解决基于原子力显微镜的人类关节软骨离体组织微压痕实验中的实际问题

摘要

我们提出了一种逐步识别和解决原子力显微镜微压痕实验中最常见问题的方法。我们以不同程度骨关节炎导致退变的原代人关节软骨组织为模型，示例说明实验中出现的各类问题。

摘要

毫无疑问，原子力显微镜（AFM）目前是评估生物学领域中微米甚至纳米级信号最强大且最实用的技术之一。然而，与其他显微技术一样，该方法在应用中也可能面临方法学上的挑战。特别是样品的特性、样品制备方式、仪器类型以及压痕探针的选择均可能导致不必要的伪影。在本实验方案中，我们以健康及骨关节炎关节软骨外植体为例，说明这些日益凸显的问题。为此，我们首先展示 通过 逐步生成、分级和视觉分类的方法 离体 通过大范围二维荧光镶嵌成像对整块组织外植体进行成像，以获取不同退变阶段的关节软骨圆盘。该方法的主要优势在于 离体 该模型的优势在于其包含老化的人类原生软骨，可用于研究骨关节炎从早期发生到进展过程中的相关变化。此外，本文还介绍了组织制备中的常见误区、原子力显微镜（AFM）实际操作流程以及后续的数据分析方法。我们展示了样本制备与处理等基础但关键的步骤、因严重退变引起的样本形貌特征，以及样本与探针之间的相互作用如何影响数据采集。同时，我们对AFM中最常见的问题进行了深入剖析，并在可能的情况下，说明了如何克服这些问题。了解这些局限性对于正确获取和解释数据，以及最终将研究结果融入广泛的科学背景中至关重要。

引言

由于电子设备和系统的尺寸不断缩小，微米和纳米级技术及设备的快速发展已日益加速。其中一种设备是原子力显微镜（AFM），它能够扫描生物表面，并在纳米和微米尺度上获取形貌或生物力学信息^1,2。该工具具有多种功能，既可作为微米压痕仪，也可作为纳米压痕仪，用于获取多种生物系统力学特性的信息^3,4,5,6。数据通过机械探针与样品表面的物理接触采集，探针尖端尺寸可小至约1 nm⁷。随后，根据悬臂探针的压入深度和施加在样品上的力，显示样品产生的形变结果⁸。

骨关节炎（OA）是一种长期退行性慢性疾病，其特征是关节及周围组织的关节软骨退化，可导致骨面完全暴露。OA 的疾病负担十分沉重；目前，约有一半年龄在 65 岁及以上的女性和三分之一同龄男性患有骨关节炎。⁹创伤、肥胖及由此导致的关节生物力学改变¹⁰ 确定关节软骨退变，这被视为....

方案

本研究使用了来自德国图宾根大学医院接受全膝关节置换术患者的股骨髁。仅纳入患有退行性和创伤后关节病变患者的关节软骨样本。研究开始前已获得科室、机构及当地伦理委员会的批准（项目编号：674/2016BO2）。所有患者在参与研究前均签署了书面知情同意书。

注意：实验步骤的流程图按时间顺序如图1所示。

1. 组织处理与软骨圆盘的制备

1. 组织准备
   1. 术后切除后，将软骨样本置于装有添加了5%（v/v）青霉素-链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）的容器中。确保样本完全浸没在培养基中。从手术切除到软骨进一步处理之间的时间不应超过24小时。在整个处理过程中，必须确保样本始终完全浸没在培养基中，以避免样本干燥。
   2. 使用手术刀将软骨从骨组织上切割下来。
2. 软骨圆片制备
   1. 使用活检打孔器制备直径为4 mm的软骨圆片。
      注意：应选择并切除髁突部位软骨层厚度超过1 mm的区域。这一点可能具有挑战性，尤其是在负重区域周围，由于磨损或退变过程，软骨层通常会变薄。
   2. 将先前制备的4 mm软骨圆片放置在定制的切割装置上，并用刮匙固定，使软骨圆片保持稳定。在将软骨圆片放置于切割装置时需格外小心，应....

结果

使用自制切割装置，我们能够从新鲜的人类髁突中分离并制备出含有单一细胞空间排列的小型（4 mm × 1 mm）软骨圆片³⁰ 单链（SS， 图2A），双串（DS）、小簇（SC）、大簇（BC； 图 2A），以及弥散性（图2B）。一个具有代表性的软骨组织外植体如图所示 图3A使用自上而下的荧光成像方法筛选仅显示一种类型图案的圆盘（图2）。通过获取软骨圆盘切片的60 µm厚横截面并进行侧视成像，进一步展示了软骨表面圆盘的地形学差异（图2C）。在移植出的骨关节炎软骨圆盘表面，可见表层纤维化和基质裂隙（图3B,C）。这在代表骨关节炎（OA）进展晚期的椎间盘中.......

讨论

作为一种进行性且多因素的疾病，骨关节炎（OA）会引发关节软骨的结构和功能改变。在OA的发展过程中，机械性能的损伤伴随着关节软骨表面的结构和生化变化^27,31。OA中最早发生的病理事件是蛋白聚糖的耗竭以及胶原网络的破坏^32,33,34。这类早期微小的表面变化难以通过整体组织测试准确定位和识别，因为其力学行为反映的是整个组织深度的平均值。此外，一个尚未解决的问题是：器官和组织层面的功能变化是否与微米或纳米尺度的结构和功能变化相关。为此，原子力显微镜（AFM）被认为是最敏感的方法之一，能够检测OA发生初期即出现的最早期生物力学变化⁷。AFM可在天然样本上实现微米和纳米尺度的刚度测量，提供有关关节软骨力学特性的信息^35,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
两性霉素B	德国达姆施塔特默克公司	1397-89-3
原子力显微镜（AFM）探头	CellHesion 200，Bruker Nano GmbH，柏林，德国	JPK00518
生物相容性样品胶	布鲁克纳米有限公司，柏林，德国	H000033
Calcein AM	美国密歇根州安娜堡 Cayman	14948	细胞膜通透性染料，用于软骨圆盘分选——顶视成像
悬臂梁	布鲁克纳米有限公司，柏林，德国	SAA-SPH-5UM	频率标称值：30 kHz，k：0.2 N/m，长度标称值：115μm，标称宽度：40μm  几何形状：矩形，带有直径为5的圆柱形尖端μm端半径
软骨切割装置	自制	n/a	切割含有预定义4mm×1mm孔洞的塑料装置
原子力显微镜中集成的CDD相机	The Imaging Source Europe GmbH，德国不来梅	DFK 31BF03
荧光显微镜中集成的CDD相机	德国韦茨拉尔，徕卡生物系统公司	DFC3000G
冷冻切片机	德国韦茨拉尔，徕卡生物系统公司	CM3050S
原子力显微镜数据处理软件	布鲁克纳米有限公司，柏林，德国	n/a	版本 5.0.86，  可从以下网站免费下载：https://customers.jpk.com
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Gibco，Life Technologies，德国达姆施塔特	41966052
荧光显微镜（Leica DMi8）	德国韦茨拉尔，徕卡生物系统公司	11889113
玻璃块悬臂夹持器	布鲁克纳米有限公司，柏林，德国	SP-90-05	带斜面的超长玻璃块，专为与布鲁克（Bruker）的 JPK PetriDishHeaterTM 配合使用而设计。
倒置相差显微镜（集成于原子力显微镜中）	AxioObserver D1，卡尔·蔡司显微镜有限公司，耶拿，德国	L201306_03
不含L-谷氨酰胺的Leibovitz L-15培养基	德国达姆施塔特默克公司	F1315
显微镜载玻片	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	CLS294775X50
含DAPI的封片剂	ibidi GmbH, Grä费尔芬，德国	50011	含DAPI（4'6-二脒基-2-苯基吲哚）核染色的封片剂′，6-二脒基-2-苯基吲哚）复染用于软骨圆盘  侧面成像
青霉素-链霉素	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	P4333
与原子力显微镜联用的培养皿加热器（Petri Dish Heater）	布鲁克纳米有限公司，柏林，德国	T-05-0117
手术刀	日本大阪，Feather Medical Products	2023-01
硅胶裙边	布鲁克纳米有限公司，柏林，德国	n/a	用于放置在玻璃块基座底部的防护硅胶膜（D55x0.25），以防止  原子力显微镜探头中等程度冷凝
统计软件 - SPSS	IBM，阿蒙克，纽约州，美国	SPSS Statistics 22	Vesion 280.0.0.0 (190)
组织培养皿	TPP Techno Plastic Products AG，Trasadingen，瑞士	TPP93040
Tissue-tek O.C.T. 包埋剂	Sakura Finetek，荷兰阿尔芬安登莱茵	SA6255012	水溶性包埋介质