小细胞外囊泡高通量分离纯化的流式细胞术分选参数优化

Summary

该协议通过优化空气喷嘴的尺寸、鞘液压力、样品流压、电压、增益和触发阈值参数，为小细胞外囊泡提供了一种快速且尺寸特异性的分离方法。

Abstract

小细胞外囊泡（sEV）可以从所有细胞类型中释放出来，并携带蛋白质，DNA和RNA。信号分子是细胞生理和病理状态的指标。然而，sEV分离没有标准方法，这阻碍了下游生物标志物鉴定和药物干预研究。在本文中，我们提供了通过流通池分选仪分离和纯化50-200 nm sEV的详细方案。为此，选择了50 μm喷嘴和80 psi鞘液压力，以获得良好的分选率和稳定的侧流。标准尺寸的聚苯乙烯微球用于定位100、200和300 nm颗粒的群体。通过进一步优化电压、增益和前向散射（FSC）触发阈值，可以将sEV信号与背景噪声分离。这些优化提供了一个关键排序设置面板，使人们能够仅使用 FSC 与侧向散射 （SSC） 获得具有代表性的 sEV 群体。基于流式细胞术的分离方法不仅可以进行高通量分析，还可以基于生物标志物表达对sEV进行同步分类或蛋白质组分析，从而开辟了许多下游研究应用。

Introduction

细胞释放不同大小的细胞外囊泡（EV），产生信号分子和膜包涵体，这对细胞^{间通讯很重要}1。不同大小的EV也起着不同的生物学作用，50-200nm sEV能够将RNA，DNA和蛋白质精确地分配到正确的细胞外位置。sEV还有助于确定其分泌机制，不仅涉及正常生理过程的调节，如免疫监视，干细胞维持，血液凝固和组织修复，还涉及肿瘤进展和转移等几种疾病的潜在病理学^2，3。有效分离和分析sEV对于识别生物标志物和设计未来的药物干预措施至关重要。

随着sEV临床应用的不断研究，sEV的分离方法提出了更高的要求。由于sEV在大小、来源和含量上的异质性，以及它们在理化和生化性质上与其他EV的相似性，因此没有标准的方法进行sEV分离^4，5。目前，超速离心、体积排阻色谱（SEC）、聚合物沉淀和免疫亲和捕获是最常见的sEV分离方法⁶。超速离心仍然是研究中sEV分离的金标准，尽管耗时，导致纯度低，尺寸分布为40-500 nm，并且在长期离心后对sEV造成重大机械损坏7，^8，

Protocol

1. 细胞培养

1. 准备补充有10%胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良鹰培养基（DMEM）培养基。在75cm² 培养瓶中以1 x 10⁶ 个细胞/ mL的密度培养人胰腺癌细胞PANC-1。将培养物在37°C与5%CO₂孵育。
2. 当细胞密度在显微镜观察下达到75%-80%时，传代培养细胞。取出培养基，用 3-5 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS; 0.01 M， pH 7.2-7.4） 冲洗 2 次。
3. 弃去溶液，加入1-2mL胰蛋白酶-EDTA溶液，让细胞分离，直到它们变圆并悬浮在显微镜下的培养基中。加入新鲜培养基，吸出并分散到装有 15 mL 培养基的 75 cm² 培养瓶中。使用1:2至1:4的亚种比例（推荐）。
   注意:所有操作均在生物安全柜中进行，以避免细胞污染。

2. 培养基收集

1. 将细胞在37°C下用5%CO₂孵育48小时。在两个50mL离心管中收集细胞上清液（90mL），并在4°C下以300× g 离心10分钟。
2. 将上清液转移到新的无菌管中，并在4°C下以2，000×g离心20分钟，10 000×g离心30分钟，12，000×g

Results

实验方案的流程图如图 1所示。该方法以标准尺寸聚苯乙烯微球作为粒径分布的参考标准品。在特定仪器参数条件下，使用对数形式可以清楚地将粒子信号与FSC与SSC图中的背景噪声区分开来。门控策略如图 2 所示。R4、R5 和 R6 分别指 100 nm、200 nm 和 300 nm 微球的位置。R7是50nm以下电子噪声的检测限，R8是50-200nm粒子的位置范围。

超速离心后，来自PANC-1电池的EVs混合物的粒径分布在40-400nm的宽范围内（图3）。为了分离和纯化50-200 nm sEV，根据标准微球的位置进行流式细胞术分选以获得特定尺寸的sEV（图4）。通过NTA验证了分离质量，发现分选后的sEV粒径范围在50-200 nm之间（ 如图5所示）。通过TEM进一步观察到sEV的存.......

Discussion

该协议概述了使用流通池分选仪分离和纯化指定粒径为50-200 nm的sEV的优化方法，该方法已通过NTA验证。该方法解决了获得粒径均匀、纯度高的sEV的瓶颈问题，避免了包裹在大型EV中的无关生物分子的干扰²²。流式细胞术可以进行快速、高通量分析，每秒可捕获 100，000 个颗粒，每秒做出 70，000 次分选决策¹⁷，大大减少了时间并反映了 sEV 颗粒的异质性。此外，这种基于流式细胞术的方案可以根据特定大小的EV亚群中的个体兴趣进行定制。替代门范围可用于识别和分离具有与上述设置相同的仪器参数的感兴趣群体，例如空气喷嘴、护套流体压力、样品流动压力和触发阈值参数。

这种方法的技术难点在于分离具有不同大小范围的种群，特别是与背景噪声区分开来。我们确定了关键排序设置的面板。首先，喷嘴的大小会影响分拣率。为了提高通过分选获得的sEV的浓度，该方法使用50μm喷嘴，并且需要80psi的鞘液压力来稳定侧流。随着鞘液压力的增加，下降频率增加，导致更高的事件发生率和更短的分拣时间

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
离心管	Beckman Coulter	344058
培养瓶	Corning
Dulbecco's 改良 eagle 培养基	康宁 Cellgro	10-013-CV
胎牛血清	SUER	SUER050QY
流式细胞分选仪	贝克曼库尔特	Moflo Astrios EQ
人胰腺癌细胞 PANC-1	NA	NA	PANC-1 细胞由浙江大学生命科学学院杨伟军教授捐赠
激光粒径和 zeta 电位 激光粒径和 zeta 电位分析仪	Malvern	Zetasizer Nano ZS 90
磷酸盐缓冲盐水	Gibco	C20012500BT
聚苯乙烯荧光微球	Beckman Coulter	6602336
透射电子显微镜	JEOL	JEM-1200EX
胰蛋白酶-EDTA 溶液	Gibco	1713949
超彩虹荧光颗粒	贝克曼库尔特	B28479
超速离心机	贝克曼库尔特	Optima-L80XP
超速离心机转子	贝克曼库尔特	SW32TI