方法文章

利用遗传密码子扩展技术对细菌分泌蛋白进行超分辨率成像

DOI：

10.3791/64382

⸱

2023年2月10日

 , 
1Biochemistry & Molecular Biology, University of Texas Medical Branch

本文内容

摘要

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本文提供了一种简单明了的实验方案，利用遗传密码子扩展技术（GCE）对Salmonella分泌的效应蛋白进行位点特异性标记，并通过直接随机光学重建显微镜（dSTORM）在HeLa细胞中成像观察分泌蛋白的亚细胞定位。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

III型分泌系统（T3SSs）使革兰氏阴性细菌能够将一系列效应蛋白直接注入真核宿主细胞的细胞质中。进入细胞后，这些注入的效应蛋白协同调控真核细胞的信号通路并重编程细胞功能，从而促进细菌的侵入与存活。在感染过程中监测和定位这些分泌的效应蛋白，可为定义宿主-病原体相互作用的动态界面提供重要线索。然而，在不破坏其结构或功能的前提下，对宿主细胞内的细菌蛋白进行标记和成像在技术上具有挑战性。

构建荧光融合蛋白并不能解决这一问题，因为融合蛋白会堵塞分泌装置，因而无法被分泌。为了克服这些障碍，我们近期采用了一种利用遗传密码子扩展（GCE）技术对细菌分泌效应蛋白以及其他难以标记的蛋白质进行位点特异性荧光标记的方法。本文提供了一个完整的分步操作方案，用于通过GCE技术对沙门氏菌（Salmonella）分泌的效应蛋白进行位点特异性标记，随后介绍了在HeLa细胞中利用直接随机光学重建显微镜（dSTORM）对分泌蛋白的亚细胞定位进行成像的操作步骤。

最新研究结果表明，非经典氨基酸（ncAAs）的引入 通过 GCE 结合含四嗪染料的生物正交标记，是一种用于选择性标记和可视化细菌分泌蛋白及其在宿主中成像分析的有效技术。本文旨在为希望利用 GCE 进行超分辨率成像以研究细菌和病毒中多种生物学过程以及宿主-病原体相互作用的研究人员提供一个简明清晰的实验方案。

引言

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细菌感染长期以来一直被视为对人类健康的重大威胁。病原体利用高度进化、极为强大且复杂的防御系统，以及多种细菌毒力因子（称为效应蛋白），来逃避宿主的免疫应答并建立感染1,2。然而，由于缺乏合适的方法直接追踪在发病过程中宿主细胞内关键的蛋白质组分和效应蛋白，这些系统的分子机制以及各个效应蛋白的具体作用在很大程度上仍不清楚。

一个典型的例子是 肠道沙门氏菌 血清型鼠伤寒沙门氏菌，可引起急性胃肠炎。 沙门氏菌 鼠伤寒沙门氏菌利用III型分泌系统（T3SS）将多种效应蛋白直接注入宿主细胞。一旦 沙门氏菌 进入宿主细胞后，它存在于一个酸性的膜结合区室中，称为 沙门氏菌含沙门氏菌的空泡（SCV）3,4SCV的酸性pH激活了 沙门氏菌 2型致病岛（SPI-2）编码的III型分泌系统（T3SS），并将20种或更多的效应蛋白穿过液泡膜转运至宿主细胞质中5,6,7,

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方案

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1. 质粒构建

  1. 将表达目标蛋白的基因克隆至表达质粒中（例如 pET28a-sseJ10TAG）以表达目的蛋白（POI） E. coli BL21 (DE3)。此步骤有助于确定突变体是否具有功能。 
  2. 用于可视化 沙门氏菌 宿主细胞中的分泌效应因子，构建表达质粒（pWSK29-sseJ-HA），在天然启动子控制下表达目标POI SseJ，如先前报道所述7,12,24. 通过定点诱变，将 SseJ（pWSK29-）中的苯丙氨酸-10 密码子替换为琥珀终止密码子（TAG）sseJ10TAG-HA），确保 AAT-TAG-ACT 模序33,34.
  3. 除了上述质粒外，为将反式环辛-2-烯-L-赖氨酸（TCO*A）遗传编码至目标蛋白（POI），需使用另一种表达质粒（pEVOL-PylRS-AF）31 含有进化后的tRNA/合成酶配对（tRNAPyl/PylRSAF

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结果

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本方案论文描述了一种基于GCE的方法，用于位点特异性的荧光标记与可视化 沙门氏菌 分泌效应分子，如图所示 图1. 含有反式环辛烯生物正交基团（TCO）的非天然氨基酸（ncAA）及荧光染料的化学结构如图所示 图1ASseJ 标记通过在琥珀终止密码子处基因编码生物正交非天然氨基酸实现（参见 图1B使用正交的氨酰-tRNA合成酶/tRNA配对 通过 GCE 技术。将 TCO 标记的效应分子与含有荧光团的四嗪（JF646-Tz 或 BDP-Tz）处理，提供了一种替代的蛋白质标记策略，从而实现了对转位蛋白的观察 沙门氏菌 分泌效应蛋白在感染宿主数小时后图1B,C我们首先通过鉴定可能的氨基酸残基，并基于表面可及性及对SseJ功能残基的已有认知，选择SseJ的第1.......

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讨论

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本文所述方法用于追踪细菌III型分泌系统（T3SS）在感染后将效应蛋白注入宿主细胞内的精确定位。胞内病原体如Salmonella、Shigella和Yersinia利用T3SS将毒力组分转运至宿主细胞内。超分辨率成像技术的发展使得以此前难以想象的分辨率观察毒力因子成为可能12,13,24。然而，某些标记限制阻碍了更深入的研究，因为光激活蛋白融合体会阻塞T3SS通道且无法被分泌。此外，某些融合蛋白本身具有聚集或形成聚集体的倾向，可能导致聚类假象和错误分析结果。

在某些情况下，融合蛋白也会被切割，这一点我们此前在PAmCherry-SsaP12,13中已观察到。所有这些限制均可通过遗传密码子扩展技术（GCE）克服，该技术可实现目标蛋.......

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披露

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作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

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本工作得到了德克萨斯大学医学分部（美国德克萨斯州加尔维斯顿）的启动资金以及授予 L.J.K. 的德克萨斯州 STAR 奖项的支持。我们感谢 Edward Lemke 教授（欧洲分子生物学实验室，德国海德堡）提供质粒 pEVOL-PylRS-AF。 图 1 中的图像使用 BioRender 软件绘制。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10x Tris/Glycine SDS 电泳缓冲液BIO-RAD1610732
氯化铵Fischer ScientificA661-500
硫酸铵Fischer ScientificBP212R-1
氨苄青霉素钠Sigma-AldrichA01665 g
抗生素-抗真菌剂（100x）ThermiFischer Scientific15240096
阿拉伯糖Sigma-AldrichA3256500 g
Avanti J-26XP（高性能离心机）Beckman Coulter
Bacto-AgarBD Diagnostics, Franklin Lakes, USA214010
BDP-FL-四嗪Lumiprobe (USA)2.14E+02
β-巯基乙醇Millipore444203250 mL
溴酚蓝Sigma-AldrichB8026
BSASigma-AldrichA4503500 g
酪蛋白Sigma-AldrichC8654
过氧化氢酶Sigma-AldrichC9322
氯霉素Sigma-AldrichC1919
点击氨基酸 / 反式-环辛-2-烯 – L - 赖氨酸（TCO*A）SiChem GmbHSC-8008规格：500 mg
DAPI（Hoechst33342）InvitrogenH3570
DeNovix DS-11+ 分光光度计DeNovix
DMEM*Corning10-013-CV* 用于维持 HeLa 细胞
DMEM**Gibco11965-092**用于在非天然氨基酸（ncAA）存在下进行细菌感染，见第 5.4 节。
DMSOSigma-AldrichD8418250 g
驴抗兔 Alexa Fluoro555 二抗InvitrogenA-31572
DPBS, 1xCorning21-031-CV
大肠杆菌 BL21 (DE3) 菌株Novagen (Madison, WI)
EMCCD 相机AndoriXon Ultra 897-BV
Eppendorf Safe-Lock 管 1.5 mL（PCR 级洁净）Eppendorf, Hamburg, Germany30123.328
胎牛血清（FBS）Fischer10082147
Fisherbrand 注射器滤器 - 无菌（PVDF 0.22 µm）Fischer Scientific97203每包 100 个
Gene Pulser Xcell 电穿孔仪BIO-RAD1652660
庆大霉素Sigma-AldrichG127210 mL
Gibco L-谷氨酰胺（200 mM），100xFischer Scientific25-030-081
葡萄糖氧化酶Sigma-AldrichG7141-50KU
甘油Fischer ScientificBF229-4
HeLa 细胞ATTCCCL-2
HEPES 缓冲液Corning25-060-C1100 mL
盐酸Fischer ScientificA144-212
ImageJ图像处理与分析：  http://rsbweb.nih.gov/ij
IntantBlueExpedeonISB1L基于考马斯亮蓝的染色剂
异丙基 β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）Sigma-AldrichI5502
Janelia Fluoro 646-四嗪Tocris Bioscience7279
卡那霉素Sigma-Aldrich606155 g
LB 肉汤BD Difco244620500 g
溶菌酶Sigma-AldrichL6876
μManager (v. 1.4.2)https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release
MESSigma-AldrichM3671250 g
微量电穿孔杯BIO-RAD165-2086电极间隙 0.2 cm，每包 50 个
Nikon N-STORMNikon Instruments Inc.https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution
Nunc EasYFlask 细胞培养瓶ThermiFischer Scientific156499
Omnipur 氨基酸水解物Calbiochem2240500 g
多聚甲醛（PFA）Electron Microscopy Sciences 15710
PBS（10x）Roche11666789001
青霉素-链霉素溶液（100x）GenDEPOT CA005-010100 mL
pEVOL-PylRS-AF质粒构建与图谱参见以下参考文献
1. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81.
2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70.
质粒小提试剂盒Qiagen27106
质粒 pWSK29-sseJ10TAG-HA参考文献：elife. 2021, 10, e67789.
质粒 pWSK29-sseJ-HA参考文献：elife. 2021, 10, e67789.                                                                   PWSK29 载体图谱：https://www.addgene.org/172972/
Pluronic F-127Millipore540025蛋白级，10% 溶液
磷酸二氢钾Fischer ScientificP285-500
硫酸钾Acros Organic424220250
蛋白酶抑制剂混合物套装 I - CalbiochemSigma-Aldrich539131100x 溶液
兔抗 HA 一抗Sigma-AldrichH6908
鼠伤寒沙门氏菌血清型 14028s参考文献：PLoS Biol. 2015, 13, e1002116.
皂苷Sigma-Aldrich47036-50G-F
十二烷基硫酸钠（SDS）Sigma-AldrichL3771
氢氧化钠Fischer ScientificSS255-1
丙酮酸钠（100 mM），100xCorning25-060-C1100 mL
Sonic Dismembrator Model 100Fischer Scientific24932
STED 显微镜（Leica TCS SP8 STED 3X 系统）Leica Microsystems, Wetzlar, Germanyhttps://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/
ThunderSTORMhttps://zitmen.github.io/thunderstorm/
Trizma BaseSigma-AldrichT1503
胰蛋白酶-EDTA（1x），0.25%  GenDEPOT CA014-010
Tween-20Sigma-AldrichP9416100 mL
X-well 组织培养腔室载玻片SARSTEDT94.6190.802

参考文献

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  1. Marlovits, T. C., et al. Structural insights into the assembly of the type III secretion needle complex. Science. 306 (5698), 1040-1042 (2004).
  2. Kubori, T., et al. Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretio....

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III dSTORM

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