昆虫具有其偏好的适宜环境温度范围，并会主动寻求维持在此范围内，而许多内外因素均可改变这种偏好。本文介绍一种经济、简便的温度选择研究方法，可让昆虫自由表现出其自然行为。
本文内容
摘要
摘要
大多数昆虫和其他变温动物具有相对较窄的最适温度范围，偏离其最适温度会显著影响其适合度及其他特征。因此，许多这类变温动物会主动寻找其最适温度范围。尽管蚊子及其他昆虫的温度偏好已被广泛研究，但传统的实验装置通常是在高度封闭空间内使用铝制表面构建温度梯度。在某些情况下，这种设备限制了多种自然行为（例如飞行），而这些行为可能在偏好选择中起重要作用。
本研究的目的是利用一个具有足够飞行空间的双室装置，观察昆虫对空气温度的偏好。这两个室由两个独立的温度控制培养箱组成，每个培养箱均设有较大的开口，并通过一段短的丙烯酸桥梁连接。培养箱内各放置一个带网的笼子，笼子相互连接 通过 孔洞和桥梁结构使昆虫能够在不同环境条件间自由飞行。丙烯酸桥梁还在两个培养箱之间形成温度梯度。
由于笼内空间宽敞且易于构建，该方法可用于研究任何小型外温动物，以及在生物安全等级1或2（BSL 1或2）条件下，任何可能改变温度偏好的操作，包括感觉器官操作、饮食、肠道菌群和内共生体的存在。此外，在生物安全等级3（BSL 3）条件下，通过增加额外的 containment 措施（例如，在生物安全柜内操作），该装置也可用于病原体感染的研究。
引言
生物体只能在其热耐受范围内生存和繁殖。随着环境温度因季节变化和全球变暖而发生改变，物种必须相应地适应并作出响应，以确保其生存。这包括变温动物，其体温与环境温度处于平衡状态1。因此，每种昆虫都有其自身最适宜的环境温度范围，并会寻求维持在此范围内2。
温度是用于预测昆虫分布和分布范围的重要因素之一3,4,5，也是观察病原体与昆虫关系6,7以及外界因素对变温动物适应性影响（如成虫寿命、繁殖力和取食率）8,9的重要依据。
以往的研究已采用不同装置探究变温动物的偏好温度。最常见的方法是使用一个大型铝块，其两端分别连接冷却或加热的水浴槽10、冰浴和可编程加热元件11、冷热板12,13、温控调节板14,15，或加热袋与冰袋16，以建立温度梯度。此外，其他研究还使用温度梯度培养箱来研究特定细菌的生长17，或将铝棒安装在热电装置上（两端分别加热和冷却），以观察黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的温度偏好18,19。
然而，本文提出的替代方法在某些昆虫应用中具有显著优势。首先，其他方案需要从基础材料完全从头构建，包括铝板、为昆虫制作的丙烯酸腔室，以及通常所需的相机装置和专业软件；这可能在搭建时成本较高且耗时较长。其次，许多替代装置依赖于表面的温度梯度（而非空气温度）。因此，用于研究昆虫的腔室通常非常狭窄（例如，24 cm 长的梯度仅具有 2 cm 宽度和 1 cm 深度16），这可能会限制昆虫的自然行为，例如飞行，而飞行对于昆虫正常的活动能力至关重要，因此在选择偏好温度时也极为关键。尽管部分研究确实测量了空气温度，但其选择行为的评分仍涉及统计蚊虫降落在帕尔帖元件上的数量，而非昆虫在笼内自由飞行的情况20。
本研究介绍了一种更简单的实验装置，该装置仅对标准设备进行最小程度的改造，为昆虫提供了充足的空间，使其能够在标准尺寸的群体饲养笼中相对无阻碍地飞行和导航。此外，本方案不依赖温度梯度，而是利用两个内部温度相对恒定且面积较大的区域，使昆虫能够在自身偏好的温度范围内自由活动，并实现简单的二元评分。因此，本文所述的装置和方案提供了一种低成本、操作简便的方法，可在干扰更小、更接近自然的环境中研究蚊虫的温度偏好。
该实验方案包括实验前昆虫的准备，以及双室装置的组装。后续步骤包括将昆虫放入装置中，使其选择适宜的温度，并对结果进行评分。为演示本方法，我们选择了昆虫的最适（标准培养）温度，埃及伊蚊（Aedes aegypti）为 27 °C，黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）为 25 °C；同时为两种昆虫分别设置较高的驱避温度，即 30 °C 和 28 °C。给予昆虫 30 分钟时间选择其偏好的 chamber。该时长已被证实足够，延长停留时间不会改变结果；然而，可根据具体物种、温度或其他变量需要适当延长。
方案
注意：本方案适用于生物安全等级1或2；对于生物安全等级3的操作，需在III级生物安全柜（手套箱）内完成整个实验流程。
1. 昆虫准备
- 准备两个带有12厘米袖口开口的空蚊笼（17.5 cm x 17.5 cm x 17.5 cm）（图1）。在进行实验前，确保蚊笼无任何孔洞或其他损坏。
- 使用机械吸虫器（一种带有收集腔的简易吸虫管），将30只昆虫（例如埃及伊蚊（Aedes aegypti）；此处使用羽化后3-5天的雌蚊）转移至另一个独立的蚊笼中，以便实验结束后更方便地操作和处理。
注意：建议每次实验使用30只昆虫，此数量易于管理与计数，且蚊子逃逸风险较低。可根据实验目的调整所用昆虫数量。
2. 双室装置的设置
- 根据培养箱制造商的说明，将培养箱设置为所需的温度。
- 让培养箱加热并稳定在特定温度，25–30 °C 范围内的温度稳定时间通常 <30 分钟。使用温度探头检测培养箱内的空气温度，以确保培养箱已达到设定的目标温度。
- 在每个培养箱中放置一个空的蚊笼（图 2A）。
- 将蚊笼的套管穿过培养箱前方的孔洞。使用胶带制作一个可开启的盖板（翻盖），并将其覆盖在亚克力管的孔洞上（图 2B）。
- 将亚克力管插入位于培养箱孔洞上方的蚊笼套管中。该管的直径大于培养箱前部孔洞的直径，以确保完全覆盖该孔洞。
- 使用橡皮筋或可重复使用的扎带将套管网布在管子周围扎紧（图 2C）。确保亚克力管不会松动或悬挂在两个培养箱之间；如果存在松动，应拉紧蚊笼套管，以去除蚊笼与橡皮筋之间的多余材料。
- 将两个培养箱相对放置，并对另一个培养箱的套管重复步骤 2.5 和 2.6。此时，两个蚊笼已通过亚克力管牢固连接（图 2D）。
3. 蚊虫接种
- 打开用于插入蚊虫的胶带翻盖。将漏斗插入孔中，把昆虫倒入已放置在亚克力管中的漏斗内。
注意：如需要，对于蚊虫，可在将其放入漏斗前使用 CO2 笔使所有蚊虫麻醉21；对于果蝇（Drosophila），可使用冰使其昏迷22。 - 移除漏斗，并用胶带翻盖盖住管上的孔。让昆虫静置 30 分钟，以选择其偏好的实验腔室。
注意：若使用了 CO2 或冰处理，应在数分钟后轻轻敲击管桥以唤醒昆虫。
4. 蚊子计数
- 30 分钟后，目视观察并记录在桥管（丙烯酸管）中发现的昆虫数量。
- 轻敲或吹气使桥管中的昆虫移向培养箱的任意一侧。记录该数量，以便后续从昆虫总数中扣除。
注意：通过向桥管中释放 CO2 将装置中的全部 30 只昆虫击晕（所有昆虫均使用 CO2，因为冰无法使笼内昆虫失去活动能力）。同时记录飞向培养箱两侧的桥管内昆虫数量。 - 从丙烯酸管两端捏紧并关闭袖口，迅速打结封闭笼子，并确保橡皮筋仍保持完整，以防止任何昆虫逃逸。
- 将笼子从培养箱中取出，目视计数每个笼子中的昆虫数量（如有需要，扣除桥管中的昆虫数量）。
- 对另一个笼子重复步骤 4.4。确保两个培养箱和桥管中的昆虫数量之和等于 30（或等于步骤 1.2 中使用的昆虫总数，若数量不同）。
- 如果总数与步骤 1.2 中使用的昆虫总数不符，请检查笼子袖口内是否残留有昆虫。
5. 复制
- 进行实验时，务必考虑可能的外部偏差因素，例如光照方向、环境气味等。例如，可通过在重复实验之间调换笼具位置、培养箱朝向及组合方式来避免偏差。
结果
为了测试该实验装置的有效性和功效，使用两个培养箱在相同温度下对30只蚊子进行了四次重复测试（图3）。当两个腔室均设置为蚊子最适温度27 °C时，腔室选择之间无显著差异（P = 0.342；Wilcoxon符号秩检验）。然而，当一个腔室设置为吸引性的最适温度27 °C，另一个腔室设置为次优温度30 °C时，蚊子始终表现出对最适温度的主动偏好（P = 0.029；Wilcoxon符号秩检验；27 °C和30 °C的平均选择比例分别为78.2%和21.8%）。我们还使用Drosophila进行了测试，以验证该装置在其他外温动物模型中的适用性，结果观察到了类似现象。
笼内温度均匀性
图4展示了双室装置的温度均匀性。组装完成后，将两侧温度分别设定为27 °C和30 °C，并按照本文所述方法进行平衡。除一个角落外，培养箱和连接桥的所有区域温度均在中心温度的±0.4 °C范围内。需要注意的是，从正面观察时，左前下角在27 °C和30 °C条件下始终为一个稳定的热点。这可能是由于培养箱控制电子元件恰好位于该区域下方所致，而非由实验操作引起，因此这一现象可能与特定型号的培养箱有关。这表明对培养箱的改造和附加结构对其温度均匀性影响极小。此外，连接桥的温度介于两个腔室之间，确保昆虫在移动时不会遇到需要飞越的低温区域。
图 1：蚊笼示意图。 蚊笼（17.5 cm x 17.5 cm x 17.5 cm），带有 12 cm 的袖口开口。请点击此处查看此图的放大版本。
图 2：装置安装过程中的照片与示意图。（A）放置在培养箱内的空昆虫饲养笼。（B）带有可开启盖子（翻盖）的丙烯酸管，盖子由胶带制成。（C）装置的侧视图及示意图。袖套的网布部分用橡皮筋紧固在丙烯酸管周围。本实验使用交配后3-5日龄的雌性Ae. aegypti蚊子。（D）完整装置。两个相对放置的培养箱通过一根丙烯酸管连接。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：昆虫的温度偏好。按照说明组装双室装置，根据实验方案将昆虫放入装置中，静置30分钟以选择其偏好的室（温度），随后进行计数。黑色点表示单个重复实验数据，蓝色表示平均值。（A）两个培养箱均设定为相同温度（27 °C），观察埃及伊蚊（Ae. aegypti）的温度偏好。（B）两个培养箱设定为不同温度（27 °C 与 30 °C），观察埃及伊蚊（Ae. aegypti）的温度偏好。（C）两个培养箱设定为不同温度（25 °C 与 28 °C），观察黑腹果蝇（D. melanogaster）的温度偏好。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：培养室及连接桥内的温度均匀性。如所述，按照说明组装了两个培养箱、两个笼具以及连接桥。将两个培养箱的温度调节至 27 °C，连接桥中心温度调节至 30 °C。使用温度探头测量笼具中心、培养箱全部八个角落以及连接桥内部的温度。此处显示为所测得的温度结果。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
该研究描述了一种观察蚊子温度偏好的新方法。该方法将蚊子释放到一根连接两个独立温控培养箱的试管中，使蚊子能够在不干扰其自然行为及选择表达机制（如飞行）的情况下，自由选择两种不同温度之一。
我们首次代表性实验在两个实验舱内均采用蚊子的最适温度27 °C。在该实验的重复过程中，观察到蚊子在整个30分钟内自由地在两个笼子之间飞行，且在所有重复实验中，两个实验舱内的蚊子数量接近相等。这证实了实验的初衷，即允许蚊子自由选择实验舱，同时表现出其自然行为（飞行）。相反，第二次代表性实验在一个实验舱中采用具有吸引力的最适温度27 °C，而在另一个实验舱中采用次优因而具有驱避性的温度30 °C。正如预期，蚊子始终显著偏好选择最适温度的实验舱，即使我们调换了培养箱以避免潜在偏差，结果依然如此。
我们还针对另一种昆虫测试了该装置。 D. melanogaster （果蝇），代表另一种变温动物模型生物。其中一个培养室设定为最适温度 D. melanogaster，25 °C，另一个设置为高3 °C，即28 °C。与蚊子类似，果蝇也偏好其最适温度，回避较温暖的环境。这表明该方案适用于多种变温动物。
实验方案中关键步骤的说明
本方案中的主要关键步骤是昆虫的操作，因为该过程可能导致昆虫逃逸。可通过以下措施避免此问题：确保所使用的饲养笼无过大孔洞可供昆虫逃出，用于将网袖固定在桥接装置上的橡皮筋或扎带应绑紧，且桥接装置上用于插入昆虫的孔口盖子应牢固安装并密封良好。
确保昆虫在实验前或实验后不会逃逸也至关重要，尤其是在需要将昆虫用于后续实验或在不同温度条件下进行后续时间点观察时。可在将昆虫放入亚克力桥之前将其麻醉（使用冰进行麻醉）以实现此目的。 黑腹果蝇 和 CO2 （针对蚊虫）并释放CO2 进入桥内以在计算前清除实验后的昆虫。CO的使用2 非常适合蚊子，因为它不会影响行为学实验结果21在果蝇中，暴露于CO2 可以改变其飞行行为23，因此建议使用冰22.
统计昆虫数量也是一个关键步骤，以确保实验前后昆虫数量相等，从而获得准确的结果。为此，我们建议在实验结束后使用CO2笔使位于通道中的昆虫昏迷。这有助于将昆虫驱赶到实验装置的任意一侧，从而减少逃逸个体的数量。本方案还特别指出，在分离笼子时，昆虫可能会被困在笼子的袖状结构中；因此，在计数过程中务必彻底检查这些部位。
技术的潜在改进与故障排除
该技术的主要难点在于笼套的网眼材料具有弹性，容易形成缝隙或藏匿空间，从而导致昆虫逃逸或被困。如有需要，可对技术进行一些潜在改进以提升效果。我们建议使用两个或更多的橡皮筋，确保桥接部分在两个腔室之间牢固固定，不留任何可能的空间（松动的网眼会为昆虫提供藏身之处）。此外，在组装装置时，我们还建议特别注意按照步骤2.6所述，将网套拉紧。
小型培养箱通常仅具备加热功能（即无主动冷却功能），本文所使用的培养箱即属于此类。因此，若需设置接近或低于室温的培养温度，则必须在低温室中进行实验，以确保培养箱能够达到预期的低温设定值。
此外，该装置也可用于需要三级生物安全柜（手套箱）的BSL-3实验。在这种情况下，手套箱必须足够大以容纳整个设备。本方案中描述的实验非常适合在手套箱内进行，因为所有必需的组件都将包含在手套箱内，且尤为重要的是，昆虫逃逸的可能性极低。
最后，培养箱内有足够的空间，可在不影响笼内昆虫的情况下添加外部光源或湿度源。根据昆虫种类或实验设计，可将厚度为1 cm的LED灯轻松放置在其中一个或两个培养箱内的笼子上方。同时为两个培养箱提供光照并给予温度选择，可能更适合某些对光敏感的实验设计；而仅向其中一个培养室提供光照（或湿度）则是本实验方案的一种可行修改方式，可用于评估昆虫对光照或湿度的选择行为。
该技术在双选温度偏好实验中的优势
本文所述方法为以往研究中描述的传统温度梯度法提供了一种替代方案10,13,14,16。在大多数此类研究中，使用的是带有温度梯度的大型水平铝板，而产生该梯度的机制各不相同，包括加热/冷却装置、水浴等。在这些情况下，温度梯度是在铝板表面形成的（而非在笼内空气温度中）。因此，大多数（但并非全部）替代技术对昆虫飞行能力的限制均高于本实验方案。在本方法中，昆虫可在各笼之间相对自由地飞行，从而更真实地表现出其在选择行为中的自然行为。此外，还可通过使用更大的笼子和培养箱等手段对该实验装置进行扩展，例如用于体型较大的昆虫。
除了具有自然行为优势外，我们还展示了两个腔室内部极高的温度均匀性，从而实现了简单的评分，并可明确选择两个较大的单一温度腔室。采用此类二元大腔室设计可降低数据中的噪声；例如，在梯度装置中，昆虫的任何偶然移动都会改变其在梯度上的位置，从而影响其表现出的温度偏好。
本文所述技术还具有操作简便、成本低廉的优点。该技术无需额外的温控设备（例如水浴10和/或加热板11,12,13,14,15），除切割好的丙烯酸管和钻孔外，不需要专业仪器，也不需要相机18,19或复杂的分析软件19。其他技术中使用的此类组件可能价格昂贵，且在开始实验前往往需要具备较高的专业知识并进行大量测试。
如果无外部电源，也可使用电池供电的不同设备来复制该技术，使得该系统非常适合在野外开展实验。此外，可对同一装置稍作修改，用于研究其他二元选择偏好情况，例如明暗选择、高/低湿度选择等，无论在实验室还是野外均可进行。
本方案中的全尺寸装置明显小于温度梯度装置，因此更容易放入上述的生物安全三级（BSL 3）手套箱中。此外，昆虫更易于控制：实验结束时可通过CO2将其击倒，分离桥接部分后可迅速重新密封饲养笼。这些控制优势非常适合生物安全三级（BSL 3）环境下的操作。
然而，我们承认，我们的装置仅允许进行二元选择，而非沿梯度范围内的自由选择，这可能需要根据具体应用进行额外的实验以确定最佳温度。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
AHR 感谢马来西亚人民信托委员会（Majlis Amanah Rakyat，MARA）提供的资金支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 丙烯酸管（桥接管） | Perspex | 900 mm 外径 | 尺寸（长 × 直径）：8 cm × 9 cm；比培养箱前方孔洞大 1 cm。顶部孔洞尺寸：1.6 cm |
| 二氧化碳（CO2）充气装置 | Peaken | B08HM2BDDB | 任何 CO2 笔均可使用 |
| 数字培养箱（×2） | VWR | VWR INCU-Line 1L 10 (390-0384) | 培养箱前方孔洞尺寸：直径 8 cm。两个培养箱上的孔洞必须位于正中心，且位置完全一致，以便桥接管对齐。应使用标准 8 cm ‘hole saw’ 钻头预先钻孔。培养箱大小应刚好可容纳一个蚊笼。 |
| 机械式吸虫器（用于蚊子） | Watkins and Doncaster | E710 | 理想筒体尺寸为 50 × 28 mm，管径为 9 mm。 |
| 蚊笼（×3；两个用于实验，一个用于储存昆虫） | BugDorm | BD4S1515 | 尺寸：17.5 cm × 17.5 cm × 17.5 cm，带 12 cm 手套开口。网材：针织尼龙 |
| 塑料漏斗 | 开口直径 = 5 cm 漏斗长度 = 5 cm 出口孔径 = 1 cm | ||
| 塑料手持式吸虫管（用于果蝇或小型昆虫） | Watkins and Doncaster | E714 | 手动/口吸式 |
| 橡胶圈或可重复使用扎带 | 任选其一，视个人偏好而定。 | ||
| 温度探头 | Eidyer | B07J4T1VQZ | 任何带有至少 100 cm 细长探针的温度计 |
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