左冠状动脉结扎：一种小鼠心肌梗死的外科模型

摘要

本文介绍了一种在小鼠中永久性结扎左冠状动脉的外科手术方法。该模型可用于研究心肌梗死后的心脏病理生理学变化及相关炎症反应。

摘要

缺血性心脏病及其继发的心肌梗死（MI）是美国及全球范围内导致死亡的主要原因之一。为了探究心肌梗死后发生的病理生理变化并设计未来的治疗方法，需要建立心肌梗死的研究模型。在小鼠中永久结扎左冠状动脉（LCA）是一种广泛使用的模型，用于研究心肌梗死后的心脏功能和心室重构。本文介绍一种创伤更小、可靠且可重复的小鼠心肌梗死手术模型，即通过永久性结扎LCA建立MI模型。本手术模型包括易于逆转的全身麻醉、无需气管切开术的气管插管以及开胸手术。应通过心电图和肌钙蛋白检测来确认心肌梗死的发生。在心肌梗死后第28天进行超声心动图检查，可评估心脏功能及心力衰竭相关参数。心脏纤维化的程度可通过Masson三色染色和心脏磁共振成像（MRI）进行评价。该心肌梗死模型适用于研究心肌梗死后机体的病理生理学和免疫学改变。

引言

心血管疾病是重大的公共卫生问题，每年导致1790万人死亡，占全球死亡总数的31%¹。最常见的心血管异常类型是冠心病，而心肌梗死（MI）是冠心病的主要表现之一²。MI通常由易损斑块破裂引发冠状动脉血栓性闭塞所致³。由此产生的缺血会导致受累心肌发生显著的离子和代谢改变，并伴随收缩功能迅速下降。MI可导致心肌细胞死亡，进而可能引发心室功能障碍和心力衰竭⁴。

由于心肌梗死（MI）患者组织样本稀缺，针对患者的研究受到限制⁵。因此，小鼠MI模型在研究疾病机制以及开发潜在治疗靶点方面具有重要价值。目前可用的小鼠MI模型包括不可逆缺血模型（左冠状动脉结扎法和消融法）以及再灌注模型（缺血/再灌注模型，I/R）⁶。在小鼠中永久结扎左冠状动脉（LCA）是最常用的方法，该方法可模拟患者MI的病理生理学和免疫学特征^7,8,9。永久性心肌梗死也可通过消融法诱导，包括电损伤或冷冻损伤。消融法能够在精确位置产生大小均一的梗死区域¹⁰。然而，不同消融方法在瘢痕形成、梗死形态及分子信号通路方面可能存在差异^10,11。小鼠I/R模型是另一种重要的MI模型，可代表临床再灌注治疗的情境¹²。但I/R模型也存在一些挑战，例如梗死面积变异较大，难以区分初始损伤与再灌注所引发的反应⁶。

尽管广泛使用，LCA结扎方法常伴随较低的存活率和术后疼痛¹³。本方案展示了小鼠LCA结扎心肌梗死（MI）手术模型，包括小鼠的准备与插管、LCA结扎、术后护理以及MI的验证。该方法不采用侵入性气管切开术¹⁴，而是使用经气管插管。通过喉镜照亮口咽部进行插管，使操作更简便、更安全且创伤更小¹⁵。小鼠在整个手术过程中保持机械通气，并持续接受异氟烷麻醉。此外，通过超声心动图和Masson三色染色分别评估MI后的心功能和心肌纤维化。总体而言，该方法提供了一种可靠且可重复的小鼠MI手术模型，可用于研究MI后的病理生理学和炎症反应。

方案

本研究方案已通过匹兹堡大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）的审查和批准。实验共使用8只1岁龄雌性C57BL/6J小鼠（假手术组n = 4，心肌梗死组n = 4），体重为24-30 g。小鼠在术后24小时内存活率约为100%，术后28天存活率至少为80%。

1. 小鼠的准备与气管插管

1. 将珠式灭菌器（见材料表）预热至 250 °C，并将已高压灭菌的外科器械放入其中数分钟。
2. 在诱导麻醉舱中使用 3% 异氟烷和 1 L/min 氧气对小鼠进行 5 分钟麻醉。
3. 通过用力捏压脚趾并观察小鼠反应，确认其麻醉深度。
4. 称量小鼠体重以估算术前镇痛药（丁丙诺啡，0.1 mg/kg）剂量，并经腹腔注射给药。
5. 使用电动剃刀修剪小鼠左侧胸壁的毛发。
6. 用聚维酮碘和 70% 乙醇交替消毒手术区域，重复三次。
7. 将小鼠仰卧固定于倾斜板上，使用弹性带固定其上颌门齿，四肢用胶带固定。在眼睛上涂抹无菌眼用润滑剂，以防止麻醉期间角膜干燥。
8. 打开小鼠下颌，轻柔地将舌头拉出口腔。
9. 使用喉镜（见材料表）照亮口咽部，识别喉部开口位置。
10. 剪去 24 G 导管针约 0.5 cm 的尖端，将钝端针头插入塑料套管中。将带塑料套管的钝针导入气管，随后抽出金属针芯，保留塑料套管于气管内。
11. 将呼吸机（见材料表）设置为呼吸频率 137 次/分钟（针对本研究所用小鼠优化的参数）和潮气量 0.18 cc。将呼吸机管路连接至导管套管，观察胸部是否随呼吸机同步起伏，以确认插管成功。
12. 断开呼吸机管路与导管套管的连接，将动物转移至预热的温控手术板上并保持仰卧位，随后重新连接呼吸机。

2. 左冠状动脉的永久性结扎

1. 用消毒剂对手术部位进行消毒 聚维酮碘和70%酒精 应用 中心带有一个硬币大小孔洞的无菌铺巾 用镊子轻轻提起皮肤，沿左侧胸大肌与胸小肌之间的连线，使用手术剪做一长度为1.5–2 cm的皮肤横向切口，以暴露手术区域。
   注意：使用剪刀进行切口，因为它可提供 对切割深度和方向所需的控制。
2. 用镊子和解剖剪分离下方的胸肌。使用连接弹性带的牵开器将肌肉分开。
3. 在第三肋间隙沿肋骨的自然角度使用显微剪刀做切口。此步骤中必须格外小心，以避免损伤心脏和肺组织。
4. 使用牵开器轻轻撑开肋骨，以暴露左心室。将心包脂肪移开，找到左冠状动脉（LCA），该动脉从左心房边缘向心尖方向走行。
5. 使用持针器将8-0尼龙缝线穿过左冠状动脉（LCA）下方。以双结加第二个结（改良外科结）结扎LCA。
   注意：左心室下壁变白表明左冠状动脉（LCA）结扎成功。此外，还可通过肌钙蛋白检测、心电图监测（ST段抬高）、超声心动图/体内 建议采用心脏门控 MRI 或 micro-CT 图像，以确认心肌梗死病灶具有可比性。
6. 移除牵开器，将22 G导管针插入胸腔。拔出针芯，留下塑料套管尖端于胸腔内。使用4-0尼龙缝线关闭肋骨。
7. 将注射器连接至22 G塑料护套，通过轻压胸部以排出胸腔内滞留的多余空气，建立负压。随后移除塑料护套。
8. 使用4-0尼龙缝线缝合皮肤。
9. 关闭异氟烷供应。此时，小鼠已连接至呼吸机并接受氧气供给。

3. 术后护理

1. 一旦自主呼吸开始，立即关闭呼吸机。
   注意：从实验动物准备开始到此步骤，整个过程大约需要 30–35 分钟。
2. 将小鼠置于保温灯下，并持续监测直至其苏醒。在动物恢复足够的意识以维持胸卧位之前，不得无人看护。
3. 手术后，将动物单独饲养于一个笼内，只有在其完全恢复后方可放回原笼与其他动物合笼。
4. 每天监测小鼠是否有任何疼痛或不适的迹象。
5. 术后继续每 6–8 小时进行一次腹腔注射布托啡诺（0.1 mg/kg），持续额外 2 天 。

4. 超声心动图评估

注意：在心肌梗死后的第28天，通过超声心动图评估心力衰竭的各项参数。

1. 手术后28天，使用3%异氟烷和1 L/min氧气对小鼠进行麻醉，在眼睛上涂抹无菌眼用润滑剂，并使用脱毛膏去除胸部毛发。用聚维酮碘和70%乙醇对胸部区域消毒三次。
2. 将麻醉后的小鼠固定在成像平台上（参见 材料表仰卧位，并通过连接麻醉系统的鼻罩持续维持稳定的麻醉水平（1%–2% 异氟烷和 1 L/min 氧气）。
3. 用导电凝胶将四肢固定在心电图电极上（参见 材料表）。通过插入直肠探针监测动物体温（参见 材料表).
4. 应用扫描凝胶（参见 材料表将探头垂直置于胸部，沿胸壁平行移至胸骨旁线，逆时针旋转35°，以获取左心室的胸骨旁长轴切面。
5. 轻敲 B型超声模式 成像软件上的成像按钮（参见 材料表）以获得心脏的完整长轴视图。调整门控大小和亮度，并保存图像 保存视频片段 或 保存帧 用于后续测量¹⁶.
6. 切换至 M型超声 （运动模式）并将M型超声轴线置于乳头肌水平。调整取样门大小，然后点击M型超声 开始 按钮。使用以下方式保存图像 保存片段 或 保存帧^16,17.
7. 由于4D模式图像采集过程是自动化的，请验证心电图和呼吸信号是否处于活动状态（图1在采集数据之前。
8. 开始以B模式采集数据。打开4D扫描面板并启动3D马达。在4D扫描面板中设置图像参数，然后点击 扫描 单击按钮开始扫描。在二维视图中查看图像后，将图像加载到四维模式中使用 载入4D 按钮

结果

图1 展示了假手术组（sham）在超声心动图评估期间具有代表性的 ECG 活动信号和呼吸信号图1A）和心肌梗死（MI）图1B小鼠。在采集超声心动图数据之前，验证有效的心电图和呼吸信号非常重要。 图2 显示左冠状动脉结扎28天后心脏功能参数的超声心动图测量结果。 图2 显示假手术组（sham）在胸骨旁短轴切面的 M 型超声图像图2A）和 MI（图2B心脏。 图2B 显示结扎LCA后心壁运动异常。心力衰竭的指征，例如左心室质量增加（图2C），射血分数降低（

讨论

心肌梗死（MI）的小鼠模型在心血管研究实验室中日益受到关注，本研究描述了一种可重复且具有临床相关性的心肌梗死模型。该方案在多个方面改进了左冠状动脉（LCA）结扎过程。首先，避免使用如赛拉嗪/氯胺酮或戊巴比妥钠等注射类术前麻醉剂^14,15，仅采用异氟烷麻醉，这有助于提高动物术后存活率（手术后28天存活率>80%），减少药物引起的并发症，并且相较于其他麻醉剂对心脏功能的影响更小¹⁹。 然而，异氟烷也会减慢心率，尽管其程度低于其他麻醉剂²⁰。本方案采用创伤更小的经口气管插管，避免进行气管切开术²¹，从而减轻术后疼痛与不适。以往的小鼠LCA结扎研究建议通过颈部正中切口以改善气管插管时的视野；但本方案改用喉镜照亮口咽部¹⁵。Lugrin等人近期报道了一种无需胸腔穿刺的心肌梗死小鼠模型^14<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
22 G 导管针	Exel INT	26741	胸腔穿刺术
24 G 导管针	Exel INT	26746	气管插管术
4-0 尼龙缝线	Covetrus	29263	肌肉和皮肤缝合
8-0 尼龙缝线	S&T	3192	左前降支结扎
麻醉蒸发器	Vet equip	VE-6047	麻醉支持
动物生理监测仪	Fujifilm	VEVO 3100	监测心率、呼吸频率和体温
聚维酮碘溶液	PBS animal health	11205	抗菌剂
丁丙诺啡	Covetrus	55175	镇痛药
解剖显微镜	OMANO	OM2300S-V7	双目
电动剃须刀	Wahl	79300-1001M	剃毛
电极凝胶	Parker Laboratories	W60698L	导电凝胶
乙醇	Decon Laboratories	22-032-601	消毒剂
镊子	FST	11065-07	不锈钢
纱布	Curity	CAR-6339-PK	无菌
加热灯	Satco	S4998	术后护理
加热垫	Kent scientific	Surgi-M	温度控制
热珠灭菌器	Germinator 500	11503	手术器械灭菌
异氟烷	Covetrus	29405	麻醉
Masson’s 三色染色试剂盒	Thermoscientific	87019	心肌纤维化测量
微型持针器	FST	12500-12	不锈钢
微型剪刀	FST	15000-02	不锈钢
眼科软膏	Dechra	Puralube Vet	无菌眼用润滑剂
扫描凝胶	Parker Laboratories	Aquasonic 100	水性超声传导凝胶
剪刀	FST	14060-11	不锈钢
小型动物喉镜	Penn-Century	Model LS-2-M	照亮口咽部
小型动物呼吸机	Harvard apparatus	557058	呼吸机支持
手术灯	Cole parmer	41723	照明宽度（英寸）：7
Vevo 3100 前临床成像平台	Fujifilm	VEVO 3100	超声心动图
VevoLAB 软件	Fujifilm	VevoLAB 3.2.6	超声心动图数据分析