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分离的成年成人原代心肌细胞中心肌收缩力的测量

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DOI：

10.3791/64394

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2022年8月9日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1AnaBios Corporation

本文内容

摘要

本方案介绍了如何使用MyoBLAZER系统测量供体心脏来源的成人原代心肌细胞的收缩力。MyoBLAZER是一种可靠的平台，可用于临床前药物研发阶段评估药物诱导的收缩力变化。

摘要

评估心肌收缩力的变化在针对心脏和非心脏靶点的新化合物临床前研发过程中至关重要。本文介绍了一种利用MyoBLAZER系统检测成人原代人心室心肌细胞收缩力变化的实验方案，该系统采用一种非侵入性光学方法，可保持细胞正常的生理状态和药理特性。该光学记录技术能够并行连续测量多个细胞的收缩瞬变，实现中等通量检测，同时提供视野中每个单个细胞的有价值信息，从而实现实时追踪药物效应。心肌细胞的收缩由电场刺激起搏诱导，获取的明场图像被输入图像处理软件，用于测量多个心肌细胞的肌节缩短情况。该方法可快速生成与收缩和舒张相动力学相关的多种终点参数，所得数据可结合不同浓度的受试物质进行解读。该方法还被应用于临床前研发的后期阶段，开展后续机制性研究，以支持正在进行的临床研究。因此，基于成人原代人心肌细胞并结合连续收缩力监测光学系统的研究模型有望推动进入一个 体外 临床前医学治疗开发中的心脏数据可转化性

引言

心肌收缩力（即肌力），代表心肌固有的收缩能力，是心脏功能的关键特性，依赖于电-机械耦联的动力学过程。在治疗心脏疾病（如心力衰竭）时，药物引起的心肌收缩力改变是期望达到的效果；而在心脏毒性背景下，此类改变则是非预期的（如左心室射血分数降低）。因此，临床前收缩力模型必须具备准确的预测能力，以确保新药在临床开发阶段能够成功。然而，目前的临床前研究策略主要依赖简化的人工细胞模型（如过度表达特定心脏靶点的基因工程永生化细胞系）以及非人类动物模型，这些方法已显示出显著局限性，并与较高的药物淘汰率相关（即假阳性信号比例较高）1,2,3,4。因此，迫切需要建立新型且可靠的人源细胞心脏收缩力模型，具备高预测效能（即真实信号检出率高），以准确预测药物在人体中的效应，从而推动新疗法的加速上市5。

近期建立的用于获取供体人类心脏以开展研究6,7,8,9,10以及心肌细胞分离技术11,12,13,14,15的开创性方法，为在临床前研究阶段开展以人类为基础的研究提供了独特机遇。在此基础上，成人人类原代心肌细胞已成功用于评估药物引起的人类心脏收缩功能变化11,12,13,14。本文详细描述了在成人人类心肌细胞中研究新型化合物对收缩功能影响的实验方案。

方案

所有方法均按照相关指南和法规进行。研究中使用的人类心脏均为不可用于移植的心脏，且均来自美国（US）的遗体器官捐献者，通过知情的合法同意（本人或其近亲）以符合伦理的方式获取。心脏获取方案及 体外 实验已获得美国器官获取与移植网络（OPTN）内各移植中心机构审查委员会（IRBs）的预先批准。此外，所有供体心脏的转运均可全程追溯，并定期接受美国联邦机构的审查。

注意：在执行本方案期间，应采取所有必要的安全措施，包括穿戴适当的个人防护装备（例如，实验服、护目镜、手套）。

1. 心肌细胞的分离（测量收缩力前一天）

  1. 实验室内收到供体心脏后，立即用冰冻的专用心脏停搏液进行再灌注6，并从心室中酶解分离成年原代人的心肌细胞11,12,13,14,15。
  2. 随后将心肌细胞保持在悬浮状态，并将其与10 mL溶液A（110 mM蔗糖、0.005 mM CaCl2、3 mM MgCl2、70 mM KOH、60 mM乳糖二酸、10 mM KH2PO4、20 mM牛磺酸、20 mM L-组氨酸、20 mM HEPES、2 mM L-谷氨酸、2 mM L-(-)-苹果酸，用KOH调节pH至7.4）一同储存于20 mL Wheaton小瓶（材料表）中，在冷藏条件下保存，直至进行实验检测。
    ​注意：每瓶储存200,000个细胞。

2. 层粘连蛋白包被制备（测量收缩力前一天）

  1. 在八孔培养板（材料表）的每个孔中放入一片玻璃盖玻片（25 mm × 25 mm 正方形，材料表）。
  2. 随后，用浓度为 5 µg/mL 的层粘连蛋白对盖玻片进行包被。具体操作为：将 800 µL 人重组层粘连蛋白 521 原液（材料表，保存于 −20 °C）加入 7.2 mL 溶液 B（145 mM NaCl、4 mM KCl、2.5 mM CaCl2、1 mM MgCl2、11.1 mM 葡萄糖和 10 mM HEPES，用 NaOH 调节 pH 至 7.4）中，充分混匀。
  3. 将 200 µL 稀释后的层粘连蛋白溶液滴加至每片盖玻片中央，然后盖上培养板，置于 4 °C 冰箱中孵育。
    注意：应准备多个八孔培养板，以确保获得足够数量的层粘连蛋白包被盖玻片。

3. Ca的制备2+耐受性心肌细胞（测量收缩力当天）

  1. 从冰箱中取出一管细胞，吸除管内的溶液A，并加入10 mL冷藏的溶液B。
    注意：确保不要吸走细胞，将移液管置于管壁顶部内侧，使溶液B沿管壁加入，以充分分散细胞。
  2. 盖紧细胞管，轻轻旋转混匀，确保细胞在溶液B中均匀分散。最后，于室温（RT）静置1小时，使细胞沉降。

4. 记录系统的准备（测量收缩力当天）

注意：记录系统包括温度控制箱、刺激器、计算机控制的压力驱动灌流装置、压力驱动灌流瓶、自行开发的采集软件（可选择感兴趣区域（ROI）并显示收缩瞬变）、倒置显微镜、细胞灌流腔室和相机（图1）。

  1. 打开吸力真空系统。然后，取下显微镜盖，开启显微镜，连接相机（材料表，图1），最后确认风扇已开启，以确保相机不会过热。
  2. 接着，打开显微镜加热板（材料表）和温度控制箱（材料表，图1），并将其设定至适当的运行温度。接下来，开启场刺激器（材料表，图1）和压力系统。最后，将溶液管路（材料表）连接至记录室（材料表，图1）。

5. 测试化合物的制备（测量收缩力当天）

  1. 将二甲基亚砜（DMSO；材料表）用溶液 C（145 mM NaCl、4 mM KCl、1.8 mM CaCl2、1 mM MgCl2、11.1 mM 葡萄糖和 10 mM HEPES，用 NaOH 调节 pH 至 7.4）稀释 1000 倍，配制成含 0.1% DMSO 的溶剂对照溶液。
  2. 为检测某化合物在其治疗暴露浓度 0.001 µM 的 1 倍、10 倍、100 倍和 1000 倍下的效应，将待测化合物溶解于 DMSO 中，配制成 1 mM 的母液。
  3. 用 DMSO 对该母液进行连续倍比稀释，得到另外三个 DMSO 储备液（例如 0.001 mM、0.01 mM 和 0.1 mM）。最后，将每种待测化合物储备液取 100 mL 用溶液 C 稀释 1000 倍，获得最终测试浓度（0.001 µM、0.01 µM、0.1 µM 和 1 µM）。
  4. 将溶剂对照溶液及含不同终浓度待测化合物的溶液加入 100 mL 玻璃瓶中（材料表，图 1），然后将玻璃瓶连接至压力驱动灌流系统（材料表，图 1）。
  5. 随后，使用计算机控制程序（材料表）对灌流系统进行预冲洗，设定压力为 200–300 mbar，以维持 1.8 mL/min 的恒定灌流速度。
    注意：若发现待测化合物存在溶解度问题，则不应进行实验。此外，应在细胞实验开始前 30 分钟内，从储备液配制用于测试的化合物溶液。

6. 心肌细胞铺板（测定收缩性的当天）

  1. 从 4 °C 冰箱中取出含有层粘连蛋白包被盖玻片的八孔板，小心地将一张盖玻片放入一个清洁非常彻底的记录室中（图1）。然后将八孔板放回 4 °C 冰箱，以备下次铺板使用。
    注意：使用无尘擦拭纸（材料表）轻轻擦拭包被的盖玻片，同时保持盖玻片表面覆盖一层薄薄的层粘连蛋白。此外，确保将使用过的盖玻片丢弃至锐器盒中。
  2. 接着取一管已复苏的细胞（步骤 3.2），吸除小瓶中的溶液 B，尽量减少残留液体体积，但不得丢失细胞（约保留 200 µL）。随后，将这 200 µL 细胞悬液加入倒置显微镜载物台上已安装好的记录显微镜室中（材料表）。
  3. 让细胞在盖玻片上沉降 5 分钟。在等待细胞完全沉降期间，打开显微镜视野，检查细胞密度是否适合开始实验（约 70%）。
    ​注意：若加入的液体超过 200 µL，需确保抽吸操作不会将所有细胞吸走。

7. 心肌细胞收缩力的记录

  1. 铺板完成后，使用压力驱动灌流系统（材料表）持续灌注溶液C，使细胞平衡5分钟。正确调节负压，打开温控箱和加热板，并将其设定为约35 °C。
  2. 随后，在场刺激器上以1 Hz的起搏频率（持续时间为3 ms的双相脉冲）对细胞施加超阈值电压进行刺激，铂金丝成对放置于腔室相对两侧，并连接到场刺激器。
  3. 将刺激脉冲的幅度设为1 V，然后逐步增加电压，直至心肌细胞开始产生收缩-舒张周期。在整个实验过程中使用1.5倍阈值的刺激强度。
    注意：选择形态呈杆状、横纹清晰的健康细胞。然后调整视野，聚焦并尽可能多地将正在收缩的细胞纳入视野中（图2A）。
  4. 接下来，在光学收缩力记录系统的采集软件中显示细胞的数字化图像。该软件利用高分辨率、高帧率相机（帧速率为150 FPS）（材料表，图1）记录包含多个心肌细胞的视频流，所有细胞位于同一帧内。
    注意：这提供了足够的时空分辨率，可同时捕捉并测量多个健康心肌细胞的肌节动态。现代多核处理器被用于实时并行计算视频流中肌节长度的变化（光学密度数据来自用户在健康心肌细胞图像上定义的兴趣区域[ROI]，且ROI方向平行于收缩轴，图2B）。光学强度数据呈现出明暗相间的条带，对应于心肌细胞的Z线（图1，图2C）。最终，这些数据会实时显示给用户用于监测，并保存至磁盘以供后续分析（图2C）。
    1. 应避免选择不在焦平面上的细胞区域。此外，不要将ROI置于细胞边缘附近，因为在施加药物时细胞收缩的变化可能导致ROI无法准确读取收缩信号。
  5. 当完成ROI的选择，且收缩符合实验所需标准（例如，肌节缩短幅度>1%；在1 Hz起搏频率下呈现节律性收缩，无心律失常事件）时，开始实验以评估化合物的作用。刺激方案及测试浓度化合物的施加顺序见表1。采集软件将自动管理数据的采集与显示，并对测试浓度和处理时间进行标注。
    注意：只有在基线期（给予溶剂对照）期间收缩幅度保持稳定的情况下，才可施加测试浓度。若细胞表现出增强（run-up）或减弱（run-down）现象，则应予以剔除。同时，确保在整个实验过程中及时切换至不同的测试浓度进行灌流。
  6. 实验完成后，将数据存储至服务器，关闭灌流系统和加热装置，停止电刺激，用蒸馏水彻底清洗显微镜腔室，取下玻璃盖玻片，并将腔室充分干燥。
    注意：必须彻底清洁腔室，以防止下一组细胞提前暴露于任何残留化合物，从而避免所采集数据无效。
  7. 随后，重新铺板心肌细胞，并开展下一轮实验，以获取足够数据完成当前化合物的测试，或用于测试新的化合物。

8. 关闭光学收缩力记录系统

  1. 完成化合物的每日测试后，首先关闭所有非必要设备以清洁系统，并将数据复制用于离线分析。
  2. 接着，取下装有最终测试浓度溶液的 100 mL 玻璃瓶（材料表），替换为装有半满 RBS 25 浓缩液（材料表）的玻璃瓶。将 RBS 溶液灌流通过显微镜腔室 5 分钟，然后断开灌流管路与腔室的连接，用蒸馏水清洗管路，并彻底干燥。
    注意：确保真空系统工作正常，以防止可能的溢流。
  3. 接下来，将灌流管路连接至排水管路。使用压力驱动灌流系统（材料表）的软件，运行 RBS 溶液 10 分钟，同时确保压力和流速设置适当。然后灌流 1% DMSO 5 分钟，再用蒸馏水灌流 15–20 分钟，以完成灌流系统的清洁。
  4. 关闭显微镜光源并盖上显微镜罩。然后，从显微镜侧面的接线盒上拔下相机连接线，并关闭风扇。确保所有使用过的瓶子均已送洗并进行高压灭菌。最后，确保所有排水桶的液体不超过 1/4 满。
    注意：确保次日有足够的 laminin 涂层盖玻片可供使用。
  5. 最后，将每个记录系统上所有实验的采集文件夹中的文件复制，并粘贴至安全的备份服务器，用于进一步的离线分析。随后，从采集文件夹中删除所有数据文件。

9. 收缩力数据的分析

  1. 使用分析软件和自定义宏对数据进行离线分析，以计算平均值。该分析软件可从采集软件生成的肌节动力学数据中计算并报告多种指标。这些参数的详细列表见图2D。
    注意：应用底层软件技术可在5秒内完成对多组记录数据的分析。评估药物诱导收缩力变化的主要参数为收缩力振幅（肌节缩短百分比 = 肌节长度变化量）。该值计算方式为：峰值收缩时的肌节长度 / 静息肌节长度，并对每个测试浓度下最后20个收缩瞬变进行平均。
  2. 相对于每个心肌细胞特定的基线溶剂对照条件，量化测试化合物对平均收缩力振幅的影响。
  3. 将平均结果表示为均值 ± 标准误（SEM），并绘制测试化合物浓度对收缩力振幅影响的浓度-效应曲线图。随后，使用分析软件（材料表）将浓度-反应曲线拟合至Hill方程，以获得IC50（使收缩力振幅抑制50%的浓度）和EC50（使收缩力振幅增加50%的浓度）值。
  4. 除收缩力振幅外，还可计算其他参数：
    1. 后收缩：将后收缩识别为心肌细胞在下一次规律性收缩之前发生的自发性二次收缩瞬变，导致异常且不同步的收缩。
    2. 收缩失败：将收缩失败识别为电刺激无法引发收缩的现象。
    3. 短期变异性（STV）与交替性（alternans）：在收缩振幅变异性的Poincaré图中可视化这两个参数。
      1. 利用每种对照和测试物质浓度阶段的最后20个瞬变，计算STV（∑|CAn + 1 − CAn| (20 × √2)−1）。将交替性识别为重复出现的、长短交替的收缩力振幅瞬变。
      2. 为计算致心律失常事件的发生率，将各细胞的STV值归一化至其溶剂对照值，绘制后收缩、收缩失败、STV和交替性的结果，并以表现出每种信号的细胞百分比形式表示。
    4. 通过计算达峰时间（Ato peak）、衰减至30%舒张（Decay 30）、衰减至90%舒张（Decay 90）、达90%舒张时间（TR90）（图2D）、基线肌节长度、达50%峰值时间、峰值高度、峰值收缩时的肌节长度、最大收缩速度和最大舒张速度12，完成多参数机制谱型分析。与收缩力振幅类似，将这些参数相对于每个心肌细胞特定的基线对照条件进行表达，并在浓度-反应图中绘制成图。

结果

本方案描述了一种用于测量来自器官捐献者的分离成人原代心肌细胞收缩力，并评估测试化合物诱导的收缩力参数急性变化的方法。收缩力瞬变的测量采用基于视频的细胞形态学系统MyoBLAZER，该系统可检测肌节动态，并通过在生理起搏频率（1 Hz）下施加电刺激以模拟成人心脏条件来诱导心肌细胞收缩。通过评估心肌细胞的兴奋-收缩耦联功能（即连接电兴奋[肌膜动作电位]与机械收缩的细胞内过程）来确认细胞的功能活性。人类心肌细胞不存在自发性收缩瞬变，其收缩/舒张周期仅对外源性电刺激产生响应。图2C, E），以及异丙肾上腺素，一种 β-肾上腺素能激动剂（图 2F,G）。异丙肾上腺素可引起浓度依赖性的收缩力增强（图 2G)，并且还可以表征其对收缩力瞬变动力学的影响（图 2D)12.

电生理系统显微镜装置、实时数据分析显示器、神经元研究
图1：光学收缩力记录系统的实验装置。如前所述11,12,13,14，从成人原代心肌细胞中获取明场收缩力记录。该装置包括（A）温度控制箱、（B）场刺激器、（C、D）压力驱动灌流系统、（E）计算机压力驱动程序、（F）压力加压瓶、（G）采集软件、（H）通过采集软件选择感兴趣区域（ROI）、（I）通过采集软件显示收缩力瞬变信号、（J）倒置显微镜、（K）显微镜培养室以及（L）相机。所有设备的详细信息均列于材料表中。请点击此处查看该图的放大版本。

心肌分析，收缩测量图，肌节长度变化，异丙肾上腺素反应。
图2人类心肌细胞收缩力测量的验证及其效应 β-肾上腺素能刺激 (A代表性成人人心肌细胞的相差显微镜图像，B) 在健康心肌细胞图像上沿收缩轴方向设置的用户自定义感兴趣区域（ROI），C) 显示来自 ( 中相同 ROI 的收缩瞬变B) 使用采集软件，(D) 通过采集软件测量的与收缩瞬变相关的参数：收缩幅度、达峰时间、衰减30、衰减90、TR90。还可测量其他参数：静息肌节长度、达50%峰值时间、峰值高度、收缩峰值时的肌节长度、最大收缩速度和最大舒张速度。E在1 Hz起搏频率下，从成年人大类心室肌细胞记录到的典型收缩瞬变，对照组中加入溶剂对照（vehicle control）F）以及暴露于30 nM异丙肾上腺素（一种非选择性β受体激动剂）后 β-肾上腺素能激动剂。各图中所示的收缩力瞬变 E 和 F 从同一批心肌细胞中采集。使用以1 Hz起搏频率起搏的人心肌细胞中的异丙肾上腺素来生成效价信息。G) 异丙肾上腺素作用下人心肌细胞收缩力测量所得的典型累积浓度-反应曲线（n = 8 个细胞）。 请点击此处以查看此图的放大版本。

灌流序列溶剂溶液浓度 1 (µM)浓度 2 (µM)浓度 3 (µM)浓度 4 (µM)洗脱
处理时间120 s300 s300 s300 s300 s300 s
刺激频率1 Hz1 Hz1 Hz1 Hz1 Hz1 Hz

表1：刺激方案与测试化合物施加顺序。 在溶液C中持续记录120秒，以评估收缩瞬变的稳定性，并建立溶剂对照（通常为0.1% DMSO）。随后施加测试化合物浓度，持续至少300秒，或直至达到稳态效应。采用四个递增的测试化合物浓度，获得累积浓度-效应（C-E）曲线。在完成测试化合物的累积添加后，可进行300秒的洗脱期。

讨论

本论文提供了一种基于成人人心肌细胞收缩力的光学检测系统的详细实验方案，该方法简化了中等通量的检测流程，可用于评估新化合物的急性药效及心脏毒性。该光学收缩力记录系统操作简便，可同时对多个细胞进行平行记录，能够同步评估细胞的健康状态、生理特性及药理反应，配备自动化且快速的数据分析功能（一次多细胞实验的数据分析仅需5秒），并支持快速数据采集（每30分钟可完成一个化合物/设备的浓度-反应曲线）。鉴于上述特点，该记录系统不仅可用于检测药物对心肌细胞收缩力的影响，还可为药物发现早期阶段的药物化学研究提供构效关系数据16。由于一次心肌细胞分离实验可获得数千万个细胞，目前正探索将光学收缩力记录系统与心肌细胞平台结合，通过使用多孔板以提高检测通量并降低成本。此外，利用该记录系统测量药物对收缩期和舒张期参数的影响，可实现对正性肌力药物的多参数机制分析12。同时，心肌细胞收缩力数据还可用于对新型药物的心脏毒性进行排序（例如安全窗口，从高到低）以及药效强弱排序（例如效价窗口，从低到高）。对于临床上已观察到心肌收缩力下降的药物开发项目，也可进一步开展心肌细胞收缩力研究以提供支持12。

使用人心肌细胞收缩力光学记录系统的另一个显著优势在于其与“3R”原则（替代、减少和优化）17相一致，因为它可被视为一种替代方法，能够在制药行业中避免或取代动物用于数据生成。这一3R优势也可延伸至学术界的心脏研究领域。目前关于心肌细胞生理学和药理学的全部知识均来源于从动物心脏中分离细胞所开展的学术研究18。因此，人心肌细胞光学收缩力模型为开展关键的转化研究提供了可能。为了实施这些研究，必须建立用于保存和运输成人人心肌细胞的方案（目前在AnaBios实验室中评估），同时该收缩力系统必须具备记录非人源心肌细胞肌节长度变化的能力（光学收缩力记录系统具备此能力，因为肌节在不同物种间具有高度保守性）。

人类心肌细胞收缩力系统可模拟多种生理条件（例如，电机械耦合、模拟心率的起搏频率、体温、整合所有人类心脏靶点），并在药物发现中作为关键组成部分展现出转化应用价值11,12,13,14，尽管它无法模拟心脏收缩周期中机械负荷和剪切应力的变化。目前，人们对心脏细胞外基质的结构与功能已有更深入的理解19，这类基质的开发有望克服机械负荷的限制，目前AnaBios实验室正在评估具有不同心脏样刚度的基质。人类心肌细胞光学收缩力系统的另一局限性在于缺乏支配心脏的神经网络（例如交感神经和副交感神经纤维）。20。通过共同应用神经递质（例如异丙肾上腺素，一种β-肾上腺素受体激动剂）可重新建立这种神经-心脏连接 β-肾上腺素受体；乙酰胆碱，M2毒蕈碱受体的激动剂），用于评估该化合物对心肌细胞收缩力的潜在影响。此外，收缩力瞬变的记录未同时测量动作电位和Ca2+ 转瞬现象，在评估药物对心电图和钙信号的影响时同样至关重要2+ 操作。尽管这种缺失可被视为该系统的局限性，但其影响并不严重，因为动作电位信号的记录（通过电流钳技术或电压敏感性染料）和Ca2+ 瞬时表达（含 Ca2+ 指示剂/染料可能具有细胞毒性。此类细胞毒性效应可能影响对新型心脏收缩调节药物的评估。相反，采用一种非侵入性光学方法，如本方案所述记录系统，能够保持心肌细胞的健康状态、生理特性和药理特性，不仅可确保获得最高质量的收缩功能数据，还能提供可良好预测新型药物在人体内收缩效应的数据。

披露

所有作者均为 AnaBios 公司的员工，且声明无利益冲突。

致谢

本工作由 AnaBios 公司和美国国立卫生研究院小型企业创新研究（SBIR）资助项目（1R44TR003162-01）资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100–1000 µL 过滤式宽口无菌吸头移液器UF-1000W
100 mL Duran 加压瓶DWK 生命科学218102406
1 L，0.22 µm 真空过滤系统VWR567-0020
290 mmol/kg 渗透压标准品WescorOA-029
台式 pH 计梅特勒-托利多https://www.mt.com/us/en/home/products/Laboratory_Analytics_Browse/pH-meter/pH-meters.html
氯化钙二水合物（CaCl2）Sigma-AldrichC3881
相机 Optronis GmbHCyclone-25-150-Mhttps://optronis.com/en/products/cyclone-25-150/
Corning 25 mm × 25 mm 方形 #1 盖玻片Corning2845-25
Cyclone-25-150Optronishttps://optronis.com/en/products/cyclone-25-150/
D-(+)-葡萄糖Sigma-AldrichG8270
数字计时器/秒表费舍尔科学14-649-17
二甲基亚砜（DMSO）Sigma-AldrichD8418
八孔矩形聚苯乙烯无菌培养板赛默飞世尔科技73521-426https://us.vwr.com/store/product/4679368/nunclontm-delta-rectangular-dishes-polystyrene-sterile-thermo-scientific
FHD 显微镜腔室系统IonOptix
Flow EZ 模块化基于压力的流速控制器，计算机驱动程序版本 1.1.0.0Fluigent OxyGEN
重型真空瓶VWR16211-080
HEPESSigma-AldrichH3375
人重组层粘连蛋白 521BioLaminaLM521-05
Idex 色谱柱管路，天然 FEP 材质，外径 1/16" × 内径 0.030"科尔-帕默1520L
Kimberly-Clark 专业级 Kimtech Science Kimwipes 擦拭纸费舍尔科学06-666
L-(-)-苹果酸Sigma-Aldrich112577
乳糖酸Sigma-Aldrich153516
L-谷氨酸Sigma-Aldrich49449
L-组氨酸Sigma-AldrichH8000
氯化镁六水合物（MgCl2）Sigma-AldrichM9272
显微镜温控载物台加热器AmScopeTCS-100
MyoPacer 电场刺激仪IonOptix
Nunc 矩形培养皿Thermo Scientific267062
Olympus IX83P1ZF Ixplore 标准显微镜Olympushttps://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/inverted/ixplore-standard/?campaignid=657680540&adgroupid
=116963199831&keyword=ix73%20
microscope&gclid=EAIaIQobChMIl
qjyiMWP-AIVVx-tBh2JoQ85EAA
YASAAEgLp3fD_BwE
pH 4.01、7.00 和 10.01 标准缓冲液OaktonWD-05942-10
氯化钾（KCl）Sigma-Aldrich746436
氢氧化钾（KOH）Sigma-AldrichP4494
磷酸二氢钾（KH2PO4）Sigma-Aldrich795488
Prism 软件GraphPad Software - Dotmaticshttps://www.graphpad.com/
RBS 25 液体洗涤剂Sigma-Aldrich83460
锐器盒UlineS-15307
SigmaPlot 分析软件Systat Software Inc.https://systatsoftware.com/
氯化钠（NaCl）Sigma-AldrichS3014
氢氧化钠（NaOH）Sigma-Aldrich221465
学生用 Dumont #5 镊子精细科学工具91150-20
蔗糖Sigma-AldrichS7903
牛磺酸Sigma-AldrichT0625
温控箱Warner InstrumentsTC-324C
蒸汽压渗透压计ELITechGroupModel 5600
Wheaton 20 mL 小瓶DWK 生命科学225288

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