一种基于发光二极管的自制光动力治疗装置用于增强维替泊芬在二维细胞培养模型中的细胞毒性

摘要

本文介绍了一种新颖、简单且低成本的装置，可成功利用二维培养的HeLa细胞和维替泊芬作为光敏剂，进行体外光动力疗法（PDT）实验。

摘要

本文介绍了一种新型、简单且低成本的装置，用于执行 体外 光动力疗法（PDT）检测，命名为PhotoACT。该装置采用一组常规的可编程发光二极管（LED）、一个液晶显示器（LCD）模块以及连接至商用微控制器板的光传感器构建而成。原型机的箱体结构由中密度纤维板（MDF）制成，内部空间可同时容纳四块细胞培养多孔微孔板。

作为概念验证，我们研究了光敏剂（PS）维替泊芬在二维（2D）培养条件下对HeLa细胞系的细胞毒性作用。HeLa细胞用浓度递增的维替泊芬处理24小时。含药物的上清培养基被弃去，贴壁细胞用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，然后加入不含药物的培养基。在本研究中，维替泊芬对细胞的作用在两种条件下进行评估：一种是不进行光照，另一种是在红-绿-蓝（RGB）值为255、255、255的光线下照射1小时（平均光剂量为49.1 ± 0.6 J/cm²）。24小时后，采用3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）法检测细胞活力。

实验结果表明，将经维替泊芬处理的细胞暴露于该设备的光照下，可增强药物的细胞毒性作用 通过 一种由活性氧（ROS）介导的机制。此外，通过将本研究中所述原型的结果与商用光动力治疗（PDT）设备进行比较，验证了该原型的有效性。因此，这种基于LED的光动力治疗原型是一种良好的替代方案 体外 光动力疗法研究。

引言

在致死性最强的非传染性疾病中，癌症是导致过早死亡的全球首要原因之一。2020年，癌症导致了近1000万人死亡，约占全球死亡总人数的六分之一¹。此外，多药耐药（MDR）现象构成了重大的公共卫生威胁，因为现有的化疗方案在该临床状况下无法达到缓解阶段²。癌细胞可通过多种机制对化疗产生耐药性，但ATP结合盒（ABC）转运蛋白——即ATP依赖性外排泵——的过表达被认为是肿瘤微环境中MDR形成的主要原因³。除了MDR之外，癌症的其他并发症，如复发和转移，进一步凸显了开发和改进治疗策略以应对这一肿瘤学挑战的紧迫性。

利用光进行治疗已有数个世纪的历史⁴，光动力疗法（PDT）是一种临床批准用于实体瘤治疗的治疗手段。PDT通过给予光敏剂（PS），随后进行光照，从而产生活性氧（ROS），在肿瘤细胞中发挥选择性细胞毒性作用。该治疗方法优于包括手术、放疗和化疗在内的传统方法⁵；它是一种微创技术，对结缔组织的细胞毒性较低⁶。在肿瘤局部或其微环境中直接施加光照并使光敏剂富集，可实现精确定位，从而显著减少不必要的全身副作用⁷，并允许在同一部位重复治疗。此外，其治疗成本低于其他方....

方案

注意：有关本实验方案中使用的所有材料、试剂和软件的详细信息，请参见材料表。

1. 装置构建

1. 将厚度为 3 mm 的中密度纤维板（MDF）锯切成如图 1A所示尺寸的板材。
   注意：使用矢量文件（补充文件 1）进行数控（CNC）切割。
2. 制作两个盒子，其尺寸（长 × 宽 × 高）分别为：大盒子 330 mm × 235 mm × 225 mm，小盒子 300 mm × 220 mm × 150 mm（图 1B）。
3. 在大盒子背面钻孔以安装筒形插孔连接器；在大盒子顶部以及小盒子的顶部和底部钻孔，以便为电线提供穿行通道（图 1C）。
4. 用黑色墨水涂刷所有内表面，以促进光线均匀入射（图 1D）。
5. 在小盒子内部上表面并联安装三条 LED 灯带，每条灯带包含 10 个 LED（图 1E）。
6. 在小盒子内部底面中心位置安装一个亮度传感器（

结果

最终的光动力治疗（PDT）装置名为PhotoACT，包含一个暗室，可容纳最多四个多孔微孔板，其上部内表面装有一组30个分散排列的发光二极管（LED），可编程发射不同光谱的可见光（图3 和补充文件6）。该装置由两个相互关联的箱体构成：内部箱体设计为进行PDT实验的暗室，外部箱体则用于覆盖内部暗室并容纳控制单元（图1B）。内部箱体被涂成黑色（图1D），并配备一条长度为1米（后被切割为三段）、功率为9瓦、包含30个LED的LED RGB WS2812（或WS281B）灯带，该灯带内置处理器。该装置实现了更精确的控制，从而确保更准确的颜色发射。30个LED通过三条平行灯带均匀分布在PDT暗室的整个上部内表面，每条灯带包含10个LED（图1E）。由于黑色内表面反射率低，且LED布局均匀，因此实现了光照的均匀性。内部箱体底部中央还集成了一个TSL2561亮度传感器，用于指示光照强.......

讨论

最终的PhotoACT装置使用市售的低成本组件即可方便地构建，总成本低于50美元。其他优点包括维护需求低、能够照射多种类型的培养板、每次实验可同时使用最多四个装置单元、重量轻（2 kg）/体积小（44 cm³），便于携带，照射精确且可重复（数据未显示），以及用户友好的简易设置界面，无需连接计算机或其他设备。

在项目构思过程中，构建和操作流程中的某些关键步骤带来了改进的机会。由于PDT腔室需要均匀的光发射和一致的能量测量，因此对内部和外部箱体进行了密封，以避免外部光线干扰以及发射光的损失。在前门侧面额外固定了魔术贴带，以加强腔室的闭合，确保实验的连续性。在控制单元上安装了一个代表性LED，用于确认所需的RGB配置，指示实验过程中发射光的颜色和强度。最后，编程代码经过多次升级，以优化瞬时密度测量和最终能量评估的精度，从而保证实验的可重复性和数学一致性。其他需要特别注意的主要细节包括：（i）LED的均匀分布以及亮度传感器的中心定位，以获得具有代表性和平衡性的结果；（ii）根据电路图（图2）和编程代码（

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5% 胰蛋白酶-EDTA（10倍浓缩液）	Gibco	15400054	哺乳动物细胞培养解离试剂
3D 打印机	Flashforge		Finder 型号
96 孔板			非无菌、聚苯乙烯材质、平底、高结合表面的孔板，用于二维细胞培养
Arduino
亮度传感器			TSL2561 型号，检测范围为 0.1–40,000+ 勒克斯，带 I2C 接口
按钮
蜂鸣器
细胞培养瓶			无菌、聚苯乙烯材质、矩形底、带组织培养（TC）处理表面、倾斜颈和通气盖的培养瓶（不同规格）
离心管			无菌聚丙烯材质，容量为 15/50 mL，用于实验接种步骤中的细胞培养稀释
CO2 培养箱
控制板			ESP32
设计软件	Trimble		SketchUp
DMEM 高糖培养基	Gibco	11965092	DMEM（杜尔贝科改良伊格尔培养基）是一种广泛使用的基础培养基，用于支持多种哺乳动物细胞的生长
DMSO	Sigma-Aldrich	D4540-500ML	二甲基亚砜，≥99.5%（GC），适用于植物细胞培养
胎牛血清	Gibco	12657029	FBS 通过在长期传代过程中提供稳定的细胞生长表现，具有最佳使用价值
庆大霉素（50 mg/mL）	Gibco	15750060	水溶性抗生素，最初从紫色小单孢菌 Micromonospora purpurea 中纯化获得，用于防止细胞培养污染
血细胞计数板			采用 Neubauer 刻度的计数室，用于实验接种步骤中的细胞计数
倒置显微镜	Leica		DM IL LED
超净工作台			通过在工作区域上方维持持续单向的 HEPA 过滤空气流，保护工作环境免受污染的设备，用于细胞培养和处理过程中的多个步骤
LCD 显示屏
LED RGB WS2812			5050 RGB SMD 型号，内置处理器，每米 30 个 LED，长度 1 米，功率 9 瓦
中密度纤维板（MDF）			厚度为 3 mm 的中密度纤维板
微量离心管			无菌聚丙烯材质，带安全盖，容量为 1.5/2.0 mL，适用于实验处理步骤中对小体积液体的操作
酶标仪	ThermoFischer		Multiskan FC 微孔板光度计，可检测较宽波长范围的吸光度（340–850 nm），用于 MTT 孵育后评估细胞活力
MTT 试剂	Invitrogen	M6494	3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐，用于细胞活力检测
操作系统	Real Time Engineers ltd.		FreeRTOS
P10 移液器			非电子式、单通道，量程为 1–10 μL
P1000 移液器			非电子式、单通道，量程为 10–1000 μL
P200 移液器			非电子式、单通道，量程为 20–200 μL
PDT 设备	LumaCare		LC-122 型号
磷酸盐缓冲液 pH 7.4	Gibco	10010031	用于细胞培养和实验过程中细胞洗涤的平衡盐溶液
电位器
移液器吸头			非无菌、通用型，最大容量为 10/200/1000 μL
维替泊芬	Sigma-Aldrich	SML0534-5MG	维替泊芬，≥94%（HPLC）