本方案通过优化空气喷雾喷嘴尺寸、鞘液压力、样品流压力、电压、增益和触发阈值等参数，提供了一种快速且基于尺寸特异性的外泌体小细胞外囊泡分离方法。
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摘要
摘要
所有细胞类型均可释放小型细胞外囊泡（sEV），其内携带蛋白质、DNA 和 RNA。这些信号分子可作为细胞生理与病理状态的指示标志。然而，目前尚无标准化的 sEV 分离方法，这限制了后续生物标志物的鉴定及药物干预研究。本文提供了一种利用流式细胞分选仪分离和纯化 50–200 nm sEV 的详细实验方案。实验中选用 50 µm 喷嘴及 80 psi 鞘液压力，以获得良好的分选速率和稳定的侧向液流。采用标准尺寸的聚苯乙烯微球对 100、200 和 300 nm 颗粒群体进行定位。通过进一步优化电压、增益以及前向散射光（FSC）触发阈值，可将 sEV 信号与背景噪声有效分离。这些优化条件构成了一套关键的分选参数，使研究者仅通过前向散射光（FSC）与侧向散射光（SSC）即可获得具有代表性的 sEV 群体。基于流式细胞术的分离方法不仅可实现高通量分析，还可根据生物标志物的表达情况对 sEV 进行同步分类或蛋白质组学分析，从而为多种下游研究应用提供了可能。
引言
细胞会释放不同大小的细胞外囊泡（EVs），这些囊泡含有信号分子和膜内含物，在细胞间通讯中具有重要作用1。不同大小的EVs具有不同的生物学功能，其中50–200 nm的小细胞外囊泡（sEV）能够将RNA、DNA和蛋白质精确地分布到特定的细胞外位置。sEV还有助于决定其分泌机制，不仅参与调控免疫监视、干细胞维持、血液凝固和组织修复等正常生理过程，也涉及肿瘤进展和转移等多种疾病的病理机制2,3。有效分离和分析sEV对于发现生物标志物以及设计未来的药物干预策略至关重要。
随着对sEV临床应用的持续研究，sEV的分离方法面临着更高的要求。由于sEV在大小、来源和内容物方面具有异质性，且其理化和生化特性与其他EV相似，目前尚无标准的sEV分离方法4,5。目前，超速离心法、尺寸排阻色谱法（SEC）、聚合物沉淀法和免疫亲和捕获法是最常见的sEV分离方法6。尽管超速离心法耗时较长，所得sEV纯度较低，粒径分布范围宽（40–500 nm），且长时间离心会对sEV造成显著的机械损伤7,8,9，它仍是科研中sEV分离的金标准。聚合物沉淀法通常使用聚乙二醇（PEG），但会伴随细胞外蛋白聚集体的共沉淀和聚合物污染，导致后续功能分析所需的纯度无法接受10,11。基于免疫亲和捕获的方法需要使用成本高昂且特异性各异的抗体，同时存在处理体积小、得率低等问题12,13,14。粒径是评估分离sEV纯度的主要指标之一。尽管实现sEV的高纯度仍难以企及，但SEC可有效去除大量培养基成分，且通过SEC方法提取的sEV颗粒主要集中在50–200 nm范围内15。现有技术存在若干缺点，包括但不限于耗时长、纯度低、得率低、重复性差、样本通量低以及可能对sEV造成损伤，这些限制使其难以适用于临床应用16。因此，在多种科研与临床场景中，亟需一种快速、低成本且能按尺寸特异性分离sEV的方法，适用于多种生物流体。
在流式细胞术中，单个颗粒以高通量、多参数的方式进行分析，并可分选出特定亚群17。由于细胞外囊泡（EVs）具有高度异质性，理想的分析方法应为单颗粒水平的流式检测，该方法已借鉴细胞分析的范式，利用光散射和荧光标记来识别与生理特性相关的特征及蛋白质组分18,19,20。然而，传统流式细胞术在检测小细胞外囊泡（sEV）时面临挑战，主要因其体积微小且表面生物标志物丰度较低。通过优化检测参数，无论采用前向散射光（FSC）、侧向散射光（SSC）还是荧光阈值触发参数，均可提高流式细胞术的灵敏度，以更好地区分背景噪声与sEV信号19。
通过本方案，使用荧光微球作为标准品优化了高分辨率流式细胞分选参数。通过选择合适的喷嘴尺寸、鞘液压力、阈值触发参数以及控制散射光强度的电压，我们能够从复杂的混合物中分离出特定的sEV亚群。
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方案
1. 细胞培养
- 制备添加10%胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。将人胰腺癌细胞PANC-1以1 × 106 个细胞/mL的密度接种于75 cm2 培养瓶中，在37 °C、5% CO2 条件下培养。
- 在显微镜下观察，当细胞密度达到75%–80%时进行传代。吸除培养基，用3–5 mL磷酸盐缓冲液（PBS；0.01 M，pH 7.2–7.4）冲洗2次。
- 弃去液体，加入1–2 mL胰蛋白酶-EDTA溶液，观察细胞在显微镜下变圆并从瓶壁脱落。加入新鲜培养基终止消化，吹打混匀后按1:2至1:4的传代比例（推荐）将细胞悬液分装至新的75 cm2 培养瓶中，每瓶加入15 mL培养基。
注意：所有操作均需在生物安全柜中进行，以避免细胞污染。
2. 培养基收集
- 将细胞在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 48 小时。收集细胞上清液（90 mL）至两个 50 mL 离心管中，并在 4 °C 下以 300 x g 离心 10 分钟。
- 将上清液转移至新的无菌管中，并在 4 °C 下依次以 2,000 x g 离心 20 分钟、10,000 x g 离心 30 分钟和 12,000 x g 离心 70 分钟。
- 弃去上清液，用 10 mL PBS 轻柔吹打重悬沉淀进行洗涤。再次在 4 °C 下以 12,000 x g 离心 70 分钟，然后将沉淀重悬于 10 mL PBS 缓冲液中，得到细胞外囊泡（EV）混合物。
- 进行纳米颗粒追踪分析（NTA）以定量并测定 EV 混合物的粒径。NTA 分析操作请参照仪器操作手册及参考文献21。
3. 细胞分选
- 执行流式细胞分选仪的标准启动程序。按下启动按钮开启仪器。在激光控制面板上点击激光功率按钮。在智能取样器子菜单中按下更换储液罐按钮，以对流路系统加压。
注意：启动前请确保废液罐为空，鞘液罐已加满。 - 使用经超声清洗的50 µm气雾式喷嘴，并将其安装至喷嘴组件上。在压力控制台将鞘液流压力调节为80 psi，样品流压力调节为80.3 psi。
- 按下启动鞘液流按钮，开始鞘液流运行。在智能取样器子菜单中点击去气泡按钮，自动去气泡10分钟，然后关闭该功能。
注意：在细胞分选过程中，不同尺寸的气雾喷嘴需要不同的鞘液压力以维持液流稳定性。本方法中使用50 µm喷嘴，只有当鞘液压力大于或等于80 psi时，才能产生稳定的侧向液流。样品流与鞘液流之间的压力差决定了分选的上样速度。在本方法设定条件下（样品流与鞘液流压力差为0.3–0.6 psi），液流相对稳定，且上样速度可使分选效率从压力差小于0.3–0.6 psi时的50%提升至80%。 - 对液流进行校准并确定激光焦点位置。打开照明室光源，通过小孔观察液流。调节上下、左右及前后微调旋钮，使液流居中对准小孔并聚焦清晰。
- 选择激光与液流交汇选项卡。根据提示连续按下绿色箭头按钮，完成激光交汇点与喷嘴对准的校准过程。
- 进入精细激光对准界面。选择640-722/44 (H)通道作为X轴参数，405-448/59 (H)通道作为Y轴参数。按下触发参数选择器，选择488 nm激光的SSC参数。打开所有激光快门。
注意：所选X轴和Y轴参数取决于系统的激光配置。若系统无640 nm或405 nm激光，可选择其他参数。为获得最佳效果，应选择在小孔条带上空间分离度最大的激光（不包括355 nm激光）。 - 将彩虹荧光微球用双蒸水稀释，取一滴加入1 mL双蒸水中，终浓度为每毫升1 × 106个微球。打开样品室门，放入装有已制备彩虹荧光微球的离心管。
- 按下启动样品按钮。调节上下微调旋钮以优化荧光强度，使每个信号尽可能强。在触摸屏控制面板上按下启动质控（QC）按钮，自动执行质控程序。
- 执行液滴延迟校准。进入分选设置界面，选择液滴延迟按钮。按下IntelliSort初始化按钮。仪器将自动调节液滴振荡频率和振幅，使液滴延迟值达到25 ± 5，并能清晰观察到液滴断裂点。按下维持按钮。
- 选择离心管作为分选输出类型。在分选室中放置一个15 mL离心管架。打开极板电压，并将电压设置为约4000 V。
- 通过选择液流设置按钮开启测试图案。调节充电相位滑块和偏转滑块，确保液流图像与收集管对齐。选择勾选标记按钮确认设置。
- 登录计算机上的Summit工作站。从文件主菜单中创建新实验方案。在Summit软件控制面板中选择直方图选项卡，创建一个散点图。
- 在工作区中右键点击新散点图的坐标轴，选择FSC作为X轴参数，SSC作为Y轴参数。将FSC和SSC以对数形式显示。
- 选择采集选项卡，并定位到采集参数面板。在启用参数子菜单中启用所有信号。选择FSC作为触发参数，并将阈值设为0.01。将FSC和SSC的电压和增益分别调节至250和0.6，以确保FSC与SSC散点图中的事件和细胞群能够清晰分离。
注意：阈值设置相当于设定流式细胞术可检测的粒子大小。阈值越大，可检测的粒子越大，而较小的粒子将被阈值过滤而无法检测。本方法中阈值设为0.01，因此所有大于电子噪声的粒子均可被检测。
4. sEV 的分离
- 将荧光聚苯乙烯微球稀释为100 nm、200 nm和300 nm的悬浮液。取1 µL微球加入1 mL双蒸水中。
- 依次加载微球悬浮液。在Summit软件的采集菜单下选择开始，记录20,000个事件。
注意：事件数量可根据需要调整。建议不少于5,000个事件，以满足统计学显著性要求。 - 在FSC与SSC散点图上右键单击，创建矩形区域，并拖动调整电子噪声区域和100 nm微球群体的位置与大小。右键单击相应区域，分别将其重命名为R7和R4。重复上述步骤，依次用矩形框选200 nm和300 nm微球，并分别重命名为R5和R6。
- 最后，基于电子噪声及定义为R8的200 nm颗粒位置，确定50–200 nm的分选区域。
注意：50 nm的检测下限设定在流式分选仪流动池电子噪声略上方。因此，噪声区域与200 nm微球群体之间的区域可定义为50–200 nm范围。 - 在分选逻辑与统计面板中编辑分选决策。双击左侧（L1）流道的空白字段，选择名为R8的区域以建立分选逻辑。选择纯度模式中的中止模式，并为L1流道设置1滴的液滴包络。
- 加载来自步骤2.3的500 µL EV混合样品。在Summit软件的采集菜单下点击开始按钮以获取数据，随后在分选菜单中点击开始，将50–200 nm的sEV收集至15 mL离心管中。
注意：所有操作均需在无菌环境中进行，以最大限度减少污染。 - 通过透射电子显微镜（TEM）观察sEV的存在，并使用纳米颗粒追踪分析（NTA）验证sEV的粒径。进一步通过蛋白质印迹（WB）分析检测CD9、CD63和CD81标志物的表达18。
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结果
实验方案的流程图如图1所示。本方法中，采用标准尺寸的聚苯乙烯微球作为粒径分布的参考标准。在特定的仪器参数条件下，通过FSC与SSC散点图的对数形式，可将颗粒信号与背景噪声明显区分开。门控策略如图2所示。R4、R5和R6分别代表100 nm、200 nm和300 nm微球的位置。R7为低于50 nm的电子噪声检测限，R8为50–200 nm颗粒的位置范围。
经超速离心后，源自PANC-1细胞的EVs混合物的粒径分布范围较宽，为40–400 nm（图3）。为分离和纯化50–200 nm的sEV，根据标准微球的位置进行流式细胞分选，以获得特定粒径的sEV（图4）。通过NTA对分离质量进行验证，结果显示分选后sEV的粒径范围在50–200 nm之间（如图5所示）。进一步通过TEM观察到sEV的存...
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讨论
本方案概述了一种利用流式细胞分选仪分离和纯化粒径为50-200 nm的小细胞外囊泡（sEV）的优化方法，并通过纳米颗粒追踪分析（NTA）对该方法进行了验证。该方法解决了获取粒径均一、纯度高的sEV的技术瓶颈，避免了包裹在较大尺寸细胞外囊泡中的无关生物分子的干扰22。流式细胞术可实现快速、高通量分析，每秒可捕获100,000个颗粒，并每秒做出70,000次分选决策17，显著缩短了处理时间，同时反映了sEV颗粒的异质性。此外，基于流式细胞术的本方案可根据研究者对特定尺寸EV亚群的兴趣进行定制。在保持上述仪器参数（如气雾喷嘴、鞘液压力、样本流压力和触发阈值参数）不变的前提下，可通过设置不同的设门范围来识别和分离目标群体。
该方法的技术难点在于分离不同尺寸范围的群体，尤其是将其与背景噪声区分开来。我们确定了一组关键的分选参数。首先，喷嘴尺寸会影响分选速率。为了提高分选后获得的小细胞外囊泡（sEV）的浓度，本方法采用50 µm的喷嘴，并需要80 psi的鞘液压力以稳定侧流。鞘液压力越高，液滴频率增...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作得到了浙江中医药大学科研基金（2020ZG29）、浙江省基本公益研究计划项目（LGF19H150006，LTGY23B070001）、浙江省教育厅科研项目（Y202147028）以及浙江大学实验室部门实验技术项目（SJS201712，SYB202130）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 离心管 | Beckman Coulter | 344058 | |
| 细胞培养瓶 | Corning | 430641 | |
| Dulbecco’s 改良伊格尔培养基 | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| 胎牛血清 | SUER | SUER050QY | |
| 流式细胞分选仪 | Beckman Coulter | Moflo Astrios EQ | |
| 人胰腺癌细胞 PANC-1 | NA | NA | PANC-1 细胞由浙江大学生命科学学院杨卫军教授提供 |
| 激光粒度与Zeta电位分析仪 | Malvern | Zetasizer Nano ZS 90 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Gibco | C20012500BT | |
| 聚苯乙烯荧光微球 | Beckman Coulter | 6602336 | |
| 透射电子显微镜 | JEOL | JEM-1200EX | |
| 胰蛋白酶-EDTA 溶液 | Gibco | 1713949 | |
| 超彩虹荧光颗粒 | Beckman Coulter | B28479 | |
| 超速离心机 | Beckman Coulter | Optima-L80XP | |
| 超速离心机转子 | Beckman Coulter | SW32TI |
参考文献
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