焦磷酸测序分析可实现对异质性细胞或组织中线粒体DNA单核苷酸多态性的稳健且快速的基因分型。
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本文内容
摘要
摘要
线粒体基因组（mtDNA）的突变与母系遗传的遗传性疾病相关。然而，近年来人们对mtDNA多态性的兴趣日益增加，这得益于新近发展的通过mtDNA诱变构建模型的能力，以及对线粒体遗传异常与常见年龄相关疾病（如癌症、糖尿病和痴呆）之间关联的深入认识。焦磷酸测序是一种基于合成的测序技术，目前在线粒体研究领域被广泛用于常规基因分型实验。与大规模并行测序方法相比，该技术成本相对较低且易于实施，因此在线粒体遗传学领域具有重要价值，能够快速定量异质性，并具有更高的灵活性。尽管该方法具有实用性，但将其用于mtDNA基因分型时，必须遵循特定的指导原则，以避免来自生物学或技术层面的某些偏差。本实验方案详细阐述了设计和实施焦磷酸测序分析所必需的步骤与注意事项，适用于异质性水平的测定。
引言
线粒体基因组以小型（16.5 kb）环状分子（mtDNA）的形式存在，位于线粒体内层称为基质的最内层腔室中，编码线粒体呼吸链的13个亚基，以及其翻译所必需的tRNA和rRNA 原位 由线粒体核糖体1该基因组仅编码线粒体功能所需全部蛋白质的大约1%，其余蛋白质均由细胞核DNA（nDNA）编码。通常认为，线粒体起源于一种α-变形菌祖先与原始真核细胞之间的内共生融合事件。一旦这一假想的共生关系建立，线粒体的遗传信息便在数亿年间逐步转移至细胞核，这解释了与现代蓝细菌基因组相比，线粒体DNA（mtDNA）为何具有上述的高度紧凑性。2这种基因转移现象最有力的证据是核DNA中存在大量与线粒体DNA序列高度同源的长片段。这些核线粒体序列（NUMTs）在基因分型过程中常导致误判，因此在对线粒体DNA进行基因分型时，必须采取特定预防措施以避免受到核基因组的干扰。3 (图1A).
线粒体DNA（mtDNA）的另一个显著特征是其拷贝数因细胞类型而异，每个细胞中的拷贝数可从几十到数千不等4。由于这种多拷贝特性，单个细胞内mtDNA可容纳多种基因型，从而导致等位基因呈连续分布，这与核基因在考虑染色体纯合性或杂合性时所表现出的离散等位基因形....
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方案
已提供知情同意，用于使用人类3243A>G 细胞杂交线及永生化的 m.5024C>本研究中使用的T MEFs。由于患者细胞并非在剑桥大学采集，因此本案例无需伦理批准。然而，使用人类成纤维细胞可能需要伦理审批。在为焦磷酸测序准备样本DNA时，强烈建议遵循PCR设置的最佳实践。若未严格分离PCR前与PCR后操作区域，使用相同引物频繁扩增可能导致扩增子污染，并对后续基因分型引入偏差。本文所述流程使用了单一制造商的特定设备，详细信息见于 材料表PCR引物设计可根据需要手动完成；但建议使用现有的软件进行（参见 材料表).
1. 焦磷酸测序引物设计与检测方法选择
- 使用软件获取引物候选序列
- 获取待基因分型物种的线粒体DNA序列文件，并确定SNP的位置。确保所使用的参考序列对所研究的突变采用适当的碱基编号，以便于准确识别SNP的位置。
- 复制 SNP 位点上下游各 1,000 个碱基对，将截短后的序列粘贴至用于焦磷酸测序引物设计的软件中（参见 材料表).
- 在软件中，通过高亮标记多态性碱基，右键点击并选择，将待分析的SNP碱基设为焦磷酸测序实验的目标位点 设定目标区域.
- 按压 播放 <....
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结果
本部分展示了针对人类致病性线粒体DNA突变的焦磷酸测序检测方法的优化示例，以及对经线粒体锌指核酸酶（mtZFNs）处理的异质性（m.5024C>T）小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）进行基因分型所获得的测序数据。通过优化适用于人类细胞的检测方法并比较两种不同的检测方案，说明了如何选择最准确的检测方法；而在第二个示例中，对基因修饰的MEF细胞进行基因分型，则展示了在基因治疗干预后检测异质性水平变化的应用实例。
人类 m.3243A>G 突变
本示例说明了线粒体DNA常见致病性变异 m.3243A>G 的基因分型方法。常见的 m.3243A>G 突变是多种临床疾病的致病基础，尤其是线粒体脑肌病伴乳酸酸中毒和卒中样发作（MELAS）、母系遗传性耳聋和糖尿病（MIDD），以及进行性眼外肌麻痹（PEO）23。通过重新编程所掺入核苷酸的序列（如本方案第3.1.3节所述），该检测方法也可用于对较为罕见的 m.3243A>T 变异进行基因分型24<.......
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讨论
该实验方案成功的关键在于避免污染，尤其是在起始材料用量较少的情况下。建议在样品制备过程中尽可能使用紫外灯罩和带滤芯的移液器吸头，并将扩增前和扩增后操作区域分开。每次实验均应包含空白对照以及已知异质性水平的样品（如野生型DNA），作为基准用于检测技术或生物学偏差。
该检测方法存在一个值得注意的技术偏差，即掺入腺嘌呤类似物时会产生增强的发光信号。当在可变位置使用腺嘌呤时，通常会产生残余的荧光峰（例如，图2C）。因此，建议在可能的情况下，对相反链进行焦磷酸测序检测（此时将掺入胸腺嘧啶），以避免在可变位置掺入腺嘌呤类似物。然而，对于A>T或T>A突变，这一做法无法实现。尽管如此，如代表性结果所示，在检测设计中，引物的恰当选择可能更为重要。在代表性结果的第一部分中，针对m.3243A>G突变的检测2是基于可变位置的A/G比值进行测序，而检测1则测量T/C比值。尽管检测2易受腺嘌呤掺入偏差的影响，但与摩尔标准品比较后显示，其结果更为准确，这一点通过简单的线性回归分析得以证实（.......
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披露
M.M. 是 Pretzel Therapeutics, Inc. 的联合创始人、股东及科学咨询委员会成员。P.S.-P. 和 P.A.N. 为 Pretzel Therapeutics, Inc. 提供咨询服务。
致谢
我们感谢米兰基金会IRCCS Carlo Besta神经研究所的Silvia Marchet和Constanza Lamperti，她们制备并提供了本方案中用作示例的m.3243A"Carlo Besta"、Fondazione IRCCS、Milan）用于制备和提供本方案中作为示例使用的m.3243A>G细胞融合细胞。我们还要感谢剑桥大学MRC线粒体生物学研究组（MRC-MBU）成员在本研究过程中提供的有益讨论。本工作得到了英国医学研究理事会核心资助（MC_UU_00015/4和MC_UU_00028/3）的支持。P.A.N. 和 P.S.-P. 分别获得了Lily基金会和Champ基金会的额外资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| KOD Hot Start DNA聚合酶 | Sigma-Aldrich | 71086 | |
| PyroMark 引物设计 2.0 | QIAGEN | ||
| Pyromark Q48 吸光条 | QIAGEN | 974912 | |
| PyroMark Q48 Advanced CpG 试剂（4 x 48） | QIAGEN | 974022 | |
| Pyromark Q48 Autoprep | QIAGEN | 9002470 | |
| PyroMark Q48 羧酸酯酶试剂盒 | QIAGEN | 9024321 | |
| Pyromark Q48 磁盘 | QIAGEN | 974901 | |
| Pyromark Q48 磁珠 | QIAGEN | 974203 | |
| PyroMark Q48 软件许可（1） | QIAGEN | 9024325 |
参考文献
- Taanman, J. W. The mitochondrial genome: Structure, transcription, translation and replication. Biochimica et Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).
- Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature
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重印与许可
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