堆肥微宇宙作为微生物组研究中微生物多样性高且接近自然环境的实验体系 秀丽隐杆线虫

摘要

堆肥微宇宙实验将自然界中存在的微生物多样性引入实验室，以促进对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）微生物组的研究。本文提供了建立微宇宙实验的详细方案，这些实验展示了调控环境微生物多样性的能力，可用于探究环境微生物多样性与线虫肠道微生物组组成之间的关系。

摘要

线虫 秀丽隐杆线虫 正逐渐成为研究宿主与其肠道微生物组之间相互作用分子机制的有用模型。尽管使用经过充分表征的细菌或定义明确的菌群进行实验有助于分子机制的分析，但在自然微生物背景下研究线虫对于探索此类机制的多样性至关重要。与此同时，从野外分离线虫并不总是可行的，即使可以实现，野外采样也会限制本可利用的遗传工具包的使用 秀丽隐杆线虫 研究。以下方案描述了一种利用堆肥微宇宙系统在实验室中进行微生物组研究的方法 在微生物多样性高且接近自然环境条件下的生长

可就地采集的土壤通过添加不同农产品进行富集，以增加培养和收获线虫的微生物群落多样性，随后对线虫进行清洗和表面灭菌，用于后续分析。代表性实验表明，可通过向普通土壤中添加不同农产品来调控其微生物群落，并进一步证明在不同环境中培养的线虫会形成相似的肠道微生物组，且与各自所处环境的微生物组成明显不同，这支持了物种特异性的核心肠道微生物组的存在。总体而言，堆肥微宇宙系统为微生物组研究提供了类似自然环境的实验室替代方案，可作为合成微生物群落或野外线虫分离方法的替代选择。

引言

线虫 Caenorhabditis elegans 正逐渐成为研究宿主与其肠道微生物组相互作用的有用模型^1,2。作为一种模型，它具有多项优势。首先，无菌或已知菌群动物易于获得和维持；可用次氯酸钠处理怀卵成虫及其相关微生物，杀死成虫和微生物，而对其抗漂白的卵无影响，从而获得同步发育的种群，并可接种感兴趣的目标细菌^3,4。此外，当在细菌存在条件下培养时，作为食菌生物的 C. elegans 会摄取所接触的细菌，其中易感菌种被消化或排出，而具有抗性且能持续存在的菌种则可在虫体肠道内稳定定植。此外，C. elegans 多为雌雄同体，可产生基因完全相同的后代，从而减少遗传变异带来的干扰。结合大量可用的突变体和转基因线虫品系，C. elegans 为研究人员提供了一个菌群明确且遗传可控的模型系统，可用于探究宿主-微生物相互作用的分子机制^5,6,7,8。

尽管利用特征明确的细菌进行实验有助于分析分子机制，但在自然环境中识别并研究蠕虫所互作的细菌，对于探索这些机制的多样性、揭示其功能的自然背景，以及理解塑造其进化的选择压力至关重要。在实验室之外， 秀丽隐杆线虫 在全球湿润的温带气候地区均有发现，这些地区的种群被认为会经历一个 "繁荣与衰退" 生命周期，在资源充足时表现为种群数量快速增长，而在资源耗尽时则转变为发育为具有开拓性、耐受胁迫的dauer幼虫⁹尽管被认为是土壤线虫，但在自然环境中广泛增殖 秀丽隐杆线虫 种群最常见于分解中的有机物（如腐烂的花朵或果实）上取食，这些环境中细菌种群丰富且多样。

对从野外分离的线虫肠道微生物组的研究已鉴定出多样但具有特征性的细菌群落^10,11，而在模拟自然的微宇宙环境中培养线虫的研究进一步支持了这些群落的组成特征^12,13。综合这些研究，得以界定出线虫核心肠道微生物组²。尽管在野外采集秀丽隐杆线虫（C. elegans）种群是研究自然状态下线虫-微生物相互作用的最直接方法，但该方法受限于充足降水的地区和季节，无法在任何时间、任何地点开展^10,11。作为替代方案，无需从自然生境中分离线虫，而是通过微宇宙实验将自然生境带入实验室环境^{6,8,12,13,14,15}。微宇宙环境由添加了多种水果或蔬菜的堆肥土壤制备而成，可进一步促进起始土壤微生物群落的多样化。该方法提供了可操作的实验体系，将微生物多样性与三维自然土壤环境相结合，同时保留了实验室可控条件和遗传背景明确的线虫品系的优势。以下方案详细描述了堆肥微宇宙系统的操作步骤，展示其在研究不同环境中特征性线虫肠道微生物组组装过程中的应用。

方案

1. 堆肥的制备

1. 从任何方便的来源获取堆肥或园艺土壤，并将其存放在实验室内的标准厨房用塑料容器中，容器盖上需打孔以允许空气进入。用脱脂棉塞住孔洞，以防果蝇和其他无脊椎动物进入（图1A）。
   注意：500克土壤（可放入容积为1.5加仑、尺寸为30 cm × 20 cm × 10 cm的容器）足以制备12个微宇宙系统。
2. 以1:2的质量比将切碎的新鲜农产品或多种农产品混合物添加到堆肥或土壤中进行富集。
3. 在20–25 °C条件下培养7–14天，每天混合一次，并根据需要添加M9培养基，以保持湿度但不使土壤泥泞。
   注意：未添加农产品富集的土壤通常无法支持C. elegans的生长；具体使用何种农产品由研究人员自行决定，多种类型及组合均可支持线虫生长。不同农产品的富集将以不同方式促进细菌群落的多样化，从而可研究从不同起始条件出发的肠道微生物组组装过程（详见讨论部分）。

2. 堆肥微宇宙的制备

1. 每个微宇宙中，将10 g富集堆肥加入30 mL玻璃烧杯内，用锡箔纸覆盖后进行高压灭菌（图1B).
2. 为制备用于补充经高压灭菌堆肥的微生物提取物，首先取与步骤2.1中所用相同的堆肥各30 g，分别加入三个50 mL离心管中，并用M9培养基补足体积。涡旋振荡1 min（图1C).
   注意：这足以提供九个微宇宙所需的细菌，每个微宇宙可支持数百条线虫的发育。
3. 将试管在 560 × g 室温（RT）下孵育5分钟。
4. 注意不要扰动沉淀，用血清移液管吸除上清液，并收集到一个新的50 mL离心管中。
5. 通过在最大速度（2,000 × g在室温下孵育15分钟。将沉淀重悬于足量M9培养基中，为每个微生态系统准备200 µL，并额外准备200 µL加入培养板中，作为微生态系统内线虫发育情况的可视参照。
   注意：例如，对于九个微宇宙系统，将微生物沉淀重悬于 2 mL M9 培养基中。
6. 向每份灭菌堆肥中加入 200 µL 浓缩的微生物提取物，同时加入一个 NGM 平板作为可见的替代平板。
7. 孵育微宇宙体系和替代培养板 在添加线虫前，于20-25 °C培养24小时。

3. 在堆肥微宇宙中培养线虫

1. 向每个微环境系统及替代培养皿（步骤 2.7）中加入 500–1000 个卵或 L1 幼虫³，以启动实验（图 1D）。
   ​注意：本实验所描述的方法使用 N2 野生型线虫。然而，其他 C. elegans 品系（以及可能的其他线虫）也可使用。
2. 在 20 °C 下将线虫培养至成虫阶段（通常为 3 天）。

图1：制备堆肥微宇宙系统、培养蚯蚓及采收过程。（A）用有机物料富集本地土壤或堆肥，并培养2周。将（B）高压灭菌后的富集土壤与（C）微生物提取物混合，并（D）孵育至少24小时，随后向微宇宙系统中加入同步化的L1期蚯蚓，以启动实验。（E、F）准备采收时，将微宇宙中的堆肥转移至贝尔曼漏斗支撑柱中，并用M9溶液覆盖。（G）15分钟后，将滤液释放至50 mL离心管中。缩写：sup. = 上清液。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 准备贝尔曼漏斗以收集线虫

1. 将一段5-8厘米长的硬质橡胶管连接到塑料漏斗的末端，组装成巴ermann漏斗。
2. 将一个夹子套在橡胶管上，并将其夹紧。
3. 在漏斗中放入一个长7厘米、直径5厘米的圆柱形PVC管，其底部粘有孔径1毫米的尼龙网（图1E）。在圆柱体内衬两张滤纸。
4. 将巴ermann漏斗放入烧瓶中（图1F）。

5. 从微宇宙系统中收获线虫并采集相应的土壤样品

1. 向培养线虫的微生态系统中加入 20 mL M9 液体培养基，振荡混合，然后将混合液从烧杯倒入巴ermann装置中铺有滤纸的圆筒内。继续加入 M9 液体培养基，直至完全浸没漏斗中的堆肥。
   注意：C. elegans（N2）种群在堆肥微生态系统中的发育至成虫阶段的速度与在接种了Escherichia coli的标准琼脂平板上的发育速度相似。若需更精确地收获特定发育阶段的线虫，请参考步骤 3.3 中的对照平板。
2. 30 分钟后，松开夹子，使含有收获线虫的滤液流入 50 mL 离心管中（图 1G）。
3. 向圆筒中再次加入 M9 液体培养基，进行第二轮收获以获取更多线虫；如需更多线虫，可再重复一次。
   注意：重复收获时，应注意不要破坏滤纸的完整性，以免土壤颗粒穿透滤纸。最多进行四轮收获即可分离出最初加入微生态系统中至少 50% 的线虫，同时不破坏滤纸的完整性。
4. 将线虫悬液在 560 ×g 条件下离心 2 分钟（室温），用移液管移除 35 mL 上清液。
5. 将剩余的 15 mL 转移至 15 mL 离心管中，再次在 560 ×g 条件下离心 1 分钟以进一步浓缩线虫。用移液管移除 14 mL 上清液。
6. 同时，取 1 g 剩余的微生态系统土壤样品置于 1.5 mL 离心管中。立即处理含有环境细菌群落的土壤样品，或按照下述线虫样品的方法将其储存于 −20 °C，用于后续核酸提取。

6. 收获线虫的清洗与表面灭菌

1. 使用玻璃移液管将步骤 5.5 中浓缩并收集的 1 mL 蠕虫转移至 1.5 mL 离心管中。孵育 2 分钟，使蠕虫沉降至管底。吸除上清液，保留底部 100 µL 不扰动。
2. 用 1.5 mL M9+T（含 0.025% Triton-X 的 M9 溶液）洗涤 6 次，每次均让蠕虫沉降至管底。
3. 使用玻璃移液管将洗涤后的蠕虫以 100 µL 体积转移至新的 1.5 mL 离心管中。
   注意：在此实验步骤中，距离第一次洗涤（步骤 6.2）大约已过去 30 分钟。建议在加入左旋咪唑前让蠕虫饥饿至少 1 小时，以促进暂驻细菌的排出及食物细菌的完全消化。
4. 加入 100 µL 25 mM 盐酸左旋咪唑溶液以麻痹蠕虫。在室温下孵育 5 分钟。
5. 加入 200 µL 4% 次氯酸钠溶液。孵育 2 分钟。
6. 吸除上清液，保留底部 150 µL 不扰动，并如上所述用 M9+T 洗涤 3 次。
   注意：为尽量减少样品污染，建议使用经 0.2 µm 滤膜过滤的 M9+T 溶液，并从此时起佩戴手套操作。
7. 完成洗涤后，取最后一次洗涤剩余 150 µL 中的 50 µL 涂布于 LB 平板，在 25 °C 下培养 48 小时，以确认外部细菌已被有效去除。
   注意：最后一次洗涤中观察到最多 30 个菌落（代表样品中残留总计约 60 个外部细菌细胞）是允许的，且鉴于通常每个成年蠕虫体内定植有数千个细菌，其对分析所得微生物组组成的贡献可忽略不计¹⁵。若观察到更多菌落，则样品完整性可能已受损。
8. 立即使用表面灭菌后的蠕虫（例如用于提取活菌进行培养并计数菌落形成单位 [CFU]），或于 −20 °C 保存以用于后续核酸提取。

7. DNA 提取

注意：以下步骤描述了使用专为从土壤中提取微生物 DNA 而设计的商业试剂盒（见材料表）对采集的线虫进行 DNA 提取的过程，其中包含下述修改步骤，以促进从线虫中提取微生物 DNA。

1. 将含有表面灭菌线虫的样品（如有必要，在室温下解冻）转移至试剂盒提供的试管中，并用大约30–50颗直径为1 mm的氧化锆珠替代试剂盒提供的玻璃珠（见材料表）。
   注意：使用氧化锆珠所获得的DNA得率高于使用试剂盒提供的玻璃珠。尽管该现象的具体原因尚不明确，但氧化锆珠可能更有效地破碎线虫的角质层，从而释放出更多的细菌。
2. 对于堆肥样品，将约250 mg采集的土壤直接加入试剂盒的试管中，无需更换玻璃珠。
3. 向所有样品中加入试剂盒提供的缓冲液后，在室温下使用动力均质器进行均质化处理（见材料表），以2,000 rpm转速运行两轮，每轮30秒，中间暂停30秒。
4. 按照试剂盒说明书完成其余DNA纯化步骤。为确保线虫样品的DNA浓度足以用于测序，洗脱体积不应超过50 µL洗脱缓冲液。

结果

为了探究改变土壤微宇宙群落组成的能力，我们比较了堆肥微宇宙中的微生物群落。这些微宇宙是通过将相同的初始土壤（来自加利福尼亚州伯克利市的一种工业级堆肥）分别与不同农产品——苹果、甜椒、橙子或土豆——共培养而建立的（每种条件设三个重复）。我们进一步比较了每种堆肥环境中的微生物群落与在相应微宇宙中培养的野生型 C. elegans 的肠道微生物组。分析所用的DNA样品分别提取自每个微宇宙中约500只表面灭菌的成虫以及250 mg相应的堆肥样品。

环境土壤和蚯蚓肠道微生物组的表征依赖于细菌16S rRNA基因V4区的高通量测序。测序文库的构建采用标准试剂盒，并按照制造商提供的说明进行，测序在商用测序仪上完成（见材料表）。去多重化的序列使用DADA2进行处理，基于SILVA v132参考数据库进行分类学注释，并利用phyloseq^16,17,18进行分析（有关测序与分析的详细描述，请参见补充文件1、补充图S1、补充图S2、补充图S3、补充表S1和补充表S2；完整的计算分析流程可在GitHub获取[https://github.com/kennytrang/CompostMicrocosms]）。原始数据可从NCBI序列读取档案中获取（生物项目编号PRJNA856419）。

平均每份样本获得 73,220 条序列。这些序列代表了 15,027 个扩增子序列变体（ASVs），涵盖 27 个门和 216 个科，包括被视为核心组成部分的科 秀丽隐杆线虫 肠道微生物组¹³，例如 根瘤菌科，伯克霍尔德菌科 和 芽孢杆菌科. 肠杆菌科，以及 假单胞菌科 此前被发现为主要类群的物种此次则占少数，但相较于各自的土壤环境仍呈富集状态（富集倍数为2-10倍）。基于未加权和加权UniFrac的比较分析^19,20 不同微宇宙重复组在添加相同农产品后表现出良好的可重复性，这通过其紧密聚类得以体现。相比之下，添加不同农产品的环境土壤微生物组则彼此分离聚类，表明通过添加不同农产品能够使初始微生物群落发生多样化。图2).

在比较线虫肠道微生物组与环境群落时，基于非加权或加权UniFrac距离的主坐标分析（PCoA）均显示出，对于每种微宇宙类型，线虫肠道微生物组与其相应环境微生物组之间存在明显分离的聚类模式（图2）。尽管基于非加权UniFrac距离的PCoA未能区分土壤与线虫微生物组（图2A），但基于加权距离的聚类分析则清晰地将线虫肠道微生物组与堆肥微生物组区分开来（图2B）。这些结果支持一种机制：宿主对环境中可获得的微生物进行筛选，从而塑造出其肠道微生物组；该微生物组在分类单元的存在性方面并未完全脱离其环境来源，但通过富集部分可利用的分类单元来调节其丰度，最终形成在不同环境中培养的线虫之间共享的核心肠道微生物组。

图2：蚯蚓肠道微生物组与其相应富含不同果蔬的微生物环境分离聚类。 通过16S测序确定微生物组组成，并基于（A）未加权或（B）加权UniFrac距离，对添加指定果蔬的微宇宙系统中或在其中培养的蚯蚓来源的群落进行主坐标轴分析（PCoA）聚类。图中坐标轴表示在各样本间群落组成差异中解释最大变异度的主成分（每种微宇宙类型N = 3）。 请点击此处查看该图的放大版本。

补充文件1：下一代测序与数据分析。 本文介绍了文库构建、实验室测序以及数据分析的步骤。请点击此处下载该文件。

补充图 S1：一个样本反向测序读段的质量控制图示例。 X 轴（循环）表示测序读段中核苷酸的位置。左侧 Y 轴表示质量得分。灰度热图表示每个核苷酸位置上质量得分的频率；绿色线表示每个核苷酸位置的中位质量得分；上方橙色线表示质量得分分布的四分位数；下方红色线表示延伸至该核苷酸位置的测序读段所占百分比（右侧 Y 轴，此处为 100%）。请点击此处下载该文件。

补充图 S2：不同样本的错误率。 不同样本中的错误频率（黑色圆点）应随着每个可能的碱基对替换所对应的质量分数的增加而降低，反映出预期的趋势。请点击此处下载该文件。

补充图 S3：基于加权 UniFrac 距离的 PCoA 示例。 图例中显示的组名代表用于富集不同微宇宙中所用堆肥的农产品种类。请点击此处下载该文件。

补充表 S1：序列的逐步过滤。^a 过滤前的序列读段数量。^b-d 每一列代表经过一步过滤后剩余的序列读段数量：去除低质量读段（步骤 2.5）、dada() 算法去噪（步骤 2.8）、合并正向和反向读段（步骤 2.9）以及去除嵌合体（步骤 2.11）。请点击此处下载该文件。

补充表 S2：元数据表。 请点击此处下载该文件。

讨论

本文介绍了一种研究在类似自然环境中培养的线虫肠道微生物组的方法，为从自然界分离线虫或在合成群落上培养线虫提供了替代方案。

在代表性微宇宙实验中捕获的数千种潜在细菌物种反映了蠕虫在进化过程中所伴随的微生物多样性，同时展示了微宇宙技术流程能够结合模式宿主生物研究的优势与自然、多样化微生物群落研究的优势。

代表性结果表明，使用不同类型的农产品富集普通土壤可调节环境微生物多样性，凸显了利用该流程可探索的微生物多样性范围。农产品的选择并非特别重要。以往的研究曾使用香蕉、苹果、橙子、草莓、绿茶叶片和土豆来富集土壤，均获得了相似的线虫培养效率。混合农产品也被有效使用。关键特征在于，不同农产品会以独特的方式使特定土壤的微生物组成多样化。

尽管环境微生物多样性存在广泛差异，但蠕虫肠道微生物组的变异程度却显著较小，这重现了蠕虫肠道生态位及宿主筛选在构建核心肠道微生物组中的重要性，该核心微生物组与其土壤环境中的微生物组明显不同¹³。这一模式在加权UniFrac主坐标分析（PCoA）中表现最为明显，表明环境土壤与蠕虫肠道微生物组之间的差异主要源于关键分类群相对丰度的差异。

尽管本文所述方案主要关注用于16S测序的线虫采集，微生态系统也可用于探究其他感兴趣的科学问题。例如，可进一步研究从微生态系统中采集的线虫，以分析多样化肠道微生物组对宿主抵抗各种不利条件（包括病原体或毒素）能力的影响。此外，还可从研磨后采集的线虫中分离并培养新的细菌物种和菌株，从而拓展可用于实验的细菌在分类学和功能上的多样性。

尽管实验室环境中的研究方法追求一致性和可重复性，但微生态系统研究则利用自然变异，在类似自然的环境中探索宿主与微生物之间的相互作用。然而，这种变异也带来了一些挑战。某些含有高水平内生无脊椎动物的土壤可能需要额外的离心、过滤和检查步骤，以有效清除微生态系统制备过程中不需要的生物体。此外，土壤中微生物丰度较低可能会诱发线虫种群不必要的休眠幼虫（dauer）形成，此时需增加微生物提取物的用量，或通过添加更多有机物来富集土壤。随着每一次微生态系统实验的开展，研究人员得以持续探索自然界所提供的完整分类学与功能多样性，从而发现新的微生物类群以及多种功能特性，从抗感染能力到抵御环境中外源性异生物质的保护作用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AMPure XP 试剂，60 mL	贝克曼库尔特	A63881	补充文件 步骤 1.3
漂白剂（次氯酸钠）	Sigma-Aldrich	7681-52-9	步骤 6.5
DNeasy PowerSoil Pro 试剂盒	Qiagen	47016	第7步 DNA提取
dNTP混合物 10 mM	Invitrogen	18427013	补充步骤 1.2
Easypet 3 血清移液管控制器	Eppendorf	4430000018	用于在指定时去除上清液
Greiner Bio-One 25 mL 无菌血清移液管	Fisher Scientific	07-000-368	用于在指定时去除上清液
KH2PO4	Fisher Scientific	P285-500	用于制备M9培养基
盐酸左旋咪唑	Fisher Scientific	AC187870100	步骤 6.4
M9 最小培养基溶液	自制	N/A	wormbook.org 网站上的实验方案
MgSO₄4	Fisher Scientific	M63-500	用于制备M9培养基
MiniSeq 高输出试剂盒（150 个循环）	Illumina	FC-420-1002	补充步骤 1.7
MiniSeq 系统	Illumina	SY-420-1001	使用商用测序仪；补充步骤 1.7
Na2HPO4	Fisher Scientific	S374-500	用于制备M9培养基
NaCl	Fisher Scientific	S271-3	用于制备M9培养基
线虫生长培养基（NGM）	自制	N/A	wormbook.org 网站上的实验方案
Nextera XT DNA文库制备试剂盒（96个样本）	Illumina	FC-131-1096	使用的文库制备试剂盒；补充步骤 1.4
PhiX Control v3	Illumina	FC-110-3001	补充步骤 1.7
Phusion 高保真 DNA 聚合酶	New England Biolabs	M0530L	补充步骤 1.2
PowerLyzer 24 均质器（110/220 V）	Qiagen	13155	步骤 7.3
Qubit dsDNA HS 检测试剂盒	Invitrogen	Q32851	补充步骤 1.1 &和 1.6
Qubit 荧光仪	Invitrogen	Q33238	补充步骤 1.1 &和 1.6
Triton X-100	Fisher Scientific	BP-151	用于制备 M9+T
氧化锆/二氧化硅珠，直径1.0 mm	Fisher Scientific	NC9847287	步骤 7.1