方法文章

利用遗传密码子扩展技术对细菌分泌蛋白进行超分辨率成像

DOI：

10.3791/64382

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2023年2月10日

 , 
1Biochemistry & Molecular Biology, University of Texas Medical Branch

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文提供了一种简单明了的实验方案，利用遗传密码子扩展技术（GCE）对Salmonella分泌的效应蛋白进行位点特异性标记，并通过直接随机光学重建显微镜（dSTORM）在HeLa细胞中成像观察分泌蛋白的亚细胞定位。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

III型分泌系统（T3SSs）使革兰氏阴性细菌能够将一系列效应蛋白直接注入真核宿主细胞的细胞质中。进入细胞后，这些注入的效应蛋白协同调控真核细胞的信号通路并重编程细胞功能，从而促进细菌的侵入与存活。在感染过程中监测和定位这些分泌的效应蛋白，可为定义宿主-病原体相互作用的动态界面提供重要线索。然而，在不破坏其结构或功能的前提下，对宿主细胞内的细菌蛋白进行标记和成像在技术上具有挑战性。

构建荧光融合蛋白并不能解决这一问题，因为融合蛋白会堵塞分泌装置，因而无法被分泌。为了克服这些障碍，我们近期采用了一种利用遗传密码子扩展（GCE）技术对细菌分泌效应蛋白以及其他难以标记的蛋白质进行位点特异性荧光标记的方法。本文提供了一个完整的分步操作方案，用于通过GCE技术对沙门氏菌（Salmonella）分泌的效应蛋白进行位点特异性标记，随后介绍了在HeLa细胞中利用直接随机光学重建显微镜（dSTORM）对分泌蛋白的亚细胞定位进行成像的操作步骤。

最新研究结果表明，非经典氨基酸（ncAAs）的引入 通过 GCE 结合含四嗪染料的生物正交标记，是一种用于选择性标记和可视化细菌分泌蛋白及其在宿主中成像分析的有效技术。本文旨在为希望利用 GCE 进行超分辨率成像以研究细菌和病毒中多种生物学过程以及宿主-病原体相互作用的研究人员提供一个简明清晰的实验方案。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

细菌感染长期以来一直被视为对人类健康的重大威胁。病原体利用高度进化、极为强大且复杂的防御系统，以及多种细菌毒力因子（称为效应蛋白），来逃避宿主的免疫应答并建立感染1,2。然而，由于缺乏合适的方法直接追踪在发病过程中宿主细胞内关键的蛋白质组分和效应蛋白，这些系统的分子机制以及各个效应蛋白的具体作用在很大程度上仍不清楚。

一个典型的例子是 肠道沙门氏菌 血清型鼠伤寒沙门氏菌，可引起急性胃肠炎。 沙门氏菌 鼠伤寒沙门氏菌利用III型分泌系统（T3SS）将多种效应蛋白直接注入宿主细胞。一旦 沙门氏菌 进入宿主细胞后，它存在于一个酸性的膜结合区室中，称为 沙门氏菌含沙门氏菌的空泡（SCV）3,4SCV的酸性pH激活了 沙门氏菌 2型致病岛（SPI-2）编码的III型分泌系统（T3SS），并将20种或更多的效应蛋白穿过液泡膜转运至宿主细胞质中5,6,7,8在宿主细胞内，这些复杂的效应蛋白混合物协同调控宿主细胞的信号通路，导致从液泡膜沿微管延伸出高度动态且结构复杂的管状膜结构，称为 沙门氏菌诱导的细丝结构（SIFs），可促进 沙门氏菌 在宿主细胞内存活并复制9,10,11.

可视化、追踪和监测细菌效应蛋白在宿主细胞内的定位及其运输过程和相互作用的方法，为深入理解细菌致病机制提供了关键见解。在宿主细胞内对沙门氏菌（Salmonella）分泌的III型分泌系统（T3SS）效应蛋白进行标记和定位已被证明是一项技术挑战12,13；然而，遗传编码荧光蛋白的发展极大地提升了我们在活体系统中研究和观察蛋白质的能力。但是，荧光蛋白的尺寸（约25–30 kDa）15通常与目标蛋白（POI）相当甚至更大（例如，SsaP为13.65 kDa，SifA为37.4 kDa）。事实上，用荧光蛋白标记效应蛋白常常会阻断标记效应蛋白的分泌，并堵塞T3SS14。

此外，荧光蛋白稳定性较差，在发生光漂白前发射的光子数量较少，限制了其在超分辨率显微技术中的应用16,17,18，尤其是在光激活定位显微镜（PALM）、STORM 和受激发射损耗（STED）显微镜中。尽管有机荧光染料的光物理性质优于荧光蛋白，但诸如 CLIP/SNAP 等方法/技术19,20分裂型绿色荧光蛋白21，ReAsH/FlAsH22,23，以及 HA 标签24,25 需要额外的蛋白质或肽类附属基团，这可能会通过干扰翻译后修饰或转运过程，影响目标效应蛋白的结构与功能。另一种可最大限度减少必要蛋白质修饰的方法是通过遗传密码子扩展技术（GCE），在翻译过程中将非天然氨基酸（ncAAs）引入目标蛋白（POI）。这些非天然氨基酸本身具有荧光特性，或可通过化学修饰产生荧光 通过 点击化学12,13,26,27,28.

利用遗传密码子扩展技术（GCE），可在目标蛋白的几乎任何位置引入带有微小、功能性且生物正交基团（例如叠氮基、环丙烯基或环辛炔基）的非天然氨基酸（ncAA）。在此策略中，将目标蛋白基因的特定位点上的天然密码子替换为稀有密码子，例如琥珀（TAG）终止密码子。随后，在细胞中与正交的氨酰-tRNA合成酶/tRNA配对系统共同表达该修饰后的蛋白。tRNA合成酶的活性位点被设计为仅识别一种特定的ncAA，并将其共价连接至识别琥珀密码子的tRNA的3'端。该ncAA只需添加至培养基中，但必须被细胞摄取并进入细胞质，以便氨酰-tRNA合成酶（aaRS）将其连接到正交tRNA上，随后在指定位置整合到目标蛋白（POI）中（见图1）12。因此，GCE能够实现多种生物正交反应基团（如酮基、叠氮基、炔基、环辛炔基、反式环辛烯基、四嗪基、降冰片烯基、α, β-不饱和酰胺基以及双环[6.1.0]壬炔基）在POI上的位点特异性插入，有望克服传统蛋白质标记方法的局限性12,26,27,28。

近年来，超分辨率成像技术的新兴趋势为在分子水平上研究生物结构开辟了新的途径。特别是STORM（随机光学重建显微镜）作为一种基于单分子定位的超分辨率成像技术，已成为可视化细胞结构（分辨率可达约20-30 nm）的宝贵工具，能够逐个分子地研究生物过程，从而揭示在传统基于群体平均的研究中尚未发现的细胞内分子功能13。单分子与超分辨率技术要求使用具有高亮度和光稳定性的有机荧光染料作为小分子标签，以实现最佳分辨率。我们近期已证明，遗传密码子扩展技术（GCE）可用于引入适用于超分辨率成像的合适探针12。

细胞蛋白标记的最佳选择之一是二环[6.1.0]壬炔赖氨酸（BCN）和反式环辛烯赖氨酸（TCO；如下所示） 图1），可通过tRNA/合成酶配对的一种变体进行基因编码（此处称为tRNAPyl/PylRSAF），其中Pyl代表吡咯赖氨酸，AF代表一种合理设计的双突变体（Y306A，Y384F），源自 Methanosarcina mazei 天然编码吡咯赖氨酸12,29,30,31通过应变促进的逆电子需求狄尔斯-阿尔德环加成反应（SPIEDAC），这些氨基酸可与四嗪偶联物发生化学选择性反应（图1)12,30,31这类环加成反应速度极快，且与活细胞相容；若将适当的荧光团修饰上四嗪基团，则该反应还可具备荧光启动特性。12,26,32本文介绍了一种利用基因密码子扩展技术（GCE）监测细菌效应蛋白向宿主细胞递送动态的优化实验方案，随后结合dSTORM技术对分泌蛋白在HeLa细胞中的亚细胞定位进行分析。结果表明，引入非天然氨基酸（ncAA） 通过 GCE 结合带有荧光原的四嗪染料进行点击反应，是一种用于选择性标记、可视化分泌蛋白以及后续在宿主细胞内进行亚细胞定位的通用方法。然而，此处详述的所有组分和步骤均可根据需要进行调整或替换，从而使 GCE 系统能够适用于探究其他生物学问题。

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方案

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1. 质粒构建

  1. 将表达目标蛋白的基因克隆至表达质粒中（例如 pET28a-sseJ10TAG）以表达目的蛋白（POI） E. coli BL21 (DE3)。此步骤有助于确定突变体是否具有功能。 
  2. 用于可视化 沙门氏菌 宿主细胞中的分泌效应因子，构建表达质粒（pWSK29-sseJ-HA），在天然启动子控制下表达目标POI SseJ，如先前报道所述7,12,24. 通过定点诱变，将 SseJ（pWSK29-）中的苯丙氨酸-10 密码子替换为琥珀终止密码子（TAG）sseJ10TAG-HA），确保 AAT-TAG-ACT 模序33,34.
  3. 除了上述质粒外，为将反式环辛-2-烯-L-赖氨酸（TCO*A）遗传编码至目标蛋白（POI），需使用另一种表达质粒（pEVOL-PylRS-AF）31 含有进化后的tRNA/合成酶配对（tRNAPyl/PylRSAF 质粒pEVOL中编码的基因
    注意：质粒和克隆实验方案的详细描述见于先前的报告30,31.
  4. 使用市售质粒提取试剂盒制备高质量质粒DNA。纯化后的DNA，其最佳260/280比值约为1.8。必要时，可通过1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度。

2. 细菌培养物的制备

  1. 获得双转化子以验证突变体在 E. coli 中的功能性
    1. 从 -80 °C 取出 BL21 感受态细胞，在冰上解冻约 20–30 分钟。
    2. 取每种质粒 1–5 μL（约 50 ng 的 pEVOL-PylRS-AF 和 pET28a-sseJ10TAG）加入 1.5 mL 微离心管中的 200 μL 化学感受态 BL21 细胞中。轻轻混匀感受态细胞与质粒混合物，在冰上孵育 30 分钟。
    3. 将微离心管置于 42 °C 水浴中热激 45 秒，然后放回冰上 2 分钟。
    4. 向微离心管中加入 1 mL 预热的 LB 培养基，并迅速将混合物转移至 15 mL 锥形管中。在 37 °C、250 rpm 摇床中孵育 1 小时。将部分或全部转化后的细胞涂布于含适当抗生素的 LB 琼脂平板上，于 37 °C 过夜培养。
      注：本实验方案中，分别使用 35 µg/mL 氯霉素和 50 µg/mL 卡那霉素筛选 pEVOL-PylRS-AF 和 pET28a-sseJ10TAG。在转化步骤中，应使用阴性对照和阳性对照评估转化是否成功。
  2. 将突变体转入 Salmonella，用于在宿主细胞中可视化 Salmonella 分泌效应蛋白：
    1. 在预冷的微离心管中，向 40–60 µL 电感受态 Salmonella Typhimurium 菌株 14028s 中各加入 2–3 µL 的 pEVOL-PylRS-AF 和 pWSK29-sseJ10TAG。用移液器轻轻混匀。
    2. 将电转化混合物转移至预冷（电极间隙 0.2 cm）的比色皿中；设置电转化参数为 2.5 kV, 200 Ω, 25 µF。将比色皿放入电转化仪腔室中，确保腔室电极与微脉冲比色皿紧密接触。
    3. 按下并按住 脉冲 按钮直至发出蜂鸣声。
    4. 立即向比色皿中加入 1 mL 预热的 LB 培养基，将全部内容物转移至 15 mL 锥形管中。在 37 °C、250 rpm 摇床中孵育 1 小时。
    5. 将部分或全部 Salmonella 电转化混合物涂布于含适当抗生素的 LB 琼脂平板上，于 37 °C 过夜培养。
      注：本实验方案中，分别使用 35 µg/mL 氯霉素和 100 µg/mL 氨苄青霉素筛选 pEVOL-PylRS-AF 和 pWSK29-sseJ10TAG。
  3. 培养物制备
    1. 挑取单个 Salmonella 或 E. coli 菌落接种于 5 mL 含适当抗生素的 LB 培养基中，于 37 °C、250 rpm 振荡培养过夜。

3. 含非天然氨基酸蛋白质的表达与荧光标记

  1. 表达含非天然氨基酸（ncAA）的蛋白质 E. coli
    1. 将100 µL原代培养物转移至5 mL含有35 µg/mL氯霉素和50 µg/mL卡那霉素的LB培养基中（1:50稀释），随后在37 °C、250 rpm振荡条件下培养至OD600 达到 0.4–0.6。
    2. 配制1 mM TCO*A储备液（10 mL； 表1).
    3. 当培养物达到 OD600 = 0.4–0.6 时，将 LB 培养基更换为含有 1 mM TCO*A、35 µg/mL 氯霉素和 50 µg/mL 卡那霉素的新鲜 LB 培养基。
      注意：或者，可按照步骤 5.4.2 中所述方法制备 TCO*A 储存液。
    4. 在含有1 mM IPTG和0.2%阿拉伯糖的条件下诱导蛋白表达，于34 °C、250 rpm振荡培养过夜。将菌体细胞于11,000 × g离心5分钟收集菌体。 g. 去除上清液，将沉淀物在 -20 °C 冻存，以备后续使用。
    5. 作为对照实验，重复相同的实验，但在不含非天然氨基酸（ncAA）的条件下表达携带非天然氨基酸的蛋白质。对于 体外 含非天然氨基酸蛋白质的荧光标记 E. coli，遵循步骤 3.3 中所述的详细操作流程。
  2. 表达含非天然氨基酸蛋白质 沙门氏菌
    1. 将100 µL原代培养物转移至5 mL含35 µg/mL氯霉素和100 µg/mL氨苄青霉素的LB培养基中（1:50稀释），随后在37 °C、250 rpm振荡培养至OD600 达到 0.6。
    2. 制备改良的N-最小培养基（MgM，pH 5.6），具体方法如下所述 表1.
    3. 用添加了1 mM TCO*A的改良N-最小培养基（MgM）替换LB培养基表1在34 °C下培养细菌30分钟。然后加入0.2%阿拉伯糖、25 mg/mL氯霉素和100 mg/mL氨苄青霉素，继续在250 rpm振荡条件下培养细胞6小时。
    4. 6小时后，用新鲜的MgM（pH 5.6）培养基，在30分钟的时间间隔内洗涤细菌4次（表1）而不含 ncAA。在洗涤步骤中，使用 972 × g 室温下孵育15分钟。
    5. 离心收集细菌，重悬于1×PBS缓冲液中，4 °C避光孵育1小时，以去除多余的非天然氨基酸（ncAAs）。孵育1小时后，在3,000 × g4 °C 下孵育 15 分钟，保存以备后续使用。
    6. 作为对照实验，在不添加非天然氨基酸（ncAA）的情况下，重复相同的实验以表达携带非天然氨基酸的蛋白质。
  3. 体外 含非天然氨基酸蛋白质的荧光标记 沙门氏菌 Typhimurium
    1. 重悬 沙门氏菌 在不含或含有TCO*A（来自步骤3.2）的1×PBS中表达SseJ-F10TCO-HA的细胞。调整OD600 加入 PBS 至 4，于 37 °C 避光孵育细胞，同时加入 20 µM Janelia Fluor 646-tetrazine (JF646-Tz) 或 20 µM BDP-Fl-tetrazine（DMSO 中 5 mM 储液），并在 250 rpm 条件下振荡孵育 1–2 小时。
    2. 离心收集细胞，用含有5% DMSO和0.2% Pluronic F-127的PBS洗涤3–4次，重悬于含5% DMSO的PBS中，4 °C避光孵育过夜。再用1× PBS洗涤2次。在洗涤步骤中，使用972 × g室温下孵育15分钟。
    3. 立即使用共聚焦显微镜对细胞进行成像，或在避光条件下于室温用含1.5%多聚甲醛（PFA）的PBS固定30–45分钟。
    4. 用 PBS 洗涤固定后的细胞 2 次，最后用 50 mM NH₄Cl 洗涤4用 PBS 中的 Cl 处理 15 分钟，以去除多余的 PFA。将细胞重悬于 PBS 中，置于 4 °C 保存，时间不超过 3–4 天。按照第 6 节所述方法，使用共聚焦显微镜对细菌进行成像。

4. 含非天然氨基酸蛋白质的生化表征

  1. 细胞裂解
    1. 将第3.1节中的细胞用裂解缓冲液（表1）重悬，在室温下孵育超过30分钟。然后将混合物置于冰上冷却15分钟。
      注意：保持所用裂解缓冲液体积与细胞重量的比例为1:10。
    2. 在冰上对重悬的细胞进行超声处理。使用超声破碎仪（参见材料表），在7档设置下至少进行6次、每次30秒的脉冲处理，每次间隔1分钟。
    3. 将细胞裂解液在20,500 × g、4 °C条件下离心15分钟（维持4 °C至关重要）。将上清液转移至新离心管中，弃去沉淀。
  2. SDS-PAGE分析
    1. 配制5x SDS上样缓冲液（表1）。向13 µL细胞裂解液中加入5 µL SDS凝胶上样缓冲液。在2 mL离心管中用十二烷基硫酸钠（SDS）样品缓冲液于95 °C变性10分钟，随后以2,000 × g离心50秒，将样品上样至12% SDS聚丙烯酰胺凝胶。
    2. 组装凝胶夹心装置，将其放入电泳槽中，并将电泳装置连接至电源。加入电泳缓冲液，上样蛋白分子量标记物和蛋白样品，在100 V电压下电泳，直至溴酚蓝迁移至分离胶底部。
      注意：应立即开始分析，因为储存于-20 °C的裂解液在每次冻融循环后易发生质量下降。
    3. 用考马斯亮蓝蛋白染色液对凝胶进行染色。

5. 生物正交标记  沙门氏菌 海拉细胞中分泌的效应蛋白 SseJ-F10TCO-HA

  1. 在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养并维持 HeLa 细胞2，以及在含高糖（4.5 g/L）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，添加10%（v/v）胎牛血清（FBS）和青霉素-链霉素（1×），并在95%湿度条件下培养。
  2. 感染前一天培养细菌。接种单个菌落 沙门氏菌 14028s 菌株携带 pEVOL-PylRS-AF 和 pWSK29-sseJ在含抗生素的标准LB肉汤中，37 °C、250 rpm振荡培养过夜。
  3. 1天前接种HeLa细胞以备感染。取一个T-75培养瓶，其中HeLa细胞密度经显微镜观察确认约为80%汇合度。 用预热的 PBS 洗涤细胞。加入 3 mL 预热的 0.25% 胰蛋白酶/EDTA，于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 5 分钟以消化细胞2.
    1. 用 2 mL DMEM（含 10% FBS）终止胰蛋白酶反应。重悬细胞后，将培养瓶中的全部内容转移至 15 mL 离心管中。在 1,000 × g 5 分钟后，取出试管中的上清液。用预热的培养基重悬 HeLa 细胞沉淀。
    2. 使用血细胞计数板检查悬液并计数其中的细胞。制备浓度为 1 × 105 细胞/mL。接种 0.5 × 105 八孔细胞培养板每孔接种HeLa细胞，加入500 µL DMEM + 10% FBS培养基。将培养板置于37 °C、5% CO₂的培养箱中培养2，95% 湿度下培养 24 小时。
  4. 细菌感染
    1. 传代培养 沙门氏菌 14028s 菌株携带 pEVOL-PylRS-AF 和 pWSK29-sseJ10TAG，即将5.2步中过夜培养的菌液100 µL加入含35 µg/mL氯霉素和100 µg/mL氨苄青霉素的3 mL LB培养基中（1:30稀释），于37 °C、250 rpm振荡培养5–7小时。
      注意：在此阶段，菌群达到对数生长后期，细菌具有高度侵袭性。
    2. 配制100 mM TCO*A储备液及完全培养基（表1).
    3. 为启动HeLa细胞感染，从培养箱中取出HeLa细胞，用预热的DPBS洗涤细胞，然后向每孔加入500 μL新鲜DMEM（+10% FBS）。将培养 Chamber 载玻片放回CO₂培养箱中。2 孵育箱中孵育，直至感染开始。
    4. 孵育5–7小时后，稀释 沙门氏菌 培养至 OD600 = 0.2，溶于1 mL DMEM培养基中（约3 × 108 cfu/mL）。加入所需量的 沙门氏菌 在腔室载玻片的每个孔中加入接种物，使感染复数（MOI）为100。
    5. 将感染的细胞在 CO₂ 培养箱中孵育2 37°C 培养箱中孵育 30 分钟。用预热的 DPBS 洗涤细胞 3 次，以去除细胞外残留物 沙门氏菌将此时间点设为感染后0小时。加入500 µL完全培养基（表1) 加入含 100 μg/mL 庆大霉素的溶液，孵育 1 小时。孵育 1 小时后，用 DPBS 洗涤细胞 3 次。加入 500 μL 完全培养基（来自步骤 5.4.2； 表1加入含0.2%阿拉伯糖、10 μg/mL庆大霉素的培养基至腔室载玻片的每个孔中。
    6. 在对照实验中，对HeLa细胞进行类似的感染，但不使用TCO*A。
    7. 将培养腔载玻片在 CO₂ 培养箱中孵育 10 小时2 培养箱
  5. 基于点击化学的活细胞标记
    1. 继续标记感染细菌的细胞。将不含 TCO*A 的完全培养基预热。表1).
    2. 感染后10小时，将完全培养基更换为不含TCO*A的新鲜完全培养基，并用预热的DPBS每30分钟洗涤HeLa细胞一次，共洗涤4次，随后更换为新鲜的完全培养基（不含TCO*A）。
    3. 在DMSO中配制0.5 mM染料四嗪储备液。
      注意：用于标记 沙门氏菌 在宿主细胞中检测分泌效应分子，提供了两种实验方案。方案1：通过将JF646-Tz储备液用含1%牛乳酪蛋白钠盐的1×PBS稀释，配制染料混合液，使终浓度为2 µM。方案2：准备预热的完全培养基（不含FBS和TCO*A），加入JF646-Tz至终浓度为2 µM。每次标记实验均需新鲜配制该染料混合液。操作过程中应尽量避光（可调暗生物安全柜或实验室内灯光）。
    4. 感染后12小时，吸去细胞培养液，用预热的DPBS洗涤细胞2至3次。在其中一组孔中加入500 μL步骤5.5.3及后续注释中所述方案1的染料溶液混合物，在同一腔室载玻片的另一组孔中加入500 μL方案2的染料溶液混合物。将腔室载玻片放回CO2 孵育箱中孵育1.5–2小时。
    5. 感染后13.5–14小时，用预热的DPBS冲洗HeLa细胞2次。加入500 μL新鲜DMEM（含FBS）。将培养腔载玻片放回培养箱中孵育30分钟。用预热的DPBS洗涤细胞，随后在30分钟间隔内用新鲜DMEM洗涤4次。
    6. 感染后16小时，通过向每孔加入200 μL 4% PFA，在室温避光条件下孵育10分钟，固定HeLa细胞。吸除PFA，用PBS洗涤3次，将细胞置于PBS中，于4 °C避光保存。
      ​注意：PFA 是一种高毒性化学物质，避免吸入以及与皮肤和眼睛接触。操作时应佩戴防护装备。为防止标记样本暴露于光照，请关闭细胞培养操作台内的照明。
  6. HA标签蛋白的免疫染色
    1. 吸去 PBS，用封闭液冲洗一次（表1).
    2. 将固定的HeLa细胞与基于PBS的一抗溶液孵育（表1在室温避光条件下孵育1小时。使用兔抗HA一抗（1:500稀释）对分泌的SseJ进行染色。
    3. 孵育1小时后，用0.5 mL 0.1% Tween-20/1×PBS 轻柔洗涤细胞2次。在Tween/PBS溶液洗涤过程中，将细胞在0.1% Tween-20/1×PBS中孵育3次，每次0.5 mL，每次5分钟。
    4. 将二抗驴抗兔555按1:500比例溶于二抗稀释液中，室温避光孵育1小时。
    5. 孵育1小时后，用0.5 mL 0.1% Tween-20/1x PBS轻柔洗涤细胞2次，每次再分别加入0.5 mL 0.1% Tween-20/1x PBS，孵育5分钟，共重复2次。
    6. 用 0.5 mL 1×PBS 洗涤细胞 3 次，避光保存于 4 °C。
      注意：固定后的细胞可在 4 °C 的 PBS 中保存数周。免疫染色应于使用前即时进行。

6. 共聚焦成像

  1. 使用共聚焦显微镜，例如转盘式（SD）或STED显微镜。
    1. 调整图像采集设置，例如扫描模式（XYZ）、扫描速度（400 Hz）、分辨率（512 × 512）、放大倍数（100×）以及Z轴层扫。
    2. 为DAPI、BDP-Tz和JF646四嗪选择正确的激发/发射滤光片。
      ​注意：在本实验方案中，共聚焦成像在配备脉冲白光激光器的STED显微镜系统上进行，该系统允许在470–670 nm范围内选择激发波长，并配有用于405 nm、488 nm和647 nm激发的紫外405 nm二极管激光器。通过共聚焦系统的内置声光分束器与基于棱镜的可调多波段光谱检测相结合，设置相应的发射波长范围。
    3. 使用100×/1.4油浸物镜采集图像。

7. 超分辨率（dSTORM）成像

  1. 在成像前3小时开启显微镜，使其达到热平衡状态（如果在热平衡前开始成像，则更容易发生漂移）。将相机冷却至-70 °C。
  2. 同时，配制新鲜的GLOX-BME成像缓冲液（表1）。
  3. 将细胞转移至显微镜处。将成像腔室放置在显微镜载物台的样品 holder 中。在 holder 中确保样品平整且固定牢固。用0.4 mL新配制的GLOX-BME成像缓冲液替换孔中的培养基。
  4. 设置正确的激光谱线和滤光片组。将激光功率降低至约1 mW，以识别感兴趣的HeLa细胞。在使用低强度647 nm激光照射样品的同时，调整焦平面和激光束角度（建议采用陡倾角照明模式[HILO]，因为HILO可提高信噪比[SBR]）。调节HILO照明角度。
    注：在本实验方案中，SseJ的超分辨率成像通过倒置落射荧光显微镜（见材料表）在Alexa Fluor 647通道中完成，该显微镜配备TIRF物镜（100倍Apo TIRF油浸物镜，NA 1.49）。荧光信号由EMCCD相机检测，并通过μManager软件控制。
  5. 在μManager中将前置放大器增益设为3，并启用帧转移功能。为提高dSTORM测量的灵敏度，将EM增益设为200，如先前报道所述35。
  6. 在进行dSTORM成像前，先采集目标结构的参考衍射极限图像。通过将激光调至最大功率，使荧光分子进入暗态。
    注：如先前所述36，当JF646荧光染料在持续647 nm激发光照射下主要转化为暗态时，可观察到单个快速闪烁的JF646分子。
  7. 调节激光强度至适当水平，使闪烁事件在空间和时间上相互分离，将曝光时间设为30 ms，然后开始数据采集。共采集10,000–30,000帧。
    注：应调整激光强度以优化闪烁效果。若检测到过多事件（闪烁粒子重叠），可考虑提高激光强度。理想采集帧数取决于样品质量，但约10,000帧通常已能呈现可辨识的结构特征。

dSTORM 图像重建

  1. 使用适当的软件进行图像分析。
    注意：下文简要介绍 ThunderSTORM，它是众多可用的开源图像重建程序之一。
  2. 打开 ImageJ 并导入原始数据。打开 ThunderSTORM 插件，并根据所用设备配置相机设置。
  3. 转到 运行分析，设置适当的参数，例如图像滤波（均值滤波之差）、定位方法（局部最大值）以及分子的亚像素定位（积分高斯点扩散函数）。点击 确定 开始图像重建。
    注意：如有需要，ThunderSTORM 中参数设置的详细说明已有文献描述37。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案论文描述了一种基于GCE的方法，用于位点特异性的荧光标记与可视化 沙门氏菌 分泌效应分子，如图所示 图1. 含有反式环辛烯生物正交基团（TCO）的非天然氨基酸（ncAA）及荧光染料的化学结构如图所示 图1ASseJ 标记通过在琥珀终止密码子处基因编码生物正交非天然氨基酸实现（参见 图1B使用正交的氨酰-tRNA合成酶/tRNA配对 通过 GCE 技术。将 TCO 标记的效应分子与含有荧光团的四嗪（JF646-Tz 或 BDP-Tz）处理，提供了一种替代的蛋白质标记策略，从而实现了对转位蛋白的观察 沙门氏菌 分泌效应蛋白在感染宿主数小时后图1B,C我们首先通过鉴定可能的氨基酸残基，并基于表面可及性及对SseJ功能残基的已有认知，选择SseJ的第1...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文所述方法用于追踪细菌III型分泌系统（T3SS）在感染后将效应蛋白注入宿主细胞内的精确定位。胞内病原体如Salmonella、Shigella和Yersinia利用T3SS将毒力组分转运至宿主细胞内。超分辨率成像技术的发展使得以此前难以想象的分辨率观察毒力因子成为可能12,13,24。然而，某些标记限制阻碍了更深入的研究，因为光激活蛋白融合体会阻塞T3SS通道且无法被分泌。此外，某些融合蛋白本身具有聚集或形成聚集体的倾向，可能导致聚类假象和错误分析结果。

在某些情况下，融合蛋白也会被切割，这一点我们此前在PAmCherry-SsaP12,13中已观察到。所有这些限制均可通过遗传密码子扩展技术（GCE）克服，该技术可实现目标蛋...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作得到了德克萨斯大学医学分部（美国德克萨斯州加尔维斯顿）的启动资金以及授予 L.J.K. 的德克萨斯州 STAR 奖项的支持。我们感谢 Edward Lemke 教授（欧洲分子生物学实验室，德国海德堡）提供质粒 pEVOL-PylRS-AF。 图 1 中的图像使用 BioRender 软件绘制。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10x Tris/Glycine SDS 电泳缓冲液BIO-RAD1610732
氯化铵Fischer ScientificA661-500
硫酸铵Fischer ScientificBP212R-1
氨苄青霉素钠Sigma-AldrichA01665 g
抗生素-抗真菌剂（100x）ThermiFischer Scientific15240096
阿拉伯糖Sigma-AldrichA3256500 g
Avanti J-26XP（高性能离心机）Beckman Coulter
Bacto-AgarBD Diagnostics, Franklin Lakes, USA214010
BDP-FL-四嗪Lumiprobe (USA)2.14E+02
β-巯基乙醇Millipore444203250 mL
溴酚蓝Sigma-AldrichB8026
BSASigma-AldrichA4503500 g
酪蛋白Sigma-AldrichC8654
过氧化氢酶Sigma-AldrichC9322
氯霉素Sigma-AldrichC1919
点击氨基酸 / 反式-环辛-2-烯 – L - 赖氨酸（TCO*A）SiChem GmbHSC-8008规格：500 mg
DAPI（Hoechst33342）InvitrogenH3570
DeNovix DS-11+ 分光光度计DeNovix
DMEM*Corning10-013-CV* 用于维持 HeLa 细胞
DMEM**Gibco11965-092**用于在非天然氨基酸（ncAA）存在下进行细菌感染，见第 5.4 节。
DMSOSigma-AldrichD8418250 g
驴抗兔 Alexa Fluoro555 二抗InvitrogenA-31572
DPBS, 1xCorning21-031-CV
大肠杆菌 BL21 (DE3) 菌株Novagen (Madison, WI)
EMCCD 相机AndoriXon Ultra 897-BV
Eppendorf Safe-Lock 管 1.5 mL（PCR 级洁净）Eppendorf, Hamburg, Germany30123.328
胎牛血清（FBS）Fischer10082147
Fisherbrand 注射器滤器 - 无菌（PVDF 0.22 µm）Fischer Scientific97203每包 100 个
Gene Pulser Xcell 电穿孔仪BIO-RAD1652660
庆大霉素Sigma-AldrichG127210 mL
Gibco L-谷氨酰胺（200 mM），100xFischer Scientific25-030-081
葡萄糖氧化酶Sigma-AldrichG7141-50KU
甘油Fischer ScientificBF229-4
HeLa 细胞ATTCCCL-2
HEPES 缓冲液Corning25-060-C1100 mL
盐酸Fischer ScientificA144-212
ImageJ图像处理与分析：  http://rsbweb.nih.gov/ij
IntantBlueExpedeonISB1L基于考马斯亮蓝的染色剂
异丙基 β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）Sigma-AldrichI5502
Janelia Fluoro 646-四嗪Tocris Bioscience7279
卡那霉素Sigma-Aldrich606155 g
LB 肉汤BD Difco244620500 g
溶菌酶Sigma-AldrichL6876
μManager (v. 1.4.2)https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release
MESSigma-AldrichM3671250 g
微量电穿孔杯BIO-RAD165-2086电极间隙 0.2 cm，每包 50 个
Nikon N-STORMNikon Instruments Inc.https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution
Nunc EasYFlask 细胞培养瓶ThermiFischer Scientific156499
Omnipur 氨基酸水解物Calbiochem2240500 g
多聚甲醛（PFA）Electron Microscopy Sciences 15710
PBS（10x）Roche11666789001
青霉素-链霉素溶液（100x）GenDEPOT CA005-010100 mL
pEVOL-PylRS-AF质粒构建与图谱参见以下参考文献
1. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81.
2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70.
质粒小提试剂盒Qiagen27106
质粒 pWSK29-sseJ10TAG-HA参考文献：elife. 2021, 10, e67789.
质粒 pWSK29-sseJ-HA参考文献：elife. 2021, 10, e67789.                                                                   PWSK29 载体图谱：https://www.addgene.org/172972/
Pluronic F-127Millipore540025蛋白级，10% 溶液
磷酸二氢钾Fischer ScientificP285-500
硫酸钾Acros Organic424220250
蛋白酶抑制剂混合物套装 I - CalbiochemSigma-Aldrich539131100x 溶液
兔抗 HA 一抗Sigma-AldrichH6908
鼠伤寒沙门氏菌血清型 14028s参考文献：PLoS Biol. 2015, 13, e1002116.
皂苷Sigma-Aldrich47036-50G-F
十二烷基硫酸钠（SDS）Sigma-AldrichL3771
氢氧化钠Fischer ScientificSS255-1
丙酮酸钠（100 mM），100xCorning25-060-C1100 mL
Sonic Dismembrator Model 100Fischer Scientific24932
STED 显微镜（Leica TCS SP8 STED 3X 系统）Leica Microsystems, Wetzlar, Germanyhttps://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/
ThunderSTORMhttps://zitmen.github.io/thunderstorm/
Trizma BaseSigma-AldrichT1503
胰蛋白酶-EDTA（1x），0.25%  GenDEPOT CA014-010
Tween-20Sigma-AldrichP9416100 mL
X-well 组织培养腔室载玻片SARSTEDT94.6190.802

参考文献

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