本研究采用斑马鱼(Danio rerio)作为模型,通过评估对蜱虫唾液及哺乳动物肉类摄入的过敏反应,来研究α-半乳糖综合征(AGS)相关的过敏反应和免疫应答。
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本研究采用斑马鱼(Danio rerio)作为模型,通过评估对蜱虫唾液及哺乳动物肉类摄入的过敏反应,来研究α-半乳糖综合征(AGS)相关的过敏反应和免疫应答。
蜱虫是通过传播病原体引起疾病的节肢动物媒介,其叮咬可能引发影响全球人类健康的过敏反应。在某些个体中,蜱虫叮咬可诱导产生针对糖类抗原Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R(α-Gal)的高水平免疫球蛋白E抗体。由蜱虫唾液中存在的含α-Gal糖类的糖蛋白和糖脂介导的过敏性反应,与α-Gal综合征(AGS)或哺乳动物肉类过敏相关。斑马鱼(Danio rerio)已成为研究多种病理过程的常用脊椎动物模型。本研究利用斑马鱼作为模型,研究对α-Gal及哺乳动物肉类摄入引发的过敏反应,因为斑马鱼与人类相似,均不能合成该糖类。为此,评估了斑马鱼在摄入Ixodes ricinus蜱虫唾液及哺乳动物肉类后的行为模式和出血性过敏性反应。该实验方法可获得有效数据,支持将斑马鱼作为动物模型用于研究蜱传过敏性疾病,包括AGS。
蜱是病原体的传播媒介,可引起疾病,同时也会导致过敏反应,影响全球人类和动物的健康1,2。在蜱吸血过程中,蜱唾液中的生物分子(尤其是蛋白质和脂质)有助于这些外寄生虫的取食,从而逃避宿主的防御机制3。某些含有糖类Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R(α-Gal)修饰的唾液生物分子,在部分个体被蜱叮咬后会诱导产生高水平的抗α-Gal IgE抗体,这种现象被称为α-Gal综合征(AGS)4。该疾病是一种由IgE介导的过敏反应,可能导致对蜱叮咬、非灵长类哺乳动物肉类摄入以及某些药物(如西妥昔单抗)产生过敏性休克5。对α-Gal的过敏反应通常较为严重,有时甚至可能致命6,7,8,9,10,11,12,13,14,15。
α-半乳糖(α-Gal)存在于所有哺乳动物中,但旧世界猴、猿类和人类除外,后三者缺乏合成 α-Gal 的能力13然而,某些病原体(如细菌和原生动物)在其表面表达这种聚糖,可诱导机体产生大量抗α-Gal IgM/IgG抗体,这可能是一种针对这些病原体的保护性机制16,17然而,抗α-半乳糖抗体的产生会增加发生IgE介导的抗α-半乳糖过敏的风险7,13人类体内产生的天然抗α-半乳糖抗体(主要为IgM/IgG亚型)可能与肠道微生物群中细菌所含的这种修饰有关16. AGS 是一种具有挑战性的临床诊断,因为目前主要的诊断方法依赖于临床病史中出现的延迟性过敏反应,尤其是与食物过敏相关的症状(如瘙痒、局部荨麻疹或反复发生的血管性水肿,直至过敏性休克、荨麻疹及胃肠道症状),以及 IgE 抗-α-Gal 抗体水平的检测9目前的研究结果表明,蜱虫叮咬是导致α-半乳糖综合征(AGS)出现的主要风险之一。18,19蜱叮咬后,α-半乳糖(α-Gal)特异性IgE水平升高20倍或以上19α-半乳糖综合征(AGS)患者中蜱虫叮咬史20,21,22AGS 患者体内存在针对蜱虫抗原的反应性抗体19,且抗α-Gal IgE与抗蜱IgE水平密切相关19,23 但需要进一步研究以确定实际参与的生物分子。
此外,另一种可能的情况是,某些患者对蜱叮咬表现出强烈的过敏反应,并且体内抗α-半乳糖(α-Gal)IgE抗体水平较高,但却能够耐受哺乳动物肉类的摄入12。因此,哺乳动物肉类过敏可能是蜱叮咬相关过敏的一种特殊类型。与α-半乳糖综合征(AGS)相关的主要蜱种包括Amblyomma americanum(美国)、Amblyomma sculptum(巴西)、Amblyomma testudinarium 和 Haemaphysalis longicornis(日本)、Ixodes holocyclus(澳大利亚),以及Ixodes ricinus(欧洲莱姆病螺旋体病的主要传播媒介)11,24。
目前唯一用于评估与蜱虫叮咬相关的IgE产生的模型是α−1,3-半乳糖基转移酶基因敲除的转基因小鼠模型(α-Gal KO小鼠)25,26,因为与其他哺乳动物一样,小鼠也在蛋白质和脂质上表达α-Gal,且不会产生针对α-Gal的IgE。然而,斑马鱼(Danio rerio)是适用于哺乳动物的生物医学研究的有用模型,因其与哺乳动物具有许多解剖学上的相似性,并且与人类一样,也无法合成α-Gal。由于斑马鱼本身不天然产生α-Gal,因此该模型成本较低、易于操作,并可实现较大的样本量,适用于α-Gal相关过敏反应的研究。
本研究采用斑马鱼作为模式生物,用于表征和描述局部过敏反应、行为模式以及与经皮致敏蜱唾液26,27及随后摄入哺乳动物肉类相关的分子机制。为此,通过皮内注射使斑马鱼暴露于蜱唾液,随后喂食含有适于动物使用的哺乳动物肉类衍生产品的狗粮,该狗粮含有α-Gal27,然后评估可能相关的过敏反应。该方法可应用于其他与过敏过程相关的生物分子的研究,尤其是与α-半乳糖综合征(AGS)相关的研究。
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本研究所述所有方法均已获得卡斯蒂利亚-拉曼查大学动物实验伦理委员会批准,研究编号为 "斑马鱼模型中灭活 M. bovis 疫苗免疫应答及 M. marinum 攻毒试验评估,编号 PR-2017-05-12"。
蜱虫取自实验室种群,该种群中的代表性蜱虫样本通过PCR检测常见的蜱传病原体,以确认无病原体存在,并饲养于捷克科学院生物中心寄生虫研究所(IP BC CAS),捷克共和国。所有动物实验均依照捷克共和国第246/1992号动物保护法(伦理批准编号34/2018)进行。
1. 斑马鱼处理
注意:本试验旨在评估斑马鱼在摄入哺乳动物肉类后,对蜱虫唾液处理所引发的过敏反应及免疫应答。
2. Ixodes ricinus 蜱虫唾液提取
3. 斑马鱼的维护
4. 斑马鱼显微注射
5. 斑马鱼喂养
6. 斑马鱼过敏反应、病变及行为的评估
7. 样品采集
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本文所述方案基于先前发表的多项实验27,30以及本实验室的研究结果,其中斑马鱼模型已建立并验证可用于研究α-半乳糖综合征(AGS)及对α-半乳糖(α-Gal)的免疫反应,因为人类和斑马鱼均不合成该分子13。该模型可用于表征和评估多种过敏反应,这些反应源于宿主对蜱虫唾液的应答(图4),并涉及AGS的发病机制。此外,在接受蜱虫唾液处理的鱼类中观察到行为改变,例如游动缓慢(视频6)、侧卧于水箱底部(视频7)、不进食、震颤或呈之字形运动(视频8),而对照组鱼类未见此类现象;这些现象在第2天给予犬粮后尤为显著。此时,鱼类已通过α-Gal和蜱虫唾液致敏,并开始通过饲料摄入红肉。最终,在接受蜱虫唾液处理的鱼类中观察到显著的过敏反应发生率(图4A、B
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斑马鱼是一种经济实惠且易于操作的模式生物,同时也是研究免疫反应分子机制、病原体疾病、新药测试以及疫苗接种和抗感染保护的可行工具33,34,35。对斑马鱼行为的研究具有重要意义,因为先前的研究发现,某些鱼类在受到应激时会在水箱底部保持静止不动,从而影响其摄食行为,导致进食减少;此外,鱼类在游动时出现的之字形运动也可能与应激和焦虑有关36,37。通过评估斑马鱼这些参数所获得的信息,将有助于深入理解蜱-宿主之间的分子相互作用以及宿主对α-Gal免疫反应的相关机制,进而揭示α-半乳糖综合征(AGS)的发生机制,包括对哺乳动物肉类摄入产生过敏反应的机理。
为避免对注射分子产生假阳性反应,进行皮内注射时应避免过深,需与斑马鱼体表平行,并在注射时评估鱼类是否受损。因操作或针头穿刺造成损伤的个体不...
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作者无任何利益冲突需要披露。
我们感谢SaBio研究团队在实验设计以及鱼类实验设施技术协助方面的合作,感谢Juan Galcerán Sáez(IN-CSIC-UMH,西班牙)提供斑马鱼。本研究由西班牙科学与创新部/国家研究机构MCIN/AEI/10.13039/501100011033以及欧盟区域发展基金(EU-FEDER)资助(项目号BIOGAL PID2020-116761GB-I00)。Marinela Contreras由西班牙科学、创新与大学部资助(项目号IJC2020-042710-I)。
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