人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）为临床前心脏毒性筛选提供了一种替代动物实验的方案。hiPSC-CMs在临床前毒性筛选中广泛应用的一个局限性在于其未成熟、类似胎儿表型的特性。本文介绍了一套高效且快速促进hiPSC-CMs成熟的实验方案。
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摘要
摘要
人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）可用于替代并减少临床前心脏毒性测试中对动物及动物细胞的依赖。在二维单层培养条件下，当接种于最佳细胞外基质（ECM）上时，hiPSC-CMs能够重现成人人心肌细胞的结构与功能。一种来源于人围产期干细胞的细胞外基质（促进成熟型细胞外基质，MECM）可在接种后7天内促进hiPSC-CMs在结构、功能及代谢状态上的成熟。
成熟的hiPSC-CM单层细胞对具有已知致心律失常和心脏毒性风险的临床相关药物也表现出预期的反应。在迄今为止之前，hiPSC-CM单层细胞的成熟问题一直是限制这些宝贵细胞在监管科学和安全性筛选中广泛应用的障碍。本文介绍了经过验证的方法，用于hiPSC-CM电生理和收缩功能的铺板、成熟以及高通量功能性表型分析。这些方法适用于 commercially available purified cardiomyocytes（商业化获得的纯化心肌细胞），以及利用高效、心室特异性的分化方案在实验室内部生成的干细胞来源心肌细胞。
采用电压敏感性染料（VSDs；发射波长：488 nm）、钙敏感性荧光探针（CSFs）或基因编码的钙离子传感器（GCaMP6）来测量高通量电生理功能。使用高通量光学标测装置对各项功能参数进行光学记录，并采用定制专用软件进行电生理数据分析。应用心肌细胞外基质模拟物（MECM）方案，结合正性肌力药物（异丙肾上腺素）和人 Ether-a-go-go 相关基因（hERG）通道特异性阻断剂，用于药物筛选。这些资源将有助于其他研究人员成功利用成熟的诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs），开展高通量、临床前的心脏毒性筛选、心脏药物疗效测试以及心血管科学研究。
引言
人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）已在国际范围内得到验证，可用于体外心脏毒性筛选1。这些高度纯化的人诱导性多能干细胞心肌细胞可近乎无限地生成，并能进行冻存与复苏。复苏后重新接种时，细胞可恢复活性并开始规律性收缩，其节律类似于人类心脏的搏动2,3。值得注意的是，单个hiPSC-CMs之间可相互耦合，形成功能性的合胞体，以类似单一组织的方式同步搏动。如今，hiPSCs可常规地从患者血液样本中获得，因此任何人都可通过体外hiPSC-CM心脏毒性筛选实验进行代表性建模4,5。这为开展“在培养皿中进行临床试验"Clinical Trials in a Dish"”提供了可能，并可广泛涵盖不同人群的代表性样本6。
相较于现有的动物及动物细胞心脏毒性筛选方法，hiPSC-CMs 的一个关键优势在于其利用了完整的人类基因组，并提供了一个在遗传学上与人类心脏相似的 in vitro 系统。这一特性在药物基因组学和个体化医学领域尤其具有吸引力——利用 hiPSC-CMs 进行药物及....
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方案
本方案中使用的人诱导多能干细胞（hiPSC）已获得密歇根大学HPSCRO委员会（人类多能干细胞监管委员会）的批准。有关材料和设备的清单，请参见材料表。有关培养基及其成分的信息，请参见表1。
1. 解冻并接种 commercially available 冻存 hiPSC-CMs，使其在可诱导成熟的细胞外基质（MECM）上进行成熟
- 将所有试剂恢复至室温，并在心肌细胞接种前1小时，用含钙和镁的Hank's平衡盐溶液（HBSS）或磷酸盐缓冲液（PBS）对MECM板进行再水化（每孔96孔板加入200 µL缓冲液）。
- 在心肌细胞接种前1小时，用含钙和镁的HBSS或PBS洗涤MECM板2次（每孔96孔板加入200 µL缓冲液），并保持孔内湿润。
- 准备一个37 °C水浴。
- 从液氮罐中取出心肌细胞冻存管，转移至干冰上，并略微打开管盖以释放压力。
注意：释放冻存管内的压力极其重要！如果管内压力过高，可能导致管体爆炸。 - 重新密封管盖，将其放入水浴中解冻4分钟。
注意：应确保完全解冻，以避免因部分解冻造成细胞损伤。 - 细胞解冻后，用70%乙醇喷洒管体表面后再打开。使用1 mL移液器将细胞转移至15 mL锥形管中。缓慢....
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结果
通过相差显微镜和免疫荧光共聚焦成像表征hiPSC-CM的成熟过程
使用MECM包被的96孔板进行商品化hiPSC-CMs经ECM介导成熟的实验时间线如图所示 图1A. 这些数据使用商业可获取的心肌细胞收集，这些细胞以冷冻保存的小管形式运抵实验室。每管含有 >5 × 106 存活的心肌细胞。细胞纯度约为98%，并经过严格的质量控制检测（每管细胞均附有分析证书）。大量心肌细胞的存在使得可使用同一批次细胞在解冻后接种于不同的细胞外基质组合上。在 图1，将hiPSC-CMs接种于小鼠ECM或MECM包被的培养板上。接种在MECM上的hiPSC-CMs相较于同一批次接种于小鼠ECM上的细胞更为成熟，且在结构上具有明显差异。具体而言，成熟细胞呈杆状，而未成熟细胞则保持圆形。这一差异可通过相差显微成像以及对心肌肌原纤维染色后观察到图1B；肌钙蛋白 I [TnI]，红色）。hiPSC-CMs 结构成熟度的更.......
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讨论
有多种不同的方法 体外 使用hiPSC-CMs进行心脏毒性筛选。近期 "最佳实践" 关于hiPSC-CMs应用的研究论文展示了多种 体外 检测方法、其主要读数，以及重要的是，每种检测方法在量化人类心脏电生理功能方面的精细程度20除了使用穿膜电极外，最直接评估人类心脏电生理功能的方法是通过电压敏感染料（VSD）检测。VSD检测的读数能够直接可视化并量化关键的电生理参数，包括动作电位时程、动作电位传导速度、动作电位上升速率、动作电位三角化、搏动频率、搏动节律规律性以及动作电位时程的空间异质性。类似地，钙离子敏感探针可提供关于hiPSC-CM单层细胞节律、频率及事件持续时间的信息。利用荧光探针检测hiPSC-CM钙瞬变，还可反映每次收缩的收缩力及收缩强度。本文提供了在高通量电压敏感染料检测和钙瞬变测量实验中使用成熟hiPSC-CM（96孔板）的方法。此外，除光学标测方法外，还介绍了用于高通量电生理数据分析的软件。
本文所述方法对心脏毒性筛选和监管科学领域具有重要意义。我们在此介绍了在高通量.......
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披露
TJH 是 StemBioSys, Inc. 的顾问和科学顾问。TB 是 StemBioSys, Inc. 的员工。AMR 和 JC 曾任 StemBioSys, Inc. 的顾问。TJH、TB、AMR 和 JC 均为 StemBioSys, Inc. 的股东。
致谢
本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）基金项目HL148068-04和R44ES027703-02（TJH）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.25% 胰蛋白酶 EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 0.5 mg/mL BSA (7.5 µmol/L) | Millipore Sigma | A3294 | |
| 2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L) | Millipore Sigma | H4034 | |
| AdGCaMP6m | Vector biolabs | 1909 | |
| 人血清白蛋白 | Sigma | A9731-1G | |
| α-肌动蛋白抗体 | ThermoFisher | MA1-22863 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Blebbistatin | Sigma | B0560 | |
| CalBryte 520AM | AAT Bioquest | 20650 | |
| CELLvo MatrixPlus 96孔板 | StemBiosys | N/A | https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus |
| CHIR99021 | LC Laboratories | c-6556 | |
| 透明培养基（Fluorobrite） | ThermoFisher | A1896701 | 用于腺病毒转导 |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| DMEM:F12 | Gibco | 11330-032 | |
| FBS（胎牛血清） | Sigma | F4135-500ML | |
| FluoVolt | ThermoFisher | F10488 | |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| iCell CM 维持培养基 | FUJIFILM/Cellular Dynamics | M1003 | |
| iCell2 CMs | FUJIFILM | 1434 | |
| Incucyte Zoom | Sartorius | ||
| iPS DF19-9-11T.H | WiCell | ||
| 异丙肾上腺素 | MilliporeSigma | CAS-51-30-9 | |
| IWP4 | Tocris | 5214 | |
| L-抗坏血酸-2-磷酸三镁盐水合物 | Sigma | A8960-5g | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | A2916801 | |
| LS 柱 | Miltenyii Biotec | 130-042-401 | |
| MACS 缓冲液（autoMACS 运行缓冲液） | Miltenyii Biotec | 130-091-221 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| MitoTracker Red | ThermoFisher | M7512 | |
| Nautilus HTS 光学图谱系统 | CuriBio | https://www.curibio.com/products-overview | |
| Nikon A1R 共聚焦显微镜 | Nikon | ||
| 非必需氨基酸 | Gibco | 11140-050 | |
| 预分离滤器 | Miltenyii Biotec | 130-041-407 | |
| 人源多能干细胞衍生心肌细胞分离试剂盒 | Miltenyii Biotec | 130-110-188 | |
| Pulse | CuriBio | https://www.curibio.com/products-overview | |
| Quadro MACS 分离器（磁铁） | Miltenyii Biotec | 130-091-051 | |
| 视黄酸 | Sigma | R2625 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| RPMI 1640（含 HEPES，含 L-谷氨酰胺） | Gibco | 22400-089 | |
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyii Biotec | 130-107-086 | |
| 肌钙蛋白 I 抗体（泛肌钙蛋白 I） | Millipore Sigma | MAB1691 | |
| Versene（乙二胺四乙酸 - EDTA 溶液） | Gibco | 15040-066 | |
| Y-27632 二盐酸盐 | Tocris | 1254 | |
| β-巯基乙醇 | Gibco | 21985023 |
参考文献
- Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
- Ma, J., et al.
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