度。从骨关节炎患者收集的滑液呈淡黄色，通常与非炎性样本相关；而深黄色则与炎性渗出液相关。图2）。样本中若存在少量血液，例如由于毛细血管破裂所致，会导致液体呈淡橙色。对于血性渗出液必须谨慎评估，因其可能提示潜在的关节积血。透明度是骨关节炎（OA）患者滑膜液（SF）采集的重要特征。事实上，非炎症性滑膜液中细胞、碎片、透明质酸及纤维蛋白片段含量较低，因此外观清晰，与炎症性滑膜液的浑浊外观不同。图2).

黏度是反映炎症的良好指标，因为它与基质大分子（主要是透明质酸）的完整性相关（

讨论

在骨关节炎中，滑液分析通过以下简单步骤帮助定义疾病特征：总白细胞计数和分类白细胞计数，以及检测晶体（包括焦磷酸钙和碱性磷酸钙）。此外，尿酸钠晶体的检出可能提示重要的共病情况。

尽管成本较低且操作简单，但由于操作人员经验不足——尤其是晶体鉴定方面——可能会影响检测的敏感性和结果的可靠性。操作人员的培训和经验对于区分焦磷酸钙（CPP）和单水尿酸钠（MSU）晶体的形态及其双折射特性，并将晶体形态与其双折射程度相对应至关重要。一些研究报道了不同实验室之间在晶体鉴定上存在差异；因此，对实验室技术人员进行培训对于获得可靠且一致的结果至关重要¹⁴。晶体鉴定还可能受到对双折射颗粒误判的影响，这些颗粒可能被误认为致病性晶体。这些颗粒可能来源于外部（如灰尘或纤维），也可能存在于关节腔内（如皮质类固醇或脂质）。对载玻片进行彻底清洁可解决前者问题，而后者则只能通过培训和经验来克服¹⁴。

SF 分析的另一项局限性涉及使用茜素红染色来鉴定碱性钙盐（BCP）。如...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
茜素红 S	Merck	A5533	用于 BCP 结晶检测
Burker 计数板	Merck	BR718905	用于白细胞总数计数
盖玻片	Merck	C7931	用于显微镜检查
EDTA 采血管	BD	368861	用于滑膜液采集
载玻片	Merck	S8902	用于结晶检测
λ滤光片（补偿器）	任意	请参考显微镜厂商说明	用于结晶鉴定
Malassez-Potain 血细胞计数器	Artiglass	54830000	用于滑膜液稀释
亚甲蓝溶液	Merck	3978	用于白细胞总数计数
偏光显微镜	Leica、Nikon 或其他厂商	根据型号和厂商而定	用于完整的滑膜液分析
偏振镜片	任意	请参考显微镜厂商说明	用于结晶鉴定
Testsimplet	Waldeck	14386	活体染色用于细胞分类