本方案通过优化空气喷雾喷嘴尺寸、鞘液压力、样品流压力、电压、增益和触发阈值等参数，提供了一种快速且基于尺寸特异性的外泌体小细胞外囊泡分离方法。
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本文内容
摘要
摘要
所有细胞类型均可释放小型细胞外囊泡（sEV），其内携带蛋白质、DNA 和 RNA。这些信号分子可作为细胞生理与病理状态的指示标志。然而，目前尚无标准化的 sEV 分离方法，这限制了后续生物标志物的鉴定及药物干预研究。本文提供了一种利用流式细胞分选仪分离和纯化 50–200 nm sEV 的详细实验方案。实验中选用 50 µm 喷嘴及 80 psi 鞘液压力，以获得良好的分选速率和稳定的侧向液流。采用标准尺寸的聚苯乙烯微球对 100、200 和 300 nm 颗粒群体进行定位。通过进一步优化电压、增益以及前向散射光（FSC）触发阈值，可将 sEV 信号与背景噪声有效分离。这些优化条件构成了一套关键的分选参数，使研究者仅通过前向散射光（FSC）与侧向散射光（SSC）即可获得具有代表性的 sEV 群体。基于流式细胞术的分离方法不仅可实现高通量分析，还可根据生物标志物的表达情况对 sEV 进行同步分类或蛋白质组学分析，从而为多种下游研究应用提供了可能。
引言
细胞会释放不同大小的细胞外囊泡（EVs），这些囊泡含有信号分子和膜内含物，在细胞间通讯中具有重要作用1。不同大小的EVs具有不同的生物学功能，其中50–200 nm的小细胞外囊泡（sEV）能够将RNA、DNA和蛋白质精确地分布到特定的细胞外位置。sEV还有助于决定其分泌机制，不仅参与调控免疫监视、干细胞维持、血液凝固和组织修复等正常生理过程，也涉及肿瘤进展和转移等多种疾病的病理机制2,3。有效分离和分析sEV对于发现生物标志物以及设计未来的药物干预策略至关重要。
随着对sEV临床应用的持续研究，sEV的分离方法面临着更高的要求。由于sEV在大小、来源和内容物方面具有异质性，且其理化和生化特性与其他EV相似，目前尚无标准的sEV分离方法4,5。目前，超速离心法、尺寸排阻色谱法（SEC）、聚合物沉淀法和免疫亲和捕获法是最常见的sEV分离方法6。尽管超速离心法耗时较长，所得sEV纯度较低，粒径分布范围宽（40–500 nm），且长时间离心会对sEV造成显著的机械损伤7,
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方案
1. 细胞培养
- 制备添加10%胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。将人胰腺癌细胞PANC-1以1 × 106 个细胞/mL的密度接种于75 cm2 培养瓶中，在37 °C、5% CO2 条件下培养。
- 在显微镜下观察，当细胞密度达到75%–80%时进行传代。吸除培养基，用3–5 mL磷酸盐缓冲液（PBS；0.01 M，pH 7.2–7.4）冲洗2次。
- 弃去液体，加入1–2 mL胰蛋白酶-EDTA溶液，观察细胞在显微镜下变圆并从瓶壁脱落。加入新鲜培养基终止消化，吹打混匀后按1:2至1:4的传代比例（推荐）将细胞悬液分装至新的75 cm2 培养瓶中，每瓶加入15 mL培养基。
注意：所有操作均需在生物安全柜中进行，以避免细胞污染。
2. 培养基收集
- 将细胞在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 48 小时。收集细胞上清液（90 mL）至两个 50 mL 离心管中，并在 4 °C 下以 300 x g 离心 10 分钟。
- 将上清液转移至新的无菌管中，并在 4 °C 下依次以 2,000 x g 离心 20 ....
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结果
实验方案的流程图如图1所示。本方法中，采用标准尺寸的聚苯乙烯微球作为粒径分布的参考标准。在特定的仪器参数条件下，通过FSC与SSC散点图的对数形式，可将颗粒信号与背景噪声明显区分开。门控策略如图2所示。R4、R5和R6分别代表100 nm、200 nm和300 nm微球的位置。R7为低于50 nm的电子噪声检测限，R8为50–200 nm颗粒的位置范围。
经超速离心后，源自PANC-1细胞的EVs混合物的粒径分布范围较宽，为40–400 nm（图3）。为分离和纯化50–200 nm的sEV，根据标准微球的位置进行流式细胞分选，以获得特定粒径的sEV（图4）。通过NTA对分离质量进行验证，结果显示分选后sEV的粒径范围在50–200 nm之间（如图5所示）。进一步通过TEM观察到sEV的存.......
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讨论
本方案概述了一种利用流式细胞分选仪分离和纯化粒径为50-200 nm的小细胞外囊泡（sEV）的优化方法，并通过纳米颗粒追踪分析（NTA）对该方法进行了验证。该方法解决了获取粒径均一、纯度高的sEV的技术瓶颈，避免了包裹在较大尺寸细胞外囊泡中的无关生物分子的干扰22。流式细胞术可实现快速、高通量分析，每秒可捕获100,000个颗粒，并每秒做出70,000次分选决策17，显著缩短了处理时间，同时反映了sEV颗粒的异质性。此外，基于流式细胞术的本方案可根据研究者对特定尺寸EV亚群的兴趣进行定制。在保持上述仪器参数（如气雾喷嘴、鞘液压力、样本流压力和触发阈值参数）不变的前提下，可通过设置不同的设门范围来识别和分离目标群体。
该方法的技术难点在于分离不同尺寸范围的群体，尤其是将其与背景噪声区分开来。我们确定了一组关键的分选参数。首先，喷嘴尺寸会影响分选速率。为了提高分选后获得的小细胞外囊泡（sEV）的浓度，本方法采用50 µm的喷嘴，并需要80 psi的鞘液压力以稳定侧流。鞘液压力越高，液滴频率增.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作得到了浙江中医药大学科研基金（2020ZG29）、浙江省基本公益研究计划项目（LGF19H150006，LTGY23B070001）、浙江省教育厅科研项目（Y202147028）以及浙江大学实验室部门实验技术项目（SJS201712，SYB202130）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 离心管 | Beckman Coulter | 344058 | |
| 细胞培养瓶 | Corning | 430641 | |
| Dulbecco’s 改良伊格尔培养基 | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| 胎牛血清 | SUER | SUER050QY | |
| 流式细胞分选仪 | Beckman Coulter | Moflo Astrios EQ | |
| 人胰腺癌细胞 PANC-1 | NA | NA | PANC-1 细胞由浙江大学生命科学学院杨卫军教授提供 |
| 激光粒度与Zeta电位分析仪 | Malvern | Zetasizer Nano ZS 90 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Gibco | C20012500BT | |
| 聚苯乙烯荧光微球 | Beckman Coulter | 6602336 | |
| 透射电子显微镜 | JEOL | JEM-1200EX | |
| 胰蛋白酶-EDTA 溶液 | Gibco | 1713949 | |
| 超彩虹荧光颗粒 | Beckman Coulter | B28479 | |
| 超速离心机 | Beckman Coulter | Optima-L80XP | |
| 超速离心机转子 | Beckman Coulter | SW32TI |
参考文献
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Meldolesi, J. Exosomes and ectosomes in intercellular communication. Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018). ....
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重印与许可
