高通量心脏毒性筛选：利用成熟的人诱导多能干细胞来源心肌细胞单层

摘要

人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）为临床前心脏毒性筛选提供了一种替代动物实验的方案。hiPSC-CMs在临床前毒性筛选中广泛应用的一个局限性在于其未成熟、类似胎儿表型的特性。本文介绍了一套高效且快速促进hiPSC-CMs成熟的实验方案。

摘要

人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）可用于替代并减少临床前心脏毒性测试中对动物及动物细胞的依赖。在二维单层培养条件下，当接种于最佳细胞外基质（ECM）上时，hiPSC-CMs能够重现成人人心肌细胞的结构与功能。一种来源于人围产期干细胞的细胞外基质（促进成熟型细胞外基质，MECM）可在接种后7天内促进hiPSC-CMs在结构、功能及代谢状态上的成熟。

成熟的hiPSC-CM单层细胞对具有已知致心律失常和心脏毒性风险的临床相关药物也表现出预期的反应。在迄今为止之前，hiPSC-CM单层细胞的成熟问题一直是限制这些宝贵细胞在监管科学和安全性筛选中广泛应用的障碍。本文介绍了经过验证的方法，用于hiPSC-CM电生理和收缩功能的铺板、成熟以及高通量功能性表型分析。这些方法适用于 commercially available purified cardiomyocytes（商业化获得的纯化心肌细胞），以及利用高效、心室特异性的分化方案在实验室内部生成的干细胞来源心肌细胞。

采用电压敏感性染料（VSDs；发射波长：488 nm）、钙敏感性荧光探针（CSFs）或基因编码的钙离子传感器（GCaMP6）来测量高通量电生理功能。使用高通量光学标测装置对各项功能参数进行光学记录，并采用定制专用软件进行电生理数据分析。应用心肌细胞外基质模拟物（MECM）方案，结合正性肌力药物（异丙肾上腺素）和人 Ether-a-go-go 相关基因（hERG）通道特异性阻断剂，用于药物筛选。这些资源将有助于其他研究人员成功利用成熟的诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs），开展高通量、临床前的心脏毒性筛选、心脏药物疗效测试以及心血管科学研究。

引言

人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）已在国际范围内得到验证，可用于体外心脏毒性筛选¹。这些高度纯化的人诱导性多能干细胞心肌细胞可近乎无限地生成，并能进行冻存与复苏。复苏后重新接种时，细胞可恢复活性并开始规律性收缩，其节律类似于人类心脏的搏动^2,3。值得注意的是，单个hiPSC-CMs之间可相互耦合，形成功能性的合胞体，以类似单一组织的方式同步搏动。如今，hiPSCs可常规地从患者血液样本中获得，因此任何人都可通过体外hiPSC-CM心脏毒性筛选实验进行代表性建模^4,5。这为开展“在培养皿中进行临床试验"Clinical Trials in a Dish"”提供了可能，并可广泛涵盖不同人群的代表性样本⁶。

相较于现有的动物及动物细胞心脏毒性筛选方法，hiPSC-CMs 的一个关键优势在于其利用了完整的人类基因组，并提供了一个在遗传学上与人类心脏相似的 in vitro 系统。这一特性在药物基因组学和个体化医学领域尤其具有吸引力——利用 hiPSC-CMs 进行药物及其他疗法的开发，有望实现更准确、更精确且更安全的用药方案。事实上，二维（2D）hiPSC-CMs 单层细胞检测已被证实能够预测药物的心脏毒性，其通过一组临床常用药物进行验证，这些药物具有已知的致心律失常风险^1,7,8,9。尽管 hiPSC-CMs 具有巨大的潜力，并有望简化药物研发流程并降低成本，但目前对这些新型检测方法的应用仍存在迟疑态度^10,11,12。

迄今为止，hiPSC-CM 筛选检测在广泛采用和接受方面的一个主要限制是其不成熟、类似胎儿的形态和功能。hiPSC-CM 成熟度这一关键问题已在科学文献中被反复综述和讨论ad nauseum^13,14,15,16。同样，已有多种方法被用于促进 hiPSC-CM 的成熟，包括在二维单层培养中对细胞外基质（ECM）进行调控，以及构建三维工程化心肌组织（EHTs）^17,18。目前普遍认为，与基于二维单层的方法相比，使用三维 EHTs 能够实现更优越的成熟效果。然而，二维单层培养在细胞利用效率和铺板成功率方面更高；相比之下，三维 EHTs 需要更多的细胞，且常常需要引入其他细胞类型，这可能干扰实验结果。因此，本文重点介绍一种简单的方法，用于促进以二维单层形式培养的、电学和力学耦合的心肌细胞的成熟。

利用细胞外基质（ECM）可在二维单层培养中实现hiPSC-CM的高级成熟。通过使用涂有Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤细胞分泌的基底膜基质（小鼠ECM）的柔软、可变形聚二甲基硅氧烷盖玻片，可促进hiPSC-CM的二维单层培养成熟。2016年的研究报道显示，在这种柔软ECM条件下培养的hiPSC-CM在功能上趋于成熟，其动作电位传导速度接近成人心脏水平（约50 cm/s）¹⁸。此外，这些成熟的hiPSC-CM表现出多种类似成人心肌细胞的电生理特征，包括超极化的静息膜电位以及K_ir2.1的表达。最近的研究进一步发现了一种来源于人类围产期干细胞的ECM涂层，可促进二维hiPSC-CM的结构成熟¹⁹。本文介绍了易于操作的方法，用于实现二维hiPSC-CM单层的结构成熟，以适用于高通量电生理筛选。此外，我们还验证了一种光学标测仪器，可用于自动采集和分析二维hiPSC-CM单层的电生理功能，该方法结合使用电压敏感性染料（VSDs）以及钙离子敏感探针和蛋白。

方案

本方案中使用的人诱导多能干细胞（hiPSC）已获得密歇根大学HPSCRO委员会（人类多能干细胞监管委员会）的批准。有关材料和设备的清单，请参见材料表。有关培养基及其成分的信息，请参见表1。

1. 解冻并接种 commercially available 冻存 hiPSC-CMs，使其在可诱导成熟的细胞外基质（MECM）上进行成熟

1. 将所有试剂恢复至室温，并在心肌细胞接种前1小时，用含钙和镁的Hank's平衡盐溶液（HBSS）或磷酸盐缓冲液（PBS）对MECM板进行再水化（每孔96孔板加入200 µL缓冲液）。
2. 在心肌细胞接种前1小时，用含钙和镁的HBSS或PBS洗涤MECM板2次（每孔96孔板加入200 µL缓冲液），并保持孔内湿润。
3. 准备一个37 °C水浴。
4. 从液氮罐中取出心肌细胞冻存管，转移至干冰上，并略微打开管盖以释放压力。
   注意：释放冻存管内的压力极其重要！如果管内压力过高，可能导致管体爆炸。
5. 重新密封管盖，将其放入水浴中解冻4分钟。
   注意：应确保完全解冻，以避免因部分解冻造成细胞损伤。
6. 细胞解冻后，用70%乙醇喷洒管体表面后再打开。使用1 mL移液器将细胞转移至15 mL锥形管中。缓慢滴加8 mL接种培养基，每加入1 mL后轻轻震荡锥形管，使细胞逐步适应渗透压变化。
   1. 使用1 mL玻璃移液器，用1 mL接种培养基冲洗冻存管，然后将冲洗液缓慢滴加至15 mL锥形管中。
7. 以约300 × g离心5分钟。吸除上清液，将沉淀重悬于1 mL接种培养基中。取少量细胞悬液，使用血细胞计数板进行活细胞计数。根据计数结果补充接种培养基，使细胞浓度达到7.5 × 10⁵ cells/mL。
   注意：制备96孔板约需10 mL细胞悬液。
8. 使用多通道移液器，将100 µL细胞悬液加入MECM包被的96孔板每孔中。
   注意：接种过程中应避免细胞沉淀，确保各孔细胞密度均匀。
9. 将细胞置于37 °C、5% CO₂条件下培养2天后，更换为维持培养基（每孔200 µL）。解冻后第5天更换一次维持培养基。如需延长培养，每隔一天更换一次培养基。电生理（EP）检测可在第7天或之后进行，具体方法见先前文献^8,9。

2. hiPSC 心脏定向分化及 hiPSC-CM 纯化

1. 将市售的1×乙二胺四乙酸（EDTA）溶液、不含钙和镁的HBSS（HBSS--）以及包被有Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤细胞分泌的可溶性基底膜基质（小鼠ECM）的6孔板置于室温预热。
2. 通过相差显微镜标记已分化的菌落并进行吸除或消融。每孔加入1 mL HBSS--进行洗涤。对含有菌落的孔进行两次洗涤 >10个分化区域。
3. 吸弃 HBSS，每孔加入 1 mL EDTA 溶液。将培养板在 37 °C 下孵育最多 5 分钟。3 分钟后检查培养板，观察是否存在半透明白色、可见的克隆。
4. 吸除EDTA溶液，向单个孔中加入1 mL。用10 mL玻璃移液管反复吹打2 mL hiPSC培养基，使细胞悬浮，彻底脱离孔壁，将细胞悬液转移至收集管中。对后续各孔重复吸除和吹打操作。
   注意：使用玻璃移液管的尖端松动难以挑起的菌落。
5. 计数干细胞，并调整体积以接种 8.0 × 10⁵ 细胞/孔。使用hiPSC培养基（2 mL/孔）培养细胞，直至干细胞融合度达到90%（此后将此时间点称为D）₀).
6. 准备2 mL添加了4 µM CHIR99021的基础分化培养基。
7. 在 D₀, 用 1 mL HBSS 洗涤干细胞 6 孔板的每个孔。将 HBSS 替换为添加了 4 µM CHIR99021 的基础分化培养基。
8. 在 D₁，不做任何操作。
9. 在 D₂，准备添加了4 µM IWP4的基础分化培养基。
10. 每孔加入 2 mL 含 IWP4 的基础分化培养基以更换原有培养基。
11. 在 D₃，对心室特异性分化不做任何处理。对于心房特异性分化，吸除培养基，每孔加入2 mL基础培养基，并补充4 µM IWP4和1 µM视黄酸（RA）溶液。
12. 在 D₄吸弃培养基，每孔加入2 mL基础培养基用于心室样分化；对于心房样分化，吸弃培养基，每孔加入2 mL添加1 µM RA溶液的基础培养基。
13. 第D天₅，不做任何操作。
14. 在 D₆，吸去培养基，每孔加入2 mL基础培养基（适用于心房和心室分化）。
15. 在 D₇，不做任何操作。
16. 在 D₈吸出培养基，加入2 mL心肌细胞维持培养基。每隔一天更换一次培养基，直至细胞分离，或按照慢性药物暴露方案进行。

3. hiPSC-CM 纯化 通过 磁珠激活细胞分选（MACS）

1. 吸弃细胞培养基，每孔加入 1 mL HBSS-- 洗涤一次。每孔加入 1 mL 0.25% 胰蛋白酶/EDTA 溶液，于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 10 分钟以消化细胞。每孔加入 2 mL 铺板培养基重悬并分散细胞，以中和胰蛋白酶/EDTA 活性。
2. 将六孔中的细胞收集至一个 50 mL 圆底离心管中，使用 70 µm 细胞筛过滤。用 3 mL 铺板培养基冲洗细胞筛。计数细胞。
3. 以约 300 × g 离心 5 分钟。吸弃上清液，用 20 mL 冰冷的 MACS 分离缓冲液洗涤细胞。再次以约 300 × g 离心 5 分钟。
4. 每 5 × 10⁶ 个细胞用 80 µL 冰冷的 MACS 分离缓冲液重悬沉淀。每 5 × 10⁶ 个细胞加入 20 µL 冰冷的非心肌细胞耗竭试剂盒（人源）。轻柔混匀细胞悬液，冰上孵育 10 分钟。
5. 每 5 × 10⁶ 个细胞加入 4 mL 冰冷的 MACS 分离缓冲液洗涤样品。以约 300 × g 离心 5 分钟，吸弃上清液。
6. 每 5 × 10⁶ 个细胞用 80 µL 冰冷的 MACS 分离缓冲液重悬沉淀。每 5 × 10⁶ 个细胞加入 20 µL 冰冷的抗生物素微珠。轻柔混匀细胞悬液，冰上孵育 10 分钟。
7. 在样品孵育期间，将阳性耗竭柱（配备 30 µm 预分离滤器）置于 MACS 分离器上，并在柱下方放置已标记的 15 mL 收集管。每 5 × 10⁶ 个细胞需使用一根分离柱。
8. 每根柱用 3 mL 冰冷的 MACS 分离缓冲液预平衡。将抗体处理后的细胞悬液与每 5 × 10⁶ 个细胞 2 mL MACS 分离缓冲液混合后，加至柱中。
   注意：此步骤切勿离心！离心会显著降低心肌细胞得率。
9. 向每根柱中加入 2 mL MACS 分离缓冲液，收集流出液，直至收集到 12 mL 流出液形式的心肌细胞悬液。
   注意：切勿让柱子完全干燥。
10. 将心肌细胞以约 300 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，用 1 mL 铺板培养基重悬心肌细胞。
11. 计数细胞以确定浓度，调整体积至所需接种密度后进行铺板。将纯化后的心肌细胞接种于 MECM 96 孔板中，操作步骤如前述 1.9–1.11 所述（每孔 7.5 × 10⁵ 个细胞）。

4. 使用电压敏感性染料（VSDs）和钙敏感性荧光探针（CSFs）进行光学标测

1. 通过在含钙和镁的HBSS中加入每毫升1 µL的VSD染料和每毫升10 µL的负载佐剂，配制适量的VSD溶液。
   注意：通常，一块96孔板需要10 mL的VSD溶液。
2. 或者，配制含有5 µM CSF的含钙和镁的HBSS。吸除心肌细胞维持培养基，并向96孔板的每孔中加入100 µL的VSD溶液或CSF。将细胞置于细胞培养箱中孵育30分钟。
3. 去除染料，更换为检测培养基或HBSS。在37 °C条件下平衡，以便使用高通量光学标测设备获取基线数据的光学标测结果。
4. 对细胞进行药物处理以进行急性暴露测试，或对长期暴露于目标药物的细胞进行标测。
5. 在96孔板中进行心脏毒性测试时，使用一种化合物的四个剂量，每个剂量至少设置六个复孔。剂量范围应涵盖低于和高于有效治疗血浆浓度的水平，并包括临床有效治疗血浆浓度的剂量。
6. 将药物用二甲基亚砜稀释，作为储备液储存于-20 °C，然后用HBSS稀释至所需浓度。
7. 在施加药物前，按照第5节所述进行基础电生理学测量。施加药物后，对于慢性研究，至少30分钟后开始电生理记录。有关光学标测数据的采集与分析步骤，请参见后续章节。

5. 使用基因编码的钙指示剂（GECI）进行光学标测

1. 按照上述方法，使用MECM包被的96孔板接种市售或经MACS纯化的hiPSC-CMs，以获得成熟hiPSC-CMs。为形成融合单层，每孔接种7.5 × 10⁴个CMs，使用接种培养基。
2. 在接种培养基中培养48小时后，更换为心肌细胞维持培养基。
3. 解冻并重新接种后的第4天，加入表达GCaMP6m的重组腺病毒（AdGCaMP6m），感染复数（MOI）= 5。使用CM检测培养基加入病毒。
   注意：本实验中使用的GCaMP6m在来自商业供应商的iCell²心肌细胞中进行。
4. 第5天，移除含adGCaMP6m的培养基，并更换为新鲜RPMI+B27（心肌细胞维持培养基）。
5. 第7天，使用显微镜或光学标测成像系统观察CMs，以可视化自发性收缩及相应的钙瞬变。
6. 第7天或之后，如需进行药物筛选，可直接将表达GCaMP6m的成熟hiPSC-CM单层96孔板从培养箱转移至光学标测成像系统，进行基线数据采集。
7. 完成电生理数据采集后，将CMs培养板返回组织培养箱，用于后续时间点的测量。
8. 完成基线记录后，进行药物处理，每种药物至少设置四个剂量，每个剂量至少六个复孔。药物加入细胞后，至少平衡30分钟再开始数据采集。在数据采集前及过程中，将孔内温度升至约37 °C。
9. 完成整块板的基线记录后，向所有孔中加入异丙肾上腺素（500 nM），以获得显著的药物反应数据。按照第5节所述方法，量化异丙肾上腺素对单层细胞搏动频率、收缩幅度（钙瞬变幅度）和钙瞬变持续时间的影响（见图6）。

6. 光学图谱数据的采集与分析

1. 确保光学作图仪的相机、透射光源和加热板均已开启。
2. 打开采集软件并确定文件保存位置。
3. 打开前面的抽屉，将培养皿放置在培养皿加热器上。
4. 通过单击获取暗场图像 暗场 按钮。
5. 选择 持续时间 （10-30 秒）和 采集帧率 （例如，100 fps；若需更高时间分辨率则设为250 fps），然后点击 开始采集.
6. 打开分析软件，并在其中 导入/筛选 标签，选择其中一项 浏览 单个文件或 平铺多个窗口 重建一块培养板。
7. 选择 参数模式 (APD 或 CaTD），输入 每像素距离，并使用 Well Wizard 以确定图像中孔的位置。点击 流程保存 切换到下一个标签页。
8. 打开 感兴趣区域 （感兴趣区域）选项卡并选择绘制感兴趣区域 手动, 自动地，或 完全不使用感兴趣区域，随后将对整个孔进行分析。选择好感兴趣区域（ROIs）后，单击 流程/保存 按钮以进入下一步。检查 隐藏孔板 和 仅显示已筛选结果 用于可视化感兴趣区域的方框。
9. 打开 分析 标签，并在屏幕右上角依次选择每个 良好 或 感兴趣区域 以确认 自动节拍检测的准确性. 添加 或 去除节拍 从轨迹中按压 添加节拍/保存节拍，或通过选择一个 单次搏动 并按压 删除 在键盘上。
10. 可选地，使用 平均热图 利用该功能可为选定参数创建平板的热图。
11. 点击 时空图 按钮在 分析 切换以查看每个孔或感兴趣区域（ROI）的数据。在确认搏动检测准确无误后，继续进行下一步操作。 导出 标签并选择 文件格式. 按压 导出 并创建一个用于导出数据的文件夹。接着打开数据文件并运行选定的统计分析程序。
    注意：建议使用 .xlxs 文件格式，因为所有参数将被导出至单个文件中；其他格式（如 .csv 或 .tsv）会为每个参数生成单独的文件。

结果

通过相差显微镜和免疫荧光共聚焦成像表征 hiPSC-CM 的成熟过程
使用 MECM 包被的 96 孔板对市售 hiPSC-CM 进行细胞外基质（ECM）介导的成熟时间线如图 1A所示。这些数据采用市售心肌细胞获得，细胞以冷冻安瓿形式运达实验室。每支安瓿含有>5 × 10⁶个活心肌细胞。细胞纯度约为 98%，并经过严格的质量控制检测（每支安瓿均附有分析证书）。大量心肌细胞的存在使得可将同一批次细胞解冻后接种于不同 ECM 组合的培养板上。在图 1中，hiPSC-CM 分别接种于小鼠 ECM 或 MECM 包被的培养板上。接种于 MECM 上的 hiPSC-CM 发生成熟，并在结构上与同一批次接种于小鼠 ECM 上的 hiPSC-CM 明显不同。具体而言，成熟细胞呈现杆状形态，而未成熟细胞则保持圆形。这一差异可通过相差显微镜观察，并在对心肌肌原纤维染色后进一步确认（图 1B；肌钙蛋白 I [T...

讨论

有多种不同的方法 体外 使用hiPSC-CMs进行心脏毒性筛选。近期 "最佳实践" 关于hiPSC-CMs应用的研究论文展示了多种 体外 检测方法、其主要读数，以及重要的是，每种检测方法在量化人类心脏电生理功能方面的精细程度²⁰除了使用穿膜电极外，最直接评估人类心脏电生理功能的方法是通过电压敏感染料（VSD）检测。VSD检测的读数能够直接可视化并量化关键的电生理参数，包括动作电位时程、动作电位传导速度、动作电位上升速率、动作电位三角化、搏动频率、搏动节律规律性以及动作电位时程的空间异质性。类似地，钙离子敏感探针可提供关于hiPSC-CM单层细胞节律、频率及事件持续时间的信息。利用荧光探针检测hiPSC-CM钙瞬变，还可反映每次收缩的收缩力及收缩强度。本文提供了在高通量电压敏感染料检测和钙瞬变测量实验中使用成熟hiPSC-CM（96孔板）的方法。此外，除光学标测方法外，还介绍了用于高通量电生理数据分析的软件。

本文所述方法对心脏毒性筛选和监管科学领域具有重要意义。我们在此介绍了在高通量...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25% 胰蛋白酶 EDTA	Gibco	25200-056
0.5 mg/mL BSA (7.5 µmol/L)	Millipore Sigma	A3294
2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L)	Millipore Sigma	H4034
AdGCaMP6m	Vector biolabs	1909
人血清白蛋白	Sigma	A9731-1G
α-肌动蛋白抗体	ThermoFisher	MA1-22863
B27	Gibco	17504-044
Blebbistatin	Sigma	B0560
CalBryte 520AM	AAT Bioquest	20650
CELLvo MatrixPlus 96孔板	StemBiosys	N/A	https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus
CHIR99021	LC Laboratories	c-6556
透明培养基（Fluorobrite）	ThermoFisher	A1896701	用于腺病毒转导
DAPI	ThermoFisher	62248
DMEM:F12	Gibco	11330-032
FBS（胎牛血清）	Sigma	F4135-500ML
FluoVolt	ThermoFisher	F10488
HBSS	Gibco	14025-092
iCell CM 维持培养基	FUJIFILM/Cellular Dynamics	M1003
iCell2 CMs	FUJIFILM	1434
Incucyte Zoom	Sartorius
iPS DF19-9-11T.H	WiCell
异丙肾上腺素	MilliporeSigma	CAS-51-30-9
IWP4	Tocris	5214
L-抗坏血酸-2-磷酸三镁盐水合物	Sigma	A8960-5g
L-谷氨酰胺	Gibco	A2916801
LS 柱	Miltenyii Biotec	130-042-401
MACS 缓冲液（autoMACS 运行缓冲液）	Miltenyii Biotec	130-091-221
Matrigel	Corning	354234
MitoTracker Red	ThermoFisher	M7512
Nautilus HTS 光学图谱系统	CuriBio		https://www.curibio.com/products-overview
Nikon A1R 共聚焦显微镜	Nikon
非必需氨基酸	Gibco	11140-050
预分离滤器	Miltenyii Biotec	130-041-407
人源多能干细胞衍生心肌细胞分离试剂盒	Miltenyii Biotec	130-110-188
Pulse	CuriBio		https://www.curibio.com/products-overview
Quadro MACS 分离器（磁铁）	Miltenyii Biotec	130-091-051
视黄酸	Sigma	R2625
RPMI 1640	Gibco	11875-093
RPMI 1640（含 HEPES，含 L-谷氨酰胺）	Gibco	22400-089
StemMACS iPS-Brew XF	Miltenyii Biotec	130-107-086
肌钙蛋白 I 抗体（泛肌钙蛋白 I）	Millipore Sigma	MAB1691
Versene（乙二胺四乙酸 - EDTA 溶液）	Gibco	15040-066
Y-27632 二盐酸盐	Tocris	1254
β-巯基乙醇	Gibco	21985023