基于原子力显微镜的人关节软骨外植体微压痕研究的实际问题

Summary

我们提出了一种循序渐进的方法来识别和解决与原子力显微镜微压痕相关的最常见问题。我们举例说明了以不同程度的骨关节炎驱动的变性为特征的天然人类关节软骨外植体的新问题。

Abstract

毫无疑问，原子力显微镜（AFM）是目前评估生物领域微观甚至纳米线索的最强大和最有用的技术之一。然而，与任何其他微观方法一样，可能会出现方法学挑战。特别是，样品的特性、样品制备、仪器类型和压痕探头都可能导致不必要的伪影。在该协议中，我们举例说明了健康和骨关节炎关节软骨外植体的这些新问题。为此，我们首先通过分步方法展示如何 通过 整个组织外植体的大型 2D 镶嵌荧光成像，根据变性的不同阶段生成、分级和视觉分类离 体 关节软骨盘。 离体 模型的主要优势在于它由老化的、天然的、人类软骨组成，可以研究骨关节炎从早发到进展的相关变化。此外，还介绍了组织制备中的常见陷阱，以及实际的AFM程序以及随后的数据分析。我们展示了样品制备和处理、高级退化引起的形貌样品特性以及样品-尖端相互作用等基本但关键的步骤如何影响数据采集。我们还仔细研究了AFM中最常见的问题，并在可能的情况下描述了如何克服这些问题。了解这些局限性对于正确的数据采集、解释以及最终将研究结果嵌入到广泛的科学背景中至关重要。

Introduction

由于电子设备和系统的尺寸不断缩小，微纳基技术和装备的快速发展势头强劲。其中一种设备是原子力显微镜 （AFM），它可以扫描生物表面并在纳米和微米尺度上检索地形或生物力学信息^1,2。在其广泛的功能中，该工具可以作为微压头和纳米压头操作，以获取有关各种生物系统的机械性能的信息3,4,5,6。数据是通过机械探针与表面的物理接触来收集的，机械探针的尖端可以小至约 1 nm⁷。然后根据悬臂尖端的压痕深度和施加在样品上的力⁸ 显示样品的变形。

骨关节炎（OA）是一种长期退行性慢性疾病，其特征是关节和周围组织中的关节软骨恶化，这可能导致骨表面完全暴露。OA的负担是沉重的;目前，65岁及以上的女性中有一半和男性中有三分之一患有OA⁹。创伤、肥胖和由此导致的关节¹⁰ 生物力学改变决定了关节软骨退化，这被视为常见的最终结果。Ganz 等人的开创性研究认为，OA 过程的早期步骤可能涉及软骨的生物力学特性¹¹，从那时起，研究人员证实了这一假设¹²。同样，人们普遍认为，组织的生物力学特性在功能上是由超微结构组织以及细胞-细胞和细胞-基质串扰协调的。任何改变都会极大地影响整体组织的生物力学功能¹³。迄今为止，OA 诊断是临床诊断，并且基于平片 X 线照相¹⁴。这种方法是双面的:首先，缺乏明确的退行性临界阈值来制定 OA 的诊断，使得病情难以量化，其次，成像方法缺乏敏感性和标准化，无法检测局部软骨损伤^15,16,17。为此，软骨机械性能的评估具有决定性的优势，即它描述了在OA过程中变化的参数，无论疾病的病因如何，并且在非常早期的阶段对组织功能有直接影响。压痕仪器测量组织抵抗压痕的力。事实上，这并不是一个新概念;最早的研究可以追溯到 1980 年代和 1990 年代。在此期间，大量研究表明，设计用于关节软骨关节镜测量的压痕仪器可能非常适合检测软骨的退行性变化。甚至在 30 年前，一些研究就能够证明压痕仪器能够通过在关节镜检查期间进行压缩刚度测量来检测组织变性过程中软骨表面的体内变化^18,19,20。

关节软骨的 AFM 压痕 （AFM-IT） 提供有关组织的关键机械特性（即刚度）的信息。这是一个机械参数，描述了施加的无损载荷与缩进组织区域²¹的变形之间的关系。AFM-IT 已被证明能够量化宏观上未受影响的胶原网络中僵硬的年龄依赖性变化，从而区分与 OA 发病相关的病理变化（关节软骨外桥量表 0 级）²²。我们之前已经证明，AFM-ITs基于空间软骨细胞组织作为早期软骨退行性变的基于图像的生物标志物，不仅可以量化，而且可以实际确定最早的退行性机械变化。这些发现已经得到其他人^{的证实 23,24}.因此，AFM-IT是诊断和识别早期退行性变化的有趣工具。这些变化已经可以在细胞水平上测量，重塑对OA病理生理过程的理解。

在该协议中，我们展示了关节软骨外植体的完整组织学和生物力学分级程序，从天然软骨外植体制备到 AFM 数据采集和处理。通过循序渐进的方法，我们展示了如何通过二维大马赛克成像，然后进行微AFM压痕，根据变性的不同阶段对关节软骨组织进行生成、分级和视觉分类。

尽管目前，AFM-IT 是测量软骨生物力学变化的最灵敏的工具之一⁷，但与任何其他仪器技术一样，它具有局限性和实际特性²⁵，可能导致错误的数据采集。为此，我们仔细研究了软骨外植体AFM测量过程中出现的最常见问题，并在可能的情况下描述了如何最大限度地减少或克服这些问题。这些因素包括样品的形貌方面和在与AFM兼容的环境中稳定它们的困难，组织表面的物理特性，以及在这些表面上进行AFM测量的困难。还给出了错误的力-距离曲线的示例，强调了可能导致它们的条件。还讨论了悬臂尖端几何形状固有的其他限制以及使用赫兹模型进行数据分析。

Protocol

使用从德国图宾根大学医院接受全膝关节置换术的患者身上采集的股骨髁。本研究仅包括来自退行性和创伤后关节病变患者的关节软骨样本。在研究开始之前，已获得部门、机构和地方伦理委员会的批准（项目编号:674/2016BO2）。在参与之前，已收到所有患者的书面知情同意书。

注:图1中给出了按时间顺序排列的实验步骤的流程 图。

1. 软骨盘的组织处理和生成

1. 组织准备
   1. 术后切除后，将软骨样本放入装有补充有 5% （v/v） 青霉素 - 链霉素的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 的容器中。确保样品完全浸没在培养基中。手术切除和软骨进一步处理之间的持续时间不应超过24小时。确保在整个处理过程中，样品完全浸没在介质中，以避免样品干燥。
   2. 用手术刀将软骨从骨头上切开。
2. 软骨椎间盘生成
   1. 使用活检打孔器生成直径为 4 毫米的软骨盘。
      注意:选择和切除软骨层厚度超过 1 毫米的髁突区域很重要。这可能是有问题的，尤其是在承重区周围，软骨层通常会因磨损过程或退化而失去厚度。
   2. 将先前生成的 4 毫米软骨盘放在定制的切割装置上，并用刮刀固定并保持软骨盘稳定。将软骨盘放在切割装置上时，必须小心。放置样品，使软骨的最顶层（关节软骨的浅表区域）不面向刀片
   3. 用剃须刀片切割软骨盘。因此，生成了 4 mm x 1 mm 的圆盘状软骨样品。为防止样品干燥，请尽快进行组织切割。
   4. 在刮刀的帮助下收集每个椎间盘，并将生成的软骨椎间盘放入含有1mL补充有5%（v / v）青霉素 - 链霉素的DMEM的1.5mL管中。将大约 15 个圆盘放入一个试管中。
3. 软骨盘的冷冻切片（用于垂直切片）
   注意:此步骤是可选的，如果需要软骨盘内细胞模式分布的侧视图可视化，则可以使用它。它可以用作验证方法，因为细胞图案的分布是关节软骨²⁶ 的 3D 特征。也可以使用共聚焦显微镜对整个软骨盘进行光学切片和3D重建，从而消除了按照协议中描述切片样品的需要。
   1. 用水溶性包埋介质覆盖软骨盘，并将其放在冷冻切片机旋钮的边缘（圆盘表面垂直于旋钮表面）。在冷冻切片机装置中，包埋介质在低温下冻结。
   2. 使用标准冷冻组，以 60 μm 的厚度横向切片组织，直到到达圆盘的中间（即，当冷冻切片达到 4 mm 的长度时）并收集切片。通过垂直切片椎间盘外植体，可以可视化软骨的所有区域（浅表、中层和深层）。
   3. 收集载玻片上的切片，并用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤三次，除去水溶性包埋培养基。

2. 软骨椎间盘分选作为细胞空间模式的函数

1. 圆盘状软骨样本的染色
   1. 将一个软骨盘（第 1.2 节）放入 96 孔板的每个孔中，并向每个孔中以 1:1,000 的稀释度加入 130 μL 细胞渗透性荧光染料。
   2. 目视检查整个板，并确保每个孔中只放置一个圆盘。将板在37°C的标准细胞培养箱中孵育30分钟。
2. 60μm软骨切片的染色
   1. 在镊子的帮助下，轻轻地将软骨盘切片（第1.3节）放在玻璃显微镜载玻片上。
   2. 用含有核DAPI复染的封固剂覆盖软骨切片，并轻轻放置适用于荧光显微镜的盖玻片。
   3. 用普通的透明指甲油密封每个盖玻片的边缘，并干燥3分钟。
3. 自上而下和侧视图软骨分类和成像
   注意:每个圆盘都必须在荧光显微镜下检查。此步骤的目的是根据光盘的主要细胞模式（单串、双串、小簇、大簇或弥散）对椎间盘进行分类。
   1. 将96孔板放在荧光显微镜的板架上。
   2. 选择合适的荧光滤光片 Em 495 nm/Ex 515 nm（用于第 2.1 节中制备的软骨盘的自上而下成像）或 Em 358 nm/Ex 461 nm（用于第 2.2 节中制备的软骨切片的侧视图成像）和 10 倍物镜。
      注意:使用10倍物镜可以检查圆盘的整个圆周，并且可以排除染色不均匀或不正确的样品。然而，仅使用自上而下的视图可能会导致对细胞组织变化的感知，这是由于对通过浅表侵蚀可见的更深组织层的分析而产生的。例如，跟随胶原拱廊的上升字符串可以被视为单个细胞或分散的细胞（弥散模式）²⁶。因此，必须检查圆盘的两侧，以确保正确选择细胞模式。
   3. 目视确定每个软骨盘中显示的细胞模式。椎间盘不太可能只有一种类型的细胞模式。对于软骨细胞排列与目标模式不匹配的椎间盘部分，仅当不需要的图案位于未进行AFM测量的最外围（即，距椎间盘边界最多0.5毫米）时才接受样品，并确保不超过椎间盘总表面的10%^27，28.
4. 整个软骨椎间盘的图像采集
   1. 选择显微镜的 10 倍物镜，并将其放置在包含单个软骨盘的预选孔下方。将焦点放在椎间盘上以查看细胞模式。
   2. 选择 "导航器"功能 以获取整个油井的概览。使用鼠标左键并拖动以导航到其他舞台位置。使用鼠标滚轮放大和缩小。
      注:此时，通过依次双击每个感兴趣区域，可以看到带有整个样品的孔的预览。
   3. 选择包含要扫描的感兴趣区域的正方形;此时，构成马赛克的所有单个图块都将变得可见。
   4. 调整曝光/光强度，以便可以从背景中清楚地看到细胞。此时，图片的亮度/对比度已针对所有图块进行了调整，无法再为每个图块单独自定义。
      注意:由于圆盘边缘附近的细胞通常发出比中心细胞更高的荧光信号，因此必须调整曝光/光强度设置。
      1. 要评估曝光时间是否适合特定通道，请检查直方图中信号的分布。通过使用显微镜图像软件中包含的自动曝光机制，可视化位于圆盘内的所有细胞。
   5. 选择软件的 "焦点映射点 "选项，然后通过左键单击每个单独的图块中心来选择它。
   6. 选择 选项 焦点图.将显示一个窗口，其中包含所有先前选择的磁贴。双击列表中的磁贴以显示并使其成为正确的焦点。
   7. 单击 "设置 Z "以保存焦点计划并继续下一个磁贴。调整每个拼贴的焦距计划后，按 开始扫描开始图像采集。
      1. 如果扫描显示较暗的水平和/或垂直条，这可能是由于单帧照明不当和不均匀造成的。在实际扫描之前，使用软件中包含的 "链接着色 "选项来解决此问题。
   8. 保存、导出和正确注释图像。

3. 软骨外植体的生物力学方法

1. AFM测量的样品制备
   1. 通过生物相容性胶水将每个含有细胞模式（第2节）的预选软骨盘固定在培养皿中。在光盘的顶部、底部、左侧和右侧添加足够的样品胶。
   2. 用不含 L-谷氨酰胺的 2.5 mL Leibovitz L-15 培养基覆盖光盘。将 Leibowitz 培养基轻轻添加到样品上，以避免样品因培养基产生的波而从表面分离。
2. 将样品加载到 AFM 中
   1. 将培养皿放置在AFM装置的样品架中，然后打开设置为37°C的培养皿加热器。 让组织培养皿达到所需温度。这样做是为了排除由温度变化引起的可能的伪影。
3. 悬臂力显微镜校准
   1. 按照 Danalache 等人 ²⁹ 之前的描述初始化软件设置。
   2. 选择合适的玻璃块悬臂支架进行液体测量，并小心地将其放置在 AFM 头上。锁定机构将玻璃块固定在 AFM 头中。确保玻璃块的反射表面笔直且平行于AFM支架。
   3. 小心地将悬臂放在玻璃块悬臂支架的表面上。悬臂本身应位于玻璃块中心的抛光光学平面上。
   4. 小心地将硅胶裙（硅胶膜）放在悬臂支架的底座上，以防止AFM头中出现介质冷凝。
   5. 使用步进电机功能以 100 μm 的步长降低悬臂，直到它完全浸没在介质中。
   6. 使用 Danalache 等人 ²⁹ 描述的进近参数运行扫描仪进近。到达培养皿底部后，将悬臂缩回100μm。
   7. 使用确切的步骤校准悬臂，并运行Danalache等人描述的参数²⁹。在校准结束时，垂直偏转被保存并以牛顿 （N） 力单位而不是伏特 （V） 显示，伏特 （V） 是光电二极管检测器的原始配准单位。在这里的实验中，校准后得到的设定点为4.47 nN。
   8. 使用步进电机功能，将悬臂缩回 1,000 μm。
4. 在AFM下确定所需的软骨测量部位
   注意:由于软骨盘的厚度为 1 毫米，因此在样品上导航时，悬臂在视野中不可见。
   1. 使用显微镜的CCD相机识别悬臂。悬臂梁应放置在培养皿的无样品区域。
   2. 使用Danalache等人²⁹描述的相同参数，在培养皿的干净，无样品区域上用悬臂开始扫描仪方法。
   3. 使用步进电机控制将悬臂进一步缩回距离板底部 1.5 毫米。为了避免悬臂和样品之间的直接碰撞，这一步骤至关重要。
   4. 从明场视图切换到荧光视图，并直观地识别光盘的顶部。
   5. 将 AFM 样品架向圆盘中间移动 2 毫米。这个点被认为是软骨盘的中心。
   6. 运行扫描仪方法，一旦到达软骨盘的表面，将悬臂缩回 100 μm。
5. 力-距离曲线测量
   1. 将焦点放在位于所需测量部位的细胞上。单击"运行"按钮开始测量并在目标位置生成力-距离曲线。
   2. 在每个测量点采集五条力-距离曲线。将悬臂缩回 500 μm，然后将悬臂移动到下一个测量点。
      注意:悬臂的缩回是一个关键步骤，因为软骨盘表面不均匀且不规则。样品表面的高丘会导致剧烈碰撞，导致不必要的悬臂尖端/样品损坏。我们建议选择至少五个分散在圆盘表面的不同测量点，并在每个点获取至少五个力-距离曲线。
   3. 检查力-距离曲线并保存它们。
6. 使用赫兹拟合模型估计杨氏模量
   1. 在数据分析软件中，使用"打开 一批光谱 曲线"选项打开生成的要分析的力-距离曲线（.jpk 文件）。
   2. 选择 赫兹 拟合模型，然后选择 弹性拟合 选项。
      1. 弹性拟合选项会自动对选定的力-距离曲线执行以下计算:计算基线并从整个曲线中减去基线偏移（基线在 y 轴上恢复为零）;通过检测力-距离曲线与零力线相交的点（接触点在x轴上设置为零）来确定接触点;计算尖端-样品分离（减去考虑悬臂弯曲的压电陶瓷的高度信号）;并自动将力-距离曲线与所选模型拟合。如果需要，这些步骤中的每一个也可以独立执行。
   3. 使用以下拟合参数进行调整:泊松比为 0.5 和适当的悬臂尖端半径。
      注意: 使用带有球形悬臂尖端的悬臂时，应使用赫兹拟合模型。本研究中使用的悬臂具有半径为 5 μm 的球形尖端。我们建议拟合力-距离曲线，直到达到最大施加力（设定值）。
   4. 目视检查力-距离曲线拟合以确保正确性。必须对所分析的每条力-距离曲线执行此步骤。
7. 压痕深度确定
   注意:根据所使用的数据分析工具，此过程可能会有所不同。实验者可以通过遵循数据分析程序中包含的一系列步骤轻松读取压痕深度。
   1. 在数据分析软件中打开每个生成的力-距离曲线，然后选择 赫兹拟合模型 作为分析过程。
   2. 应用" 减去基线偏移 "选项将垂直偏转轴（y 轴）归零，然后选择 "偏移 + 倾斜 "功能。
   3. 使用"查找接触点"功能自动识别接触点，该 接触点 将自动设为 x 坐标为零。
   4. 使用 垂直尖端位置 功能从压痕期间从原始压电陶瓷高度减去仅考虑悬臂挠度的距离。
   5. 选择 "弹性拟合 "选项以显示已处理的力-距离曲线，并选择图形的区域，使其与 垂直尖端位置轴 （x 轴）上的最大负值对齐。
   6. 从参数选项卡中的"X Min"框中读取并记录缩进。保存并记录结果。

4. 统计分析

1. 打开统计软件。从下拉菜单中选择 新建数据集 。
2. 选择数据集文件后，打开"变量视图"选项卡。定义每个细胞模式类别的数值变量:单串 = SS、双串 = DS、小簇 = SC、大簇 = BC、扩散和杨氏模量。
3. 在数据视图选项卡中，输入每个相应细胞模式类别的测量杨氏模量数据。通过从菜单栏中选择"分析"，然后选择" 探索性数据分析"来分析数据分布。
4. 选择 Young's Moduli 作为因变量，选择 Cellular Pattern 作为因子列表。用于结果部分的箱形图显示在输出文件中的结果中。
5. 要进行统计分析，请在分析菜单栏选项卡的非参数检验部分中选择 "相关样本 "。在字段选项卡下选择 Young 's Moduli 作为 Test Fields ，将 Cellular Pattern 选择为 Groups 。 按 Run（运行）。
   注意:结果显示在输出文件中。对于统计分析，执行弗里德曼检验。
6. 将非参数检验的 p 值合并到步骤 4.4 中创建的箱形图中。通过单击菜单栏中的"文件"并选择 " 保存"来 保存结果。

Results

使用自制的切割装置，我们能够从新鲜的人髁突中取出并生成小（4 mm x 1 mm）软骨盘，其中包含单细胞空间模式³⁰，包括单串（SS，图2A），双串（DS），小簇（SC），大簇（BC;图2A）和漫反射（图2B）。具有代表性的软骨外植体如图3A所示。使用自上而下的荧光成像选择仅显示一种类型图案的圆盘（图2）。软骨表面椎间盘的形貌变化通过软骨盘产生的60μm厚切片的侧视图成像进一步说明（图2C）。在外植的骨关节炎软骨盘表面，存在浅表纤维颤动和基质裂隙（图3B，C）。这在代表晚期OA进展的椎间盘中尤为明显，以BC的存在为代表（

Discussion

作为一种进行性和多因素疾病，OA会引发关节软骨的结构和功能变化。在整个 OA 过程中，机械特征的损伤伴随着关节软骨表面的结构和生化变化^27,31。OA中最早发生的病理事件是蛋白多糖耗竭伴胶原网络破坏^32,33,34。这种早期的细微表面变化很难通过批量测试来精确定位和识别，因为机械行为是在整个组织深度上平均的。此外，一个尚未解决的问题是器官和组织水平的功能变化是否与微米或纳米尺度的结构和功能变化有关。为此，AFM 被认为是最灵敏的方法之一，能够检测 OA 发病时发生的最早生物力学变化⁷。它允许在天然样品中进行微米和纳米尺度的刚度测量，提供有关关节软骨机械性能的信息^35,36。...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
两性霉素 B	默克 KGaA，德国达姆施塔特	1397-89-3
原子力显微镜 （AFM） 头	CellHesion 200， Bruker Nano GmbH， 柏林， 德国	JPK00518
生物相容性样品胶	Bruker Nano GmbH， Berlin， Germany	H000033
Calcein AM	Cayman， Ann Arbor， Michigan， USA	14948	细胞膜渗透染色剂，用于软骨盘分选 - 顶视图成像
悬臂	Bruker Nano GmbH，德国柏林	SAA-SPH-5UM	频率标称值：30KHz，k：0.2N/m，长度标称：115μm，宽度 nom：40μm， 几何形状：矩形，圆柱形尖端，带有 5&μ;m 端桡
骨软骨研磨装置	自制	n/a	切割塑料设备，包含集成在 AFM 中的 4mmx1mm
CDD 相机	The Imaging Source Europe GmbH，德国不来梅	DFK 31BF03
CDD 相机集成在荧光显微镜中	Leica Biosystems，韦茨拉尔，德国	DFC3000G
Cryotome	Leica Biosystems，韦茨拉尔，德国	CM3050S
AFM	Bruker Nano GmbH	n/a	版本 5.0.86 的数据处理软件可以从以下网站免费下载 https://customers.jpk.com
Dulbecco 改良的 Eagle 培养基 （DMEM）	Gibco，Life Technologies，德国达姆施塔特	41966052
荧光显微镜 （Leica DMi8）	Leica Biosystems，韦茨拉尔，德国	11889113
玻璃块悬臂支架	Bruker Nano GmbH，德国柏林	SP-90-05	带斜面的超长玻璃块，专为 JPK PetriDishHeaterTM （Bruker） 设计。
倒置相差显微镜（集成在 AFM 中）	AxioObserver D1，德国耶拿 Carl Zeiss 显微镜	L201306_03
不含 L-谷氨酰胺的 Leibovitz L-15 培养基	德国达姆施塔特默克公司	F1315
显微镜载玻片	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	CLS294775X50
带有 DAPI 的封固介质	ibidi GmbH， Gräfelfing， 德国	50011	用于软骨盘的核 DAPI（4′，6-二脒基-2-苯基吲哚）复染的封固剂  侧视图成像
青霉素-链霉素	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易	P4333
与 AFM 相关的培养皿加热器（培养皿加热器）Bruker	Nano GmbH，德国柏林	T-05-0117
手术刀	Feather Medical Products，日本大阪	2023-01
硅胶裙	Bruker Nano GmbH，柏林，德国	n/a	保护性硅胶膜 （D55x0.25） 放置在玻璃块的底座上，以防止 AFM 头中的介质冷凝。
统计程序 - SPSS	IBM， Armonk， New York， USA	SPSS Statistics 22	Vesion 280.0.0.0 （190）
组织培养皿	TPP Techno Plastic Products AG， Trasadingen， 瑞士	TPP93040
Tissue-tek O.C.T. 化合物	Sakura Finetek， Alphen aan den Rijn，	荷兰 SA6255012	水溶性包埋培养基