基于原子力显微镜的人关节软骨外植体微压痕研究的实际问题

Summary

我们提出了一种循序渐进的方法来识别和解决与原子力显微镜微压痕相关的最常见问题。我们举例说明了以不同程度的骨关节炎驱动的变性为特征的天然人类关节软骨外植体的新问题。

Abstract

毫无疑问，原子力显微镜（AFM）是目前评估生物领域微观甚至纳米线索的最强大和最有用的技术之一。然而，与任何其他微观方法一样，可能会出现方法学挑战。特别是，样品的特性、样品制备、仪器类型和压痕探头都可能导致不必要的伪影。在该协议中，我们举例说明了健康和骨关节炎关节软骨外植体的这些新问题。为此，我们首先通过分步方法展示如何 通过 整个组织外植体的大型 2D 镶嵌荧光成像，根据变性的不同阶段生成、分级和视觉分类离 体 关节软骨盘。 离体 模型的主要优势在于它由老化的、天然的、人类软骨组成，可以研究骨关节炎从早发到进展的相关变化。此外，还介绍了组织制备中的常见陷阱，以及实际的AFM程序以及随后的数据分析。我们展示了样品制备和处理、高级退化引起的形貌样品特性以及样品-尖端相互作用等基本但关键的步骤如何影响数据采集。我们还仔细研究了AFM中最常见的问题，并在可能的情况下描述了如何克服这些问题。了解这些局限性对于正确的数据采集、解释以及最终将研究结果嵌入到广泛的科学背景中至关重要。

Introduction

由于电子设备和系统的尺寸不断缩小，微纳基技术和装备的快速发展势头强劲。其中一种设备是原子力显微镜 （AFM），它可以扫描生物表面并在纳米和微米尺度上检索地形或生物力学信息^1,2。在其广泛的功能中，该工具可以作为微压头和纳米压头操作，以获取有关各种生物系统的机械性能的信息3,4,5,6。数据是通过机械探针与表面的物理接触来收集的，机械探针的尖端可以小至约 1 nm⁷。然后根据悬臂尖端的压痕深度和施加在样品上的力⁸ 显示样品的变形。

骨关节炎（OA）是一种长期退行性慢性疾病，其特征是关节和周围组织中的关节软骨恶化，这可能导致骨表面完全暴露。OA的负担是沉重的;目前，65岁及以上的女性中有一半和男性中有三分之一患有OA⁹。创伤、肥胖和由此导致的关节¹⁰ 生物力学改变决定了关节软骨退化，这被视为常见的最终结果。Ganz 等人的....

Protocol

使用从德国图宾根大学医院接受全膝关节置换术的患者身上采集的股骨髁。本研究仅包括来自退行性和创伤后关节病变患者的关节软骨样本。在研究开始之前，已获得部门、机构和地方伦理委员会的批准（项目编号:674/2016BO2）。在参与之前，已收到所有患者的书面知情同意书。

注:图1中给出了按时间顺序排列的实验步骤的流程 图。

1. 软骨盘的组织处理和生成

1. 组织准备
   1. 术后切除后，将软骨样本放入装有补充有 5% （v/v） 青霉素 - 链霉素的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 的容器中。确保样品完全浸没在培养基中。手术切除和软骨进一步处理之间的持续时间不应超过24小时。确保在整个处理过程中，样品完全浸没在介质中，以避免样品干燥。
   2. 用手术刀将软骨从骨头上切开。
2. 软骨椎间盘生成
   1. 使用活检打孔器生成直径为 4 毫米的软骨盘。
      注意:选择和切除软骨层厚度超过 1 毫米的髁突区域很重要。这可能是有问题的，尤其是在承重区周围，软骨层通常会因磨损过程或退化而失去厚度。
   2. 将先前生成的 4 毫米软骨盘放在定制的切割装置上，并用刮刀固定并保持软骨盘稳定。将软骨盘放在切割装置上时，必须小心。放置样品，....

Results

使用自制的切割装置，我们能够从新鲜的人髁突中取出并生成小（4 mm x 1 mm）软骨盘，其中包含单细胞空间模式³⁰，包括单串（SS，图2A），双串（DS），小簇（SC），大簇（BC;图2A）和漫反射（图2B）。具有代表性的软骨外植体如图3A所示。使用自上而下的荧光成像选择仅显示一种类型图案的圆盘（图2）。软骨表面椎间盘的形貌变化通过软骨盘产生的60μm厚切片的侧视图成像进一步说明（图2C）。在外植的骨关节炎软骨盘表面，存在浅表纤维颤动和基质裂隙（图3B，C）。这在代表晚期OA进展的椎间盘中尤为明显，以BC的存在为代表（

Discussion

作为一种进行性和多因素疾病，OA会引发关节软骨的结构和功能变化。在整个 OA 过程中，机械特征的损伤伴随着关节软骨表面的结构和生化变化^27,31。OA中最早发生的病理事件是蛋白多糖耗竭伴胶原网络破坏^32,33,34。这种早期的细微表面变化很难通过批量测试来精确定位和识别，因为机械行为是在整个组织深度上平均的。此外，一个尚未解决的问题是器官和组织水平的功能变化是否与微米或纳米尺度的结构和功能变化有关。为此，AFM 被认为是最灵敏的方法之一，能够检测 OA 发病时发生的最早生物力学变化⁷。它允许在天然样品中进行微米和纳米尺度的刚度测量，提供有关关节软骨机械性能的信息^35,36。.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
两性霉素 B	默克 KGaA，德国达姆施塔特	1397-89-3
原子力显微镜 （AFM） 头	CellHesion 200， Bruker Nano GmbH， 柏林， 德国	JPK00518
生物相容性样品胶	Bruker Nano GmbH， Berlin， Germany	H000033
Calcein AM	Cayman， Ann Arbor， Michigan， USA	14948	细胞膜渗透染色剂，用于软骨盘分选 - 顶视图成像
悬臂	Bruker Nano GmbH，德国柏林	SAA-SPH-5UM	频率标称值：30KHz，k：0.2N/m，长度标称：115μm，宽度 nom：40μm， 几何形状：矩形，圆柱形尖端，带有 5&μ;m 端桡
骨软骨研磨装置	自制	n/a	切割塑料设备，包含集成在 AFM 中的 4mmx1mm
CDD 相机	The Imaging Source Europe GmbH，德国不来梅	DFK 31BF03
CDD 相机集成在荧光显微镜中	Leica Biosystems，韦茨拉尔，德国	DFC3000G
Cryotome	Leica Biosystems，韦茨拉尔，德国	CM3050S
AFM	Bruker Nano GmbH	n/a	版本 5.0.86 的数据处理软件可以从以下网站免费下载 https://customers.jpk.com
Dulbecco 改良的 Eagle 培养基 （DMEM）	Gibco，Life Technologies，德国达姆施塔特	41966052
荧光显微镜 （Leica DMi8）	Leica Biosystems，韦茨拉尔，德国	11889113
玻璃块悬臂支架	Bruker Nano GmbH，德国柏林	SP-90-05	带斜面的超长玻璃块，专为 JPK PetriDishHeaterTM （Bruker） 设计。
倒置相差显微镜（集成在 AFM 中）	AxioObserver D1，德国耶拿 Carl Zeiss 显微镜	L201306_03
不含 L-谷氨酰胺的 Leibovitz L-15 培养基	德国达姆施塔特默克公司	F1315
显微镜载玻片	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	CLS294775X50
带有 DAPI 的封固介质	ibidi GmbH， Gräfelfing， 德国	50011	用于软骨盘的核 DAPI（4′，6-二脒基-2-苯基吲哚）复染的封固剂  侧视图成像
青霉素-链霉素	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易	P4333
与 AFM 相关的培养皿加热器（培养皿加热器）Bruker	Nano GmbH，德国柏林	T-05-0117
手术刀	Feather Medical Products，日本大阪	2023-01
硅胶裙	Bruker Nano GmbH，柏林，德国	n/a	保护性硅胶膜 （D55x0.25） 放置在玻璃块的底座上，以防止 AFM 头中的介质冷凝。
统计程序 - SPSS	IBM， Armonk， New York， USA	SPSS Statistics 22	Vesion 280.0.0.0 （190）
组织培养皿	TPP Techno Plastic Products AG， Trasadingen， 瑞士	TPP93040
Tissue-tek O.C.T. 化合物	Sakura Finetek， Alphen aan den Rijn，	荷兰 SA6255012	水溶性包埋培养基