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利用微透析剖面仪对氧化-缺氧土水界面中的溶解溶质进行采样

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DOI：

10.3791/64358

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2023年3月24日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Geography and Planning, University of Liverpool, 2Department of Health and Environmental Sciences, Xi’an Jiaotong-Liverpool University

本文内容

摘要

一种微透析剖面采样器被用于采集氧化-缺氧土水界面间溶解态孔隙水溶质 原位 扰动极小。该装置旨在捕捉由土壤-水界面及更深层处的扰动所引起的浓度-深度分布的快速变化。

摘要

生物地球化学过程在氧化-缺氧界面处对扰动的响应表现为在空间尺度（毫米级）和时间尺度（小时级至天级）上的快速变化。解析这些快速的生物地球化学变化需要 原位，具有高空间和时间采样分辨率的微创工具。然而，现有的被动采样装置在许多情况下作用有限，这要么是由于其一次性使用特性，要么是由于样品制备过程复杂且工作量大。

为解决这一问题，建立了一种微透析剖面仪，其包含33根独立的聚醚砜纳米膜管（半透性，<20 nm 孔径），集成于一维骨架（60 mm）中，可在土壤-水界面处以1.8 mm的高分辨率（外径加一个间距，即探针间0.1 mm）连续采集孔隙水中溶解的化合物。该采样机制基于浓度梯度扩散原理。自动加载脱气水可最大程度减少对氧化-还原界面处化学物质的扰动。

本文描述了装置设置及在土壤-水界面处每日连续采集孔隙水样的操作步骤。在灌溉扰动前（第6天）和扰动后（第7天）选择性地测量了浓度-深度分布剖面。结果表明，浓度-深度分布正经历快速变化，尤其是对氧化还原敏感的元素（如铁和砷）。这些方案有助于研究在物理、化学和生物因素引起的多种扰动条件下，土壤-水界面处的生物地球化学响应。本文还全面讨论了该方法在环境科学领域潜在应用中的优缺点。

引言

氧化-缺氧界面是生物圈中一个普遍存在的特征，对生物地球化学循环至关重要1。该界面具有高度异质性，其空间尺度可从沉积物/土壤-水界面的毫米级1,2，延伸至海洋缺氧区的数千米级3,4。该界面是研究元素生物地球化学复杂性的理想生境。

土壤-水界面在几厘米范围内具有典型的氧化-还原梯度特征，在中型实验系统（mesocosm）实验中易于建立。从表层水体中分子氧的消耗开始，分层的功能性微生物群落推动了多种梯度（如 O2、pH 和 Eh 梯度）在毫米尺度上的形成1。氧化-还原界面处的生物地球化学循环对自然界中的多种干扰十分敏感5,6。以沉积物和稻田为例，新鲜有机质（如枯枝落叶和秸秆）的输入、周期性淹水与排水、温度波动与极端温度以及生物扰动等因素，均可能引起氧化-还原界面处生物地球化学循环的变化，进而可能导致长期影响，例如温室气体排放、富营养化以及特定区域的污染。因此，土壤-水界面处的氧化-还原梯度为研究全球性、大尺度的生物地球化学循环提供了窗口。长期以来，人们对沿土壤-水界面高分辨率地进行溶解物质的时空采样与分析颇感兴趣；然而，相关方法学进展仍十分有限。

规避破坏性孔隙水提取的缺点，非破坏性被动采样技术正被 increasingly 用于避免孔隙水化学性质的改变，并解决样品制备的复杂性问题7多种可执行高精度 原位 取样（从微米到厘米尺度）已被广泛应用，包括 原位 透析采样器（称为peepers）8，薄膜扩散平衡法（DET）9，薄膜扩散梯度（DGT）10溶解物质被被动采样 通过 扩散与吸附过程的机制。尽管这些方法在描述氧化-缺氧化学剖面方面已被证明有效，但它们仍为一次性使用，限制了更广泛的应用。

近年来，微透析技术作为一种灵敏的工具逐渐兴起，可用于在数分钟至数天的时间尺度上监测土壤中可溶性化合物的动态变化11,12,13,14在医学与环境科学中典型的微透析应用场景下，通常使用一种微型同心圆探针，该探针包含一个半透性管状膜（即微透析器），用于检测组织间液或土壤溶液，以避免对代谢过程造成显著干扰 和化学形态分析15,16微透析最大的内在优势之一是 原位 捕获土壤或生物组织中随时间变化的浓度动态15,16.

基于微透析原理，我们开发了一种更易于使用的微透析分析装置，此前称为集成孔隙水注入 （IPI）分析仪，该装置可根据浓度梯度扩散原理对孔隙水溶质进行连续平衡透析2。该微透析装置采用中空纳米膜管，用于灌注液的主动预装填以及溶解溶质的被动扩散，这与渗析器（peepers）、Rhizon取样器等压力滤器和基于富集的DGT技术所使用的整体孔隙水扩散方式不同。该装置已在高原和淹水土壤中对阳离子和阴离子元素的时间和空间采样中经过测试和验证（图1A-1）13,15,16。简单的泵入-泵出式微透析显著减少了样品制备的步骤2,15。

我们通过将一组采样器集成到一维支撑骨架上，制备了一种微透析剖面仪，该剖面仪可在土壤-水界面和根际实现高分辨率采样2,15,17。在本研究中，对采样装置和采样方法进行了大量改进，以在最小扰动条件下于土壤-水界面（60 mm 垂直深度）采集 33 个孔隙水样品，用于后续元素分析。整个采样过程耗时约 15 分钟。由于微透析剖面仪在环境科学领域尚属新颖，本文详细介绍了该装置的组件和采样步骤，以展示微透析技术在监测土壤-水界面化学信号变化方面的潜力。

微透析剖面仪的描述
微透析剖面仪装置在先前设计基础上进行了适当改进2，如图1所示。纳米膜的有效孔径（图1C-1）估计仅为数纳米，以阻止大分子和微生物细胞的扩散。先前测试表明，经过6个月的浸没培养后，在管壁内侧或外侧均未发现铁沉积物15。设计了一种弯曲的中空骨架（图1C-2），并采用稳定的尼龙材料通过3D打印制成。共安装了33根纳米膜管（聚醚砜；表面孔径：0–20 nm；内径×外径×有效采样长度：1.0 mm × 1.7 mm × 54 mm；理论体积：42.4 µL），并通过匹配的聚四氟乙烯（PTFE）管（长度：18 cm × 直径2 cm，图1C-1）连接，固定于骨架上，并穿过PVC容器的一侧（图1B）。该装置的采样组件（图1B-1）距离PVC容器侧壁2 cm。在注入侧（图1B-4），所有管道均连接至一个一分多接头，并以密封方式固定于缓冲容器中（图1B-7）。通过一个三通阀将医用输液袋（图1B-11）与缓冲容器相连。系统密封性在后续实验操作前均在水中进行了仔细检测。医用输液袋中预装的水（18.2 MΩ，500 mL）始终保持无氧状态（图1C-8）。该装置的具体设置及孔隙水采样过程如下所述。

方案

1. 单个微透析采样器的制备

  1. 使用陶瓷刀将原始纳米膜管（内径 × 外径 × 长度：1.0 mm × 1.7 mm）精确切割成共33段短管，每段长58 mm。
  2. 使用陶瓷刀将聚四氟乙烯（PTFE）管精确切割成66段，每段长180 mm。
    注意：请勿使用任何金属刀具，以避免污染。
  3. 在任意洁净的塑料板上充分混合双组分（AB）环氧胶粘剂，静置30分钟，直至其变粘稠。小心地将AB环氧胶粘剂涂覆于PTFE管顶端的外表面，确保胶粘剂仅覆盖管端4 mm长度，且无多余胶粘剂堵塞管道。
  4. 通过轻轻旋转，将步骤1.2–1.4中制备的两段PTFE管分别与步骤1.1中制备的每一段纳米膜管连接。
    注意：请勿使胶粘剂在接头处过量积聚，并确保胶粘剂不污染纳米膜管内部。
  5. 重复步骤1.4，完成全部33个原始微透析采样器的组装。
  6. 将步骤1.6中组装完成的采样器静置过夜，以确保胶粘剂完全固化并稳定。
  7. 通过将微透析采样器浸入乙醇（纯度99.5%）中1小时，随后分别用2%稀释的HNO3和超纯水在室温下进行15分钟的超声清洗，以增强其亲水性并清洁采样器。
  8. 使用5 mL注射器在水中通气鼓泡，检测微透析采样器的通畅性和气密性。

2. 微透析分析仪的组装

  1. 使用附带的 CAD 文件（补充文件 1) 使用尼龙材料打印预设计的骨架图1C-2).
  2. 用经酸洗的PVC容器，根据骨骼大小，使用3D打印机的雕刻模块加工出两条平行的狭缝（间距5 cm）。
  3. 使用环氧胶粘剂塑造一个50 mL离心管管帽形状的一对多连接器。在胶粘剂固化前，将33个硅胶帽（长1 cm）插入其中，并静置过夜。
  4. 从管盖中取出一转多连接器。
  5. 使用陶瓷刀切割固化的环氧胶粘剂，确保所有硅帽末端均无遮挡。
  6. 用2%稀释的HNO₃彻底冲洗一分多连接器3 分别用超纯水清洗15分钟。在常温条件下干燥一分多路连接器。
  7. 在管子底部连接一个三通阀，用作缓冲容器。
  8. 使用AB环氧胶将一分多连接器安装到50 mL离心管上，组装缓冲容器。
  9. 将第1部分制备的各个微透析采样器组装到骨架上（步骤2.1）。此步骤中，使用热熔胶辅助固定，使每个采样器与骨架的上/下边缘平行。
  10. 重复步骤2.9，直至所有微透析采样器（n = 33）均安装在骨架上。
  11. 确保骨架两侧的33个采样器均穿过PVC槽。使用AB环氧树脂胶密封骨架接缝处与槽口之间的缝隙。
  12. 将骨架一侧的33个采样器以密封方式连接至缓冲容器 通过 预装于50 mL离心管中的一对多连接阀（步骤2.8）
  13. 通过三通阀将预装有水（18.3 MΩ）的医用输液袋连接至缓冲容器。
  14. 使用硅胶帽封闭采样端的33个采样器。通过转动三通阀，使生理盐水从医用输液袋流入每个微透析采样器，以逐一检查各采样器的通畅性和密封性。完成全部检查后，关闭并关断所有采样器及缓冲容器上的阀门。

3. 土壤培养

  1. 在淹水土壤培养前，对医用输液袋中的水进行脱气以去除氧气。将高纯度氮气通入输液管路中，在输液袋的路径中过夜通入氮气（图1-C8）。
  2. 使用三通阀关闭剖面仪与脱气袋之间的连接。
  3. 小心地将450 g过筛、风干的土壤（粒径 < 2 mm）加入PVC容器中，使五个微透析采样器保持在土壤表面以上。
  4. 用纱布覆盖土壤表面，然后将超纯水（18.3 MΩ）倒入土壤中使其被淹没。当土壤表面以上水深达到5 cm时，移除纱布。
  5. 一旦土壤培养开始，立即用预装溶液对系统进行吹扫。打开厌氧袋与透析采样器之间的连接，以冲洗采样系统。每次用水吹扫采样器时，使用相当于采样器总体积10倍的水量。
  6. 完成一个采样器的吹扫后，使用洁净的硅胶帽将其封口。
  7. 重复步骤3.6，直至所有采样器均完成吹扫。此时，一个淹水土壤培养与采样系统已建立完毕。
  8. 调节厌氧袋的高度，使其与水面高度一致。
  9. 确保所有管路中均充满水。若未充满，打开帽盖，降低管口位置，使水从厌氧袋中流出。
  10. 关闭所有帽盖和阀门。
  11. 在为期7天的培养过程中，关闭厌氧袋与透析采样器之间的连接。

4. 微透析探针取样

  1. 采样前，调节土壤容器、采样顶部和厌氧袋中的水位至相近高度，以避免水势出现显著差异。在整个土壤培养期间，始终维持这一操作。
  2. 打开厌氧袋与缓冲容器之间的连接。
  3. 从上至下取下第一个采样器的盖帽。
  4. 使用移液器准确吸取133 µL样品，转移至已预装133 µL 2% HNO3（用于样品保存）的样品瓶（0.6 mL）中。
  5. 在采样过程中，观察厌氧袋的观察室（图1A-9）中水滴缓慢而均匀地流向微透析采样器的现象。
  6. 用硅胶盖封闭采样管。然后移至下一个采样管。
    注意：对于亚铁（Fe²⁺）等氧化还原敏感性元素的分析，必须采用不同的保存方法，例如使用脱气的（10 mM）EDTA溶液，并在氮气吹扫条件下进行采样。
  7. 重复步骤4.6，直至完成全部33个样品的采集。随后关闭厌氧袋与缓冲容器之间的连接。
    注意：采样通常可在15分钟内完成。根据当前设计，采样每日进行一次，以避免采样管之间的交叉污染。尽管溶质在管内的扩散速度较慢，但仍可能扩散至缓冲容器并污染其他采样管。
  8. 第6天采样结束后，立即补充淹水水层，这将对土壤表面造成扰动。
  9. 通过称量样品瓶在转移孔隙水样品前后的质量，计算样品体积回收率。
  10. 采用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）测定孔隙水中元素的总溶解浓度。
    注意：浓度定量采用外标曲线法，同时使用内标铑（Rh）监测ICP-MS仪器运行的稳定性。

结果

根据本方案，建立了微透析剖面分析系统，如图1所示。土壤培养在淹水条件下进行（24 °C，避光）。选择性检测第6天和第7天的样品，以指示因补充淹水水分可能对土壤表面造成的扰动。

每次采样时，均观察到观察室内有数量稳定的水滴流向微透析采样器，表明转移的样品溶液正被厌氧袋中的溶液持续补充。如图2所示，样品体积的回收率平均为101.4% ± 0.9%，范围在100.2%至103.6%之间。样品体积略高的回收率可能表明厌氧袋与采样管顶端之间存在液位差。

利用第6天和第7天在土壤-水界面采集的样品，测定了孔隙水中铁（Fe）、锰（Mn）、砷（As）、镉（Cd）、铜（Cu）、铅（Pb）、镍（Ni）和锌（Zn）的总溶解浓度（图3）。浓度-深度分布因元素种类以及是否进行淹水补充而存在显著差异。尽管本研究未进行重复实验，因为采用了基于梯度的实验设计，但我们在先前的研究中已证实，深度依赖性化学信号的变化具有良好的重复性18。

第6天，Mn、Fe和As的溶解态浓度随土壤深度增加而升高，而Cu和Pb的浓度则随土壤深度增加而降低。该结果与土壤-水界面的一般原理和观测现象一致；具体而言，较深土壤中更为还原的环境会促进Mn15、Fe和As的还原性释放，同时由于形成溶解度较低的矿物，抑制了阳离子金属的释放。然而，Cd、Ni和Zn的浓度-深度分布呈现出不同的模式，其溶解态浓度从约−20 mm深度开始向更深层逐渐升高。

与第6天在−12 mm深度处的Fe（4.95 mg·L−1）和As（3.3 µg·L−1）浓度-深度分布相比，第7天Fe（1.46 mg·L−1）和As（0.8 µg·L−1）的浓度显著降低；然而，在−18 mm至−50 mm深度范围内，Fe和As的浓度显著升高（深度依赖性斜率，p < 0.001）。对于所测定的大多数元素（除Mn外），在好氧补水后，表层水体及−15 mm深度处表层土壤中的溶解态浓度均不同程度地显著降低。值得注意的是，第7天在约−10 mm深度处出现了Pb的浓度峰值，该模式与第6天观察到的结果呈相反趋势。这些不一致的结果可能是由于补水过程对系统的扰动以及土壤-水界面处生物地球化学过程的时间演化所致。无论何种情况，微透析剖面分析技术均显示出其在监测土壤-水界面化学分布时空变化方面的巨大潜力。

用于土壤-水分析和液体收集的带氮气鼓泡装置的微透析剖面仪示意图
图1：用于监测土壤-水界面化学动态变化至50 mm土壤深度的微透析剖面仪装置。（A）剖面仪在50 mm深度使用状态示意图，另见补充图S1。主要组件包括（B1,C1）安装在3D打印骨架上的33个微透析采样器（B2,C2），该骨架进一步安装于（B3）培养容器（一个50 mL样品管）、（B4,B7,C4）一分多缓冲容器、（B9-B12）用作脱气水供应源的医用输液袋，以及（C5）离线采样移液器。（B5）全部33个采样器的采样位置通过（B6）塑料条对齐至同一高度。脱氧水通过（C8）向供水反方向通入氮气鼓泡制备。请点击此处查看该图的放大版本。

深度与体积回收率关系图，带误差棒的数据点；体积变化的统计分析。
图 2：使用 H2O 作为灌注液时的采样体积回收率。 误差棒表示两次独立剖面采样的标准偏差。请点击此处查看该图的放大版本。

金属浓度分布；图表；第6天与第7天对比；深度与浓度关系；科研数据分析。
图3：浓度-深度分布图。（A）锰，（B）铁，（C）砷，（D）镉，（E）铜，（F）铅，（G）镍，以及（H）锌在第6天和第7天的测量结果。Y轴上的负刻度标签表示位于水-土界面以下的深度。请点击此处查看该图的放大版本。

用于液体流动分析的实验室管路系统流体动力学装置。
图 4：采样器内部因泄漏导致铁沉淀的失败案例。 请点击此处查看该图的放大版本。

补充文件1：预设计骨架打印用的计算机辅助设计文件。 请点击此处下载该文件。

补充图S1：正在使用的轮廓仪。 (A在淹水的土壤上。B-E顶部和侧面视图照片以及连接细节分别展示。E三通阀用于连接缓冲容器和医用输液袋。 请点击此处下载此文件。

讨论

根据以往的实验和实践2，在微透析剖面仪组装和孔隙水采样过程中，需特别注意以下几个方面。首先，纳米膜管与连接管之间的连接应小心操作，避免连接处发生堵塞或泄漏。由于土壤在淹水条件下培养，若引入氧气，会迅速氧化透析管中的亚铁离子并导致其沉淀（图4）。因此，在组装微透析剖面仪之前，必须逐一检查每根微透析管的完整性（无破损）、连接处的气密性以及管道的通畅性。同样，支撑框架与培养容器侧壁的连接也需谨慎操作，以防泄漏。在正式实验前，对各连接部位进行泄漏检查始终是首要步骤。其次，厌氧袋中的灌流液必须充分脱氧。否则，孔隙水中的亚铁离子将与灌流液中的氧气反应生成不溶性沉淀物（图4），这将严重改变溶质的形态和浓度，以及向纳米膜管扩散的过程。第三，过低的采样频率（以天或周计）会导致溶质扩散进入缓冲区域，可能污染整个剖面样品。为解决此问题，可考虑三种可能的方案：（1）提高采样频率，例如每天一次（但多次采样可能导致透析采样器附近溶质耗竭）；（2）根据需要延长注液区连接管的长度；（3）重新设计采样管路，实现单根管道的独立控制。这些也是未来仪器改进的方向。第四，在采样过程中，必须确保厌氧袋内液面、淹水土壤和采样管内的水位大致处于同一高度，以平衡水压。否则，膜管内外的水势差将导致溶质扩散速率降低或升高。

局限性
首先，由于微透析剖面仪尚未商业化，该方法在设备制备方面仍较为耗时。制备单个透析管需要数天时间，包括打印支撑骨架、设备组装和清洗。 但该设备后续可重复使用的特点完全弥补了这一不足。其次，该设备在非淹水土壤环境中的应用存在一定局限性，而渗析探针（peepers）可用于此类场景18。由于在干燥土壤中膜管内外存在显著的水势差，预装溶液会出现扩散损失；事实上，在初步试验中观察到采样体积回收率在10%–36%范围内波动（详细数据未显示），这给实验结果带来了不确定性。

本方法与现有或替代方法的比较
该方法部分解决了现有被动采样器无法重复采样的问题，并显著减少了样品前处理的工作量，尤其适用于缺氧孔隙水的采样与保存2。透析溶质浓度和形态的瞬时变化能够灵敏地反映氧化-还原界面对外界环境扰动的响应。理论上，以分钟、小时或天为频率进行采样，可捕捉到界面处快速变化的过程。而对于需要连续部署数天的被动采样器，某些关键时段 和关键区域可能会被遗漏6,19。

环境科学中的重要性及潜在应用
该方法可推动在氧化-还原界面开展的生物地球化学研究，例如，在特定的Eh-pH条件下识别生物地球化学过程的“热点时刻”和“热点区域”。氧化还原过程是生命活动的基本过程1。微生物尤其需要适宜的生存环境条件，并对环境扰动极为敏感1。这导致在异质性环境中，微生物群落和生物地球化学过程呈现出高度动态的发展特征20。若不考虑环境的高度异质性而直接采样，往往获得的是来自多种环境条件的混合样品，从而导致所测得的化学信息与关键微生物之间出现错配20。在典型的淹水稻田土壤或沉积物表层几厘米范围内，存在显著的氧化还原梯度，以及多种物理、化学21和生物梯度1。相关技术必须能够捕捉毫米尺度的生物地球化学信号，否则所获得的数据若与实际尺度不匹配，可能导致结论模糊不清。微透析剖面仪能够在数天或数小时内以极小干扰监测土壤-水界面处毫米尺度的生化信号。本研究中，观察到不同元素在48小时内的时空动态变化，可能与补水扰动有关。因此，微透析剖面仪更广泛的应用有助于理解在变化的世界中，扰动如何影响关键的生物地球化学过程。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作由国家自然科学基金（41977320，41571305）和西交利物浦大学重点计划专项基金（KSF-A-20）资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3D 打印机Snapmaker, 美国Snapmaker 2.0 型号：A250
3M DP190 Scotch-Weld 灰色胶水 3M 美国489-483灰色
离心管Titan, 中国SWLX-JZ050-ZX50 mL，已灭菌，无 DNASE/RNASE/蛋白酶/热原
陶瓷刀R felngli, 中国N.A.通用型
EDTA 自由酸Sigma-AldrichCAS 60-00-4Sigma-Aldrich#EDS-1KG
乙醇AdamasCAS 64-17-5水分 ≤ 50 ppm（卡尔·费休法），99.5%，SafeDry，含分子筛，Safeseal
热熔胶 Magic Dragon, 中国N.A.JTWJRRJB001
电感耦合等离子体质谱仪 PerkinElmer, Inc., Shelton, CT 美国N.A.型号：NexION 350X
医用输液袋 湖南康立来医疗设备有限公司N.A.250 mL，已灭菌
Milli-Q 水系统Mingche, Inc., 中国N.A.18.3 MΩ，水纯化系统型号：24UV
纳米膜管（聚醚砜）天津市摩提膜科技有限公司N.A.聚醚砜，内径 1 mm，孔径 <20 nm，经乙醇（99.5%）预处理
氮气苏州气体，中国N.A.高纯度
硝酸（浓）AdamasCAS 7697-37-269%，单金属 < 50 ppt，PFA 瓶装
尼龙纤维Soumiety10052076600273用于 3D 打印
移液器 Bond A3 移液器N.A.200 μL
移液器吸头TitanT2-H-T0200200 μL, 300 μL 吸头盒，非无菌|200 μL|Titan
聚四氟乙烯管ROHS, 中国CJ-TTL外径 1 mm
样品瓶Titan, 中国EP0060-B-N0.6 mL，已灭菌，无 DNASE/RNASE/蛋白酶/热原
硅胶帽富晨香塑, 中国N.A.内径 1 mm，长度 1 cm
超声波清洗机ElmaN.A.型号：E120H
方形 PVC 水管Taobao.comN.A.高 × 宽，12 cm × 15 cm
输液用三通阀OEM, 中国N.A.医用级别；阀体：PC 材料；阀芯：PE 材料；螺帽：ABS 材料

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