一种经口插管小鼠模型及通气肺缺血-再灌注手术

摘要

一种小鼠手术模型，可在维持通气并避免缺氧的情况下建立左肺缺血再灌注（IR）损伤。

摘要

缺血再灌注（IR）损伤通常由短暂中断血流的过程引起。在肺部，孤立的缺血再灌注允许在持续肺泡通气的条件下对这一特定过程进行实验研究，从而避免了缺氧和肺不张等叠加性损伤过程的干扰。在临床背景下，肺缺血再灌注损伤（也称为肺IRI或LIRI）可由多种过程引发，包括但不限于肺栓塞、复苏后的出血性创伤以及肺移植。目前针对LIRI的有效治疗手段十分有限。本文介绍一种可逆的肺IR外科模型，首先进行经口气管插管，随后实现单侧左肺缺血与再灌注，同时保持肺泡通气或气体交换功能。小鼠接受左侧开胸术，暴露并直视下分离左肺动脉，使用可松解的滑结对其进行压迫。在缺血期间关闭手术切口，并唤醒动物后拔除气管插管。小鼠在自主呼吸状态下，通过松解肺动脉周围的滑结来实现再灌注。这一具有临床相关性的存活模型可用于评估肺IR损伤本身、损伤消退阶段、对肺功能的后续影响，以及结合实验性肺炎的二次打击模型。尽管该模型技术难度较高，但在数周至数月的训练后即可掌握，最终可达到80%–90%的存活率或成功率。

引言

缺血再灌注（IR）损伤可能在器官或组织血流中断一段时间后恢复供血时发生。在肺部，缺血再灌注可单独发生，也可与其他损伤性过程共同发生，例如感染、缺氧、肺不张、容积伤（机械通气时潮气量过高）、气压伤（机械通气时峰压或持续压力过高）或钝性（非穿透性）肺挫伤。^1,2,3关于LIRI的机制以及并发过程（如感染）对LIRI结局的影响，目前仍存在若干知识空白，且LIRI的治疗选择也十分有限。 体内 需要建立单纯的肺缺血再灌注损伤（LIRI）模型，以独立研究肺IR损伤的病理生理机制，并探讨其在肺损伤作为组成部分的多因素致伤过程中的作用。

小鼠肺缺血再灌注模型可用于研究包括肺移植在内的多种过程的肺部特异性病理生理机制³肺栓塞⁴以及复苏后出血性创伤所致的肺损伤⁵目前使用的小鼠模型包括手术肺移植⁶，肺门阻断⁷, 离体 肺灌注⁸，以及通气肺IR⁹. ....

方案

以下所述的所有操作步骤均已获得加州大学旧金山分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。可使用任何小鼠品系，但某些品系相较于其他品系具有更强的肺缺血-再灌注（IR）炎症反应¹²。约12至15周龄（30–40 g）或更年长的小鼠相较于年轻小鼠更能耐受肺IR手术并具有更高的存活率。雄性和雌性小鼠均可用于此类手术。

1. 小鼠插管操作方案

1. 麻醉与插管准备
   1. 用乙醇棉片擦拭小鼠腹部。通过腹腔注射三溴乙醇（250–400 mg/kg）对小鼠进行麻醉。通过检查足底回缩反射是否消失来评估麻醉深度。现在或稍后（步骤 2.1.4）涂抹眼用润滑软膏。
      注意：在此操作中，三溴乙醇（以及依托咪酯作为替代选项）可提供稳定的麻醉平面，且不会影响本手术所需的血流动力学状态。该麻醉剂仅使用一次，以避免腹腔粘连的风险。异氟烷也可使用，但本实验中未采用。操作者可根据需要选择合适的麻醉方案。
   2. 将麻醉后的小鼠仰卧位放置于插管架或塑料支撑物上，通过上切牙悬挂于两个固定锚点之间的环形4-0缝线（丝线或其他材质）上。
   3. 为在插管过程中保持小鼠固定，用胶带轻轻固定胸部下部（或双上肢）于平台之上。
   4. 将光纤柔性光源轻柔地置于小鼠气管处，位置略低于声门。调节光照强度，使得观察小鼠口咽部时仅见暗视野，唯见红光自声门下方透....

结果

单侧通气无菌肺缺血再灌注（IR）损伤引发的炎症：在缺血1小时后，通过ELISA和qRT-PCR检测发现血清及肺组织中的细胞因子水平升高，于再灌注后1小时达到峰值，并在再灌注后12–24小时内迅速恢复至基线水平¹³。在再灌注后3小时采集的样本中，我们观察到左肺组织内出现显著的中性粒细胞浸润，且炎症强度与所使用的小鼠品系有关（图1）。值得注意的是，在无共存或继发感染过程的情况下，该炎症会逐渐消退，肺组织在组织病理学上恢复至正常的肺结构，中性粒细胞通过胞葬作用或从受损肺组织中迁移清除，通常在再灌注后12–24小时内完成¹³。此外，我们在非手术侧右肺也观察到轻度但可检测到的炎症，主要表现为中性粒细胞浸润，我们推测这可能是由于过度灌注损伤所致¹⁴。

该肺缺血再灌注模型的组织样本采集方法与其他肺缺血再灌注模型相同：可采集血液用于血浆制备 通过 心脏穿刺或下腔静脉插管；肺组织可.......

讨论

本文详细描述了执行Dodd-o等人开发的通气肺缺血再灌注模型的各项步骤。⁹该模型有助于单独识别参与肺缺血-再灌注损伤中炎症发生与消退的分子通路^14,15,16,17，肺部缺血再灌注损伤合并共存感染¹⁸，以及肺部缺血再灌注损伤与肠-肺轴及肠道微生物组作用的关系^13,18,19尽管在技术上更具挑战性，但当前模型能够在不受到循环性肺膨胀中断和缺氧因素干扰的情况下评估肺缺血再灌注损伤。此外，与传统方法不同，该模型还缩短了机械通气暴露的时间。 离体 灌注模型，其本身可导致肺损伤

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
设备
光纤导光管	Cole-Parmer	UX-41720-65	光纤导光管
光纤光源	AmScope	SKU: CL-HL250-B	光纤灯的光源
Germinator 500	Cell Point Scientific, Inc.	No.5-1450	珠式灭菌器
加热垫	AIMS	14-370-223	替代选项
锂离子宠物修剪套装（毛发剪）	WAHL 家用产品	SKU 09854-600B	用于去除手术部位的小鼠毛发
显微镜	Nikon	SMZ-10	公司网站提供其他更新的选项
MiniVent 呼吸机	Havard Apparatus	Model 845	小鼠呼吸机
超声波清洗机	Cole-Parmer	UX-08895-05	清洗手术中使用过的工具
保温垫	Kent Scientific	RT-0501	用于在小鼠术后恢复期间保持其体温
电子天平	Cole-Parmer	UX-11003-41	电子天平
手术器械
4-0 丝线缝合线	Ethicon	683G	用于关闭肌肉层
7-0 Prolene 缝合线	Ethicon Industry	EP8734H	用于制作左肺动脉的滑结
Bard-Parker (11) 手术刀（带肋碳素钢手术刀片，无菌，一次性使用）	Aspen Surgical	372611	用于进入胸腔（选项1）
Bard-Parker (12) 手术刀	Aspen Surgical	372612	用于进入胸腔（选项2）
超细 Graefe 镊子	FST	11150-10	用于夹持肌肉/肋骨的镊子
磁性固定牵开系统	FST	1. 底板（编号 18200-03） 2. 固定器（编号 18200-01） 3. 牵开器（编号 18200-05 至 18200-12） 4. 弹性体（编号 18200-07） 5. 牵开器（编号 18200-08）	小型动物牵开系统
Monoject 标准皮下注射针头	COVIDIEN	05-561-20	用于腹腔给药
窄型图案镊子	FST	11002-12	用于皮肤层的镊子
持针器	FST	12565-14	用于夹持缝合针
针头	BD	305110	26 号针头，用于引出滑结（24 或 26 号针头均可）
肺动脉/血管扩张镊子	FST	00125-11	用于夹持肺动脉；无损伤夹持器
剪刀	FST	14060-09	用于手术中切口及切开肌肉层
超细 Dumont 微型镊子	FST	11295-10（Dumont #5 镊子，生物尖端，尖端尺寸：0.05×0.02 mm，11 cm）	用于穿过左肺动脉与支气管之间的间隙
试剂
0.25% 布比卡因	Hospira, Inc.	0409-1159-02	手术切口闭合期间使用的局部镇痛剂
Avertin（2,2,2-三溴乙醇）	Sigma-Aldrich	T48402-25G	麻醉剂，用于小鼠缺血再灌注（IR）手术的麻醉，IR 手术中使用的浓度为 250–400 mg/kg
丁丙诺啡	Covetrus North America	59122	镇痛剂：手术中使用浓度为 0.05–0.1 mg/kg
眼用润滑剂	BAUSCH+LOMB	Soothe 润滑眼膏	缓解眼部干燥
10% 聚维酮碘溶液	MEDLINE INDUSTRIES INC	SKU MDS093944H（2 FL OZ，外用抗菌剂）	手术开始时作为有效的急救抗菌液使用
材料
酒精棉片	BD 品牌	BD 326895	用于注射和手术区域的消毒
塑料薄膜	KIRKLAND	Stretch-Tite premium	覆盖无菌手术区域的替代材料（更具成本效益）
啮齿类动物手术巾	Stoelting	50981	用于手术区域的无菌铺巾或覆盖物
无菌棉签	Pwi-Wnaps	703033	用于涂抹眼用润滑剂
止血海绵	Dukal Corporaton	Reorder # 5360	用于控制皮肤/肌肉出血