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方法文章

解决基于原子力显微镜的人类关节软骨离体组织微压痕实验中的实际问题

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DOI：

10.3791/64371

⸱

2022年10月28日

 ,  ,  , 
1Laboratory of Cell Biology, Department of Orthopaedic Surgery, University Hospital Tübingen, 2Department of Oral and Maxillofacial Surgery, University Hospital Tübingen

本文内容

摘要

我们提出了一种逐步识别和解决原子力显微镜微压痕实验中最常见问题的方法。我们以不同程度骨关节炎导致退变的原代人关节软骨组织为模型，示例说明实验中出现的各类问题。

摘要

毫无疑问，原子力显微镜（AFM）目前是评估生物学领域中微米甚至纳米级信号最强大且最实用的技术之一。然而，与其他显微技术一样，该方法在应用中也可能面临方法学上的挑战。特别是样品的特性、样品制备方式、仪器类型以及压痕探针的选择均可能导致不必要的伪影。在本实验方案中，我们以健康及骨关节炎关节软骨外植体为例，说明这些日益凸显的问题。为此，我们首先展示 通过 逐步生成、分级和视觉分类的方法 离体 通过大范围二维荧光镶嵌成像对整块组织外植体进行成像，以获取不同退变阶段的关节软骨圆盘。该方法的主要优势在于 离体 该模型的优势在于其包含老化的人类原生软骨，可用于研究骨关节炎从早期发生到进展过程中的相关变化。此外，本文还介绍了组织制备中的常见误区、原子力显微镜（AFM）实际操作流程以及后续的数据分析方法。我们展示了样本制备与处理等基础但关键的步骤、因严重退变引起的样本形貌特征，以及样本与探针之间的相互作用如何影响数据采集。同时，我们对AFM中最常见的问题进行了深入剖析，并在可能的情况下，说明了如何克服这些问题。了解这些局限性对于正确获取和解释数据，以及最终将研究结果融入广泛的科学背景中至关重要。

引言

由于电子设备和系统的尺寸不断缩小，微米和纳米级技术及设备的快速发展已日益加速。其中一种设备是原子力显微镜（AFM），它能够扫描生物表面，并在纳米和微米尺度上获取形貌或生物力学信息1,2。该工具具有多种功能，既可作为微米压痕仪，也可作为纳米压痕仪，用于获取多种生物系统力学特性的信息3,4,5,6。数据通过机械探针与样品表面的物理接触采集，探针尖端尺寸可小至约1 nm7。随后，根据悬臂探针的压入深度和施加在样品上的力，显示样品产生的形变结果8。

骨关节炎（OA）是一种长期退行性慢性疾病，其特征是关节及周围组织的关节软骨退化，可导致骨面完全暴露。OA 的疾病负担十分沉重；目前，约有一半年龄在 65 岁及以上的女性和三分之一同龄男性患有骨关节炎。9创伤、肥胖及由此导致的关节生物力学改变10 确定关节软骨退变，这被视为一种常见的终末结局。Ganz 等人的开创性研究提出，骨关节炎（OA）过程的早期阶段可能涉及软骨的生物力学特性11，此后研究人员已证实了这一假设12同样，人们普遍认为，组织的生物力学特性是由其超微结构的排列以及细胞间和细胞与基质间的相互作用在功能上协调调控的。任何改变都可能对组织整体的生物力学功能产生显著影响。13迄今为止，骨关节炎的诊断主要依据临床表现和普通X线摄影。14这种方法具有两面性：一方面，由于缺乏明确的退变诊断阈值来界定骨关节炎（OA）的诊断，使得该疾病难以量化；另一方面，影像学方法缺乏敏感性和标准化，无法检测局部软骨损伤。15,16,17因此，对软骨力学性能的评估具有决定性优势，因为它描述了一个在骨关节炎（OA）病程中无论病因如何均会发生改变的参数，并且在疾病早期阶段就对组织功能产生直接影响。压痕仪器通过测量组织抵抗压入的力来评估其力学性能。这一概念并非全新，最早的研究可追溯至20世纪80年代和90年代。在此期间，大量研究提示，专为关节软骨关节镜下测量设计的压痕仪器能够有效检测软骨的退行性变化。早在30年前，已有部分研究证实，压痕仪器能够检测到 体内 通过关节镜检查期间进行压缩刚度测量，以观察组织退化过程中软骨表面的变化18,19,20.

关节软骨的原子力显微镜压痕（AFM-IT）可提供有关组织关键力学特性——刚度的信息。刚度是一个力学参数，用于描述施加的非破坏性载荷与被压痕组织区域所产生的形变之间的关系21。已有研究表明，AFM-IT能够量化在宏观上未受影响的胶原网络中随年龄变化的刚度改变，从而区分与骨关节炎（OA）发生相关的病理变化（关节软骨Outerbridge分级为0级）22。我们先前已证实，基于空间软骨细胞排列结构的AFM-IT可作为一种基于图像的生物标志物，用于早期软骨退变的评估，不仅能够量化，而且能够精确定位最早期的退行性力学变化。这些发现已被其他研究者所证实23,24。因此，AFM-IT是一种有前景的工具，可用于诊断和识别早期退行性改变。这些变化在细胞水平上即可被检测，从而重塑了人们对OA病理生理过程的理解。

在本实验方案中，我们演示了从天然软骨组织样本制备到原子力显微镜（AFM）数据采集与处理的完整关节软骨组织样本的组织学与生物力学分级流程。通过逐步操作，我们展示了如何利用二维大范围马赛克成像结合微区原子力显微压痕技术，对关节软骨组织进行生成、分级，并根据其退变的不同阶段进行可视化分类。

尽管目前原子力显微镜-成像技术（AFM-IT）是测量软骨生物力学变化最灵敏的工具之一7，但与其他仪器技术一样，它也存在局限性和实际操作中的特殊性25 ，可能导致错误的数据采集。为此，我们对在软骨组织样本AFM测量过程中最常见的问题进行了仔细分析，并在可能的情况下描述了如何将其影响降至最低或加以克服。这些问题包括样本的形貌特征以及在与AFM兼容的环境中稳定样本的困难、组织表面的物理特性，以及由此导致在这些表面上进行AFM测量的挑战。本文还展示了错误的力-距离曲线示例，并强调了可能导致这些错误的实验条件。此外，还讨论了与悬臂探针几何形状以及使用赫兹（Hertz）模型进行数据分析相关的固有局限性。

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方案

本研究使用了来自德国图宾根大学医院接受全膝关节置换术患者的股骨髁。仅纳入患有退行性和创伤后关节病变患者的关节软骨样本。研究开始前已获得科室、机构及当地伦理委员会的批准（项目编号：674/2016BO2）。所有患者在参与研究前均签署了书面知情同意书。

注意：实验步骤的流程图按时间顺序如图1所示。

1. 组织处理与软骨圆盘的制备

  1. 组织准备
    1. 术后切除后，将软骨样本置于装有添加了5%（v/v）青霉素-链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）的容器中。确保样本完全浸没在培养基中。从手术切除到软骨进一步处理之间的时间不应超过24小时。在整个处理过程中，必须确保样本始终完全浸没在培养基中，以避免样本干燥。
    2. 使用手术刀将软骨从骨组织上切割下来。
  2. 软骨圆片制备
    1. 使用活检打孔器制备直径为4 mm的软骨圆片。
      注意：应选择并切除髁突部位软骨层厚度超过1 mm的区域。这一点可能具有挑战性，尤其是在负重区域周围，由于磨损或退变过程，软骨层通常会变薄。
    2. 将先前制备的4 mm软骨圆片放置在定制的切割装置上，并用刮匙固定，使软骨圆片保持稳定。在将软骨圆片放置于切割装置时需格外小心，应确保软骨最表层（关节软骨的表层区）不朝向刀片。
    3. 使用剃须刀片切割软骨圆片，从而获得尺寸为4 mm × 1 mm的盘状软骨样本。为防止样本干燥，应尽快完成组织切割操作。
    4. 使用刮匙收集每个圆片，并将其转移至含有1 mL添加了5%（v/v）青霉素-链霉素的DMEM的1.5 mL离心管中。每管中放置约15个圆片。
  3. 软骨圆片的冷冻切片（用于垂直切片）
    注意：此步骤为可选步骤，当需要观察软骨圆片内细胞排列模式的侧视图时可采用。该方法可作为验证手段，因为细胞排列模式是关节软骨的一种三维特征26。也可使用共聚焦显微镜对整个软骨圆片进行光学切片和三维重建，从而无需按照本方案所述进行物理切片。
    1. 用可溶性包埋介质覆盖软骨圆片，并将其边缘朝下放置于冷冻切片机的旋钮上（使圆片表面与旋钮表面垂直）。在冷冻切片机中，包埋介质在低温下会冻结。
    2. 使用标准冷冻切片机以60 µm厚度对组织进行侧向切片，直至达到圆片中心（即冷冻切片长度达到4 mm），并收集切片。通过垂直切开软骨外植体，可观察到软骨的所有区域（表层、中层和深层）。
    3. 将切片收集到载玻片上，并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤三次，以去除可溶性包埋介质。

2. 根据细胞空间分布模式对软骨圆盘进行分选

  1. 圆盘状软骨样本的染色
    1. 将一个软骨圆片（第1.2节）放入96孔板的每个孔中，并向每孔加入130 µL细胞通透性荧光染料，稀释比例为1:1,000。
    2. 目视检查整块板，确保每个孔中仅放置一个圆片。将板在标准细胞培养箱中于37 °C孵育30分钟。
  2. 60 µm软骨切片的染色
    1. 借助镊子将软骨圆片切段（第1.3节）轻轻放置在玻璃显微镜载玻片上。
    2. 用含有DAPI核复染的封片剂覆盖软骨切片，并轻轻盖上适用于荧光显微镜观察的盖玻片。
    3. 用普通透明指甲油密封每个盖玻片的边缘，并静置干燥3分钟。
  3. 软骨的俯视与侧视分选及成像
    注意：每个圆片必须在荧光显微镜下进行检查。此步骤的目的是根据其主要的细胞排列模式（单串、双串、小簇、大簇或弥散状）对圆片进行分类。
    1. 将96孔板放置在荧光显微镜的板架上。
    2. 选择适当的荧光滤光片，分别为Em 495 nm/Ex 515 nm（用于第2.1节制备的软骨圆片的俯视成像）或Em 358 nm/Ex 461 nm（用于第2.2节制备的软骨切片的侧视成像），并使用10倍物镜。
      注意：使用10倍物镜可检查圆片的整个周长，从而排除染色不均或不合适的样本。然而，仅使用俯视观察可能导致因表层磨损而使深层组织结构可见，从而误判细胞组织的变化。例如，沿胶原穹窿上升的细胞串可能被误认为单个细胞或弥散分布的细胞（弥散模式）26。因此，必须检查圆片的两面，以确保正确选择细胞排列模式。
    3. 通过目视确定每个软骨圆片所呈现的细胞排列模式。一个圆片仅具有一种细胞模式的可能性较小。对于软骨细胞排列不符合目标模式的部分，仅当该非目标模式位于圆片最外周（即AFM测量区域之外，距圆片边缘不超过0.5 mm处）时方可接受样本，并确保该区域不超过圆片总面积的10%27,28。
  4. 完整软骨圆片的图像采集
    1. 选择显微镜的10倍物镜，并将其定位至预选的含有单个软骨圆片的孔下方。对焦以观察圆片中的细胞排列模式。
    2. 选择导航功能以获得整个孔的概览。使用鼠标左键拖动以移动至不同的载物台位置，通过鼠标滚轮进行缩放。
      注意：此时可通过依次双击感兴趣区域，查看各区域的预览图像。
    3. 选择一个包含待扫描区域的方形区域；此时构成拼接图像的所有单个图块将变得可见。
    4. 调整曝光/光强，使细胞能够从背景中清晰可见。此时图像的亮度/对比度已针对所有图块统一调整，无法再对每个图块单独定制。
      注意：由于靠近圆片边缘的细胞通常比中心区域的细胞发出更强的荧光信号，因此必须相应调整曝光/光强设置。
      1. 为评估特定通道的曝光时间是否合适，需检查信号在直方图中的分布情况。利用显微镜图像软件内置的自动曝光机制，确保圆片内所有细胞均能被可视化。
    5. 选择软件中的焦点图点选项，然后通过左键单击每个图块的中心来依次选择各个图块。
    6. 选择焦点图选项。将显示一个包含所有先前选定图块的窗口。双击列表中的某个图块，可将其显示并调整至正确焦平面。
    7. 点击设置Z以保存焦平面，并继续下一个图块。在为每个图块调整完焦平面后，点击开始扫描以启动图像采集。
      1. 如果扫描图像中出现较暗的水平和/或垂直条纹，可能是由于单帧照明不充分或不均匀所致。可在正式扫描前使用软件中的联动阴影校正功能解决此问题。
    8. 保存、导出并正确标注图像。

3. 软骨组织块的生物力学方法

  1. 原子力显微镜测量的样品制备
    1. 使用生物相容性胶水将每个预先选定的含有细胞图案的软骨圆片（第2节）固定在培养皿中。在圆片的顶部、底部、左侧和右侧添加足量的样品胶水。
    2. 用不含 L-谷氨酰胺的 Leibovitz's L-15 培养基 2.5 mL 覆盖圆片。将 Leibovitz 培养基轻轻加入样本中，避免因培养基产生的液流导致样本从表面脱落。
  2. 将样品装入原子力显微镜
    1. 将培养皿置于原子力显微镜（AFM）设备的样品台上，开启培养皿加热器并设置温度为37 °C。使组织培养皿达到目标温度，以排除因温度变化可能引起的伪影。
  3. 原子力显微镜悬臂校准
    1. 按照 Danalache 等人先前所述的方法初始化软件设置。29.
    2. 选择适用于液体测量的玻璃悬臂梁支架，并小心地将其放置在原子力显微镜（AFM）探头端。通过锁定装置将玻璃块固定在AFM探头端。确保玻璃块的反射面平整且与AFM支架平行。
    3. 小心地将悬臂放置在玻璃块悬臂支架的表面。悬臂本身应位于玻璃块中心的抛光光学平面上。
    4. 小心地将硅胶裙（硅胶膜）放置在悬臂支架的底部，以防止培养基在原子力显微镜头部发生冷凝。
    5. 使用步进电机功能以100 µm为步长逐步降低悬臂，直至其完全浸入培养基中。
    6. 采用 Danalache 等人所述的接近参数进行扫描仪接近操作。29当达到培养皿底部时，将悬臂回缩100 µm。
    7. 使用 Danalache 等人所述的精确步骤和运行参数对悬臂梁进行校准。29校准结束后，垂直偏转被保存并以牛顿（N）为单位显示力的大小，而非光电二极管检测器原始记录时的伏特（V）单位。在本实验中，校准后得到的设定值为 4.47 nN。
    8. 使用步进电机功能，将悬臂回缩至 1,000 µm。
  4. 在原子力显微镜下确定目标软骨测量位点
    注意：由于软骨圆盘的厚度为1 mm，在样品上方扫描时，悬臂不在视野范围内。
    1. 使用显微镜的CCD相机识别悬臂。原子力显微镜（AFM）悬臂应置于培养皿中无样品的区域。
    2. 在培养皿的洁净无样品区域，采用 Danalache 等人所述的相同参数，开始扫描探针显微镜的扫描操作。29.
    3. 使用步进电机控制将悬臂进一步从培养板底部回撤1.5 mm。此步骤至关重要，可避免悬臂与样品发生直接碰撞。
    4. 从明场切换至荧光观察模式，并在显微镜下识别椎间盘的顶部位置。
    5. 将原子力显微镜样品台精确向圆盘中心移动2 mm。该位置被视为软骨圆盘的中心。
    6. 采用扫描仪模式，当探针接近软骨盘表面时，将悬臂回撤100 µm。
  5. 力-距离曲线测量
    1. 聚焦于目标测量位置的细胞。点击“运行”按钮，开始在目标位置进行测量并生成力-距离曲线。
    2. 在每个测量位点获取五条力-距离曲线。将悬臂 retract 500 µm，并移动至下一个测量位点。
      注意：悬臂的回缩是关键步骤，因为软骨盘表面并非均质，存在不规则性。样品表面的显著突起可能导致剧烈碰撞，从而造成悬臂针尖或样品的意外损伤。我们建议在圆盘表面选择至少五个不同的测量位点，并在每个位点获取至少五条力-距离曲线。
    3. 检查力-距离曲线并保存。
  6. 使用赫兹拟合模型估算杨氏模量
    1. 使用数据分析软件打开待分析的力-距离曲线文件（.jpk 格式） 打开一批光谱曲线 选项
    2. 选择 赫兹拟合模型 然后选择 弹性拟合 选项
      1. 弹性拟合选项将自动对选定的力-距离曲线执行以下计算：计算基线并从整条曲线中减去基线，以消除基线偏移（基线在y轴上被调整至零）；通过检测力-距离曲线与零力线的交叉点确定接触点（接触点在x轴上被设为零）；计算针尖-样品间距（减去压电陶瓷高度信号中悬臂弯曲的部分）；并使用选定的模型自动拟合力-距离曲线。如有需要，上述每一步也可独立执行。
    3. 使用以下拟合参数进行调整：泊松比为 0.5，并采用合适的悬臂梁针尖半径。
      注意：使用带有球形针尖的悬臂梁时，应采用赫兹（Hertz）拟合模型。本研究中使用的悬臂梁具有半径为5 µm的球形针尖。我们建议将力-距离曲线拟合至达到最大施加力（设定点）为止。
    4. 目视检查力-距离曲线的拟合情况以确保正确性。此步骤需针对每一条分析的力-距离曲线进行。
  7. 压痕深度测定
    注意：根据所使用的数据分析工具不同，该过程可能有所差异。实验人员可按照数据分析程序中包含的一系列步骤，轻松读取压痕深度。
    1. 在数据分析软件中打开生成的每条力-距离曲线，并选择 赫兹拟合模型 作为分析过程。
    2. 应用 扣除基线偏移 零点校正垂直偏转轴（y轴）并选择 偏移 + 倾斜 功能
    3. 使用 找到接触点 自动识别接触点并将其x坐标自动移至零。
    4. 从压痕过程中的原始压电高度中减去仅由悬臂梁偏转引起的距离 垂直尖端位置 功能。
    5. 选择 弹性拟合 显示已处理的力-距离曲线的选项，并可选择图表区域，使其与图中最负的数值对齐 垂直探针位置轴 （x轴）
    6. 在参数选项卡的“X Min”框中读取并记录压痕数据。保存并记录结果。

4. 统计分析

  1. 打开统计软件。从下拉菜单中选择 新建数据集。
  2. 选择 DataSet 文件后，打开 变量视图 选项卡。为每个细胞模式类别定义数值变量：单条状 = SS，双条状 = DS，小簇状 = SC，大簇状 = BC，弥散状，以及杨氏模量。
  3. 在数据视图选项卡中，输入每种相应细胞模式类别的测量所得杨氏模量数据。通过从菜单栏选择“分析”（Analyze），然后选择 探索性数据分析，来分析数据分布。
  4. 选择 杨氏模量 作为因变量，细胞模式 作为因子列表。结果文件中将显示用于结果部分的箱形图。
  5. 要进行统计分析，请在分析菜单栏选项卡的非参数检验部分选择 相关样本。在字段选项卡下，选择 杨氏模量 作为 检验字段，细胞模式 作为 分组。点击 运行。
    注：结果将在输出文件中显示。统计分析采用弗里德曼检验（Friedman test）。
  6. 将非参数检验的 p-值整合到第4.4步创建的箱形图中。单击菜单栏中的 文件，然后选择 保存，以保存结果。

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结果

使用自制的切割装置，我们能够从新鲜的人类髁突中切取并制备出含有单一细胞空间排列模式的小型（4 mm × 1 mm）软骨圆片30 单链（SS， 图2A），双串（DS）、小簇（SC）、大簇（BC； 图2A），以及弥散性（图2B）。一个具有代表性的软骨组织外植体如图所示 图3A. 通过自上而下的荧光成像筛选仅显示一种图案类型的菌落（图2）。通过侧视成像进一步展示了软骨表面圆盘的地形变化 60 µm 由软骨圆盘制备的厚切片（图 2C）。在移植出的骨关节炎软骨圆盘表面，可见表层纤维化和基质裂隙（图3B,C）。这在代表OA进展晚期的椎间盘中尤为显著，其特征...

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讨论

作为一种进行性且多因素的疾病，骨关节炎（OA）会引发关节软骨的结构和功能改变。在OA的发展过程中，机械性能的损伤伴随着关节软骨表面的结构和生化变化27,31。OA中最早发生的病理事件是蛋白聚糖的耗竭以及胶原网络的破坏32,33,34。这类早期细微的表面变化难以通过整体组织测试准确定位和识别，因为其力学行为反映的是整个组织深度的平均值。此外，一个尚未解决的问题是：器官和组织水平的功能变化是否与微米或纳米尺度的结构和功能变化相关。为此，原子力显微镜（AFM）被认为是最敏感的方法之一，能够检测OA发生初期即出现的最早期生物力学变化7。AFM可在天然样本上实现微米和纳米尺度的刚度测量，提供有关关节软骨力学特性的信息35,

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢图宾根大学医院骨科的骨科外科医生提供组织样本。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
两性霉素B德国达姆施塔特默克公司1397-89-3
原子力显微镜（AFM）探头 CellHesion 200，Bruker Nano GmbH，柏林，德国JPK00518
生物相容性样品胶 布鲁克纳米有限公司，柏林，德国H000033
Calcein AM美国密歇根州安娜堡 Cayman14948细胞膜通透性染料，用于软骨圆盘分选——顶视成像
悬臂梁布鲁克纳米有限公司，柏林，德国SAA-SPH-5UM频率标称值：30 kHz，k：0.2 N/m，长度标称值：115μm，标称宽度：40μm  几何形状：矩形，带有直径为5的圆柱形尖端μm端半径
软骨切割装置 自制 n/a切割含有预定义4mm×1mm孔洞的塑料装置
原子力显微镜中集成的CDD相机The Imaging Source Europe GmbH，德国不来梅DFK 31BF03
荧光显微镜中集成的CDD相机德国韦茨拉尔，徕卡生物系统公司DFC3000G
冷冻切片机德国韦茨拉尔，徕卡生物系统公司CM3050S 
原子力显微镜数据处理软件布鲁克纳米有限公司，柏林，德国n/a版本 5.0.86，  可从以下网站免费下载：https://customers.jpk.com
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） Gibco，Life Technologies，德国达姆施塔特41966052
荧光显微镜（Leica DMi8）德国韦茨拉尔，徕卡生物系统公司11889113
玻璃块悬臂夹持器布鲁克纳米有限公司，柏林，德国SP-90-05带斜面的超长玻璃块，专为与布鲁克（Bruker）的 JPK PetriDishHeaterTM 配合使用而设计。
倒置相差显微镜（集成于原子力显微镜中）AxioObserver D1，卡尔·蔡司显微镜有限公司，耶拿，德国L201306_03
不含L-谷氨酰胺的Leibovitz L-15培养基 德国达姆施塔特默克公司F1315
显微镜载玻片Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯CLS294775X50
含DAPI的封片剂ibidi GmbH, Grä费尔芬，德国50011含DAPI（4'6-二脒基-2-苯基吲哚）核染色的封片剂′，6-二脒基-2-苯基吲哚）复染用于软骨圆盘  侧面成像
青霉素-链霉素Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯P4333
与原子力显微镜联用的培养皿加热器（Petri Dish Heater）布鲁克纳米有限公司，柏林，德国T-05-0117
手术刀日本大阪，Feather Medical Products2023-01
硅胶裙边布鲁克纳米有限公司，柏林，德国n/a用于放置在玻璃块基座底部的防护硅胶膜（D55x0.25），以防止  原子力显微镜探头中等程度冷凝
统计软件 - SPSSIBM，阿蒙克，纽约州，美国SPSS Statistics 22Vesion 280.0.0.0 (190)
组织培养皿 TPP Techno Plastic Products AG，Trasadingen，瑞士TPP93040
Tissue-tek O.C.T. 包埋剂Sakura Finetek，荷兰阿尔芬安登莱茵SA6255012水溶性包埋介质 

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