本实验方案描述了一种在小麦中进行全氟烷基酸长距离运输的简单高效方法。
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摘要
摘要
大量全氟烷基酸（PFAAs）已进入土壤并被植物吸收积累，对人类健康构成潜在风险。因此，研究PFAAs在植物体内的积累与转运过程至关重要。长距离运输是PFAAs通过韧皮部从植物叶片向可食用组织转移的重要途径。然而，以往在短期暴露条件下难以评估有机污染物的转运潜力。分根实验为利用水培方法有效揭示PFAAs的长距离转运提供了可行方案。本研究中，该实验在两个50 mL离心管（A和B）中进行，其中离心管A含有50 mL四分之一浓度的霍格兰无菌营养液，离心管B含有相同浓度的营养液，并添加了特定浓度的目标PFAAs（全氟辛烷磺酸，PFOS，和全氟辛酸，PFOA）。将一株完整的小麦根系人工分离为两部分，小心插入离心管A和B中。在培养箱中培养7天后收获，分别采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定小麦根部、地上部以及离心管A和B中溶液的PFAAs浓度。结果表明，PFOA和PFOS可通过韧皮部从地上部向根部进行相似的长距离运输，并可释放到周围环境中。因此，分根技术可用于评估不同化学物质的长距离转运能力。
引言
全氟烷基酸（PFAAs）因其优异的理化性质，包括表面活性以及热稳定性和化学稳定性，被广泛应用于各种商业和工业产品中1,2,3。全氟辛烷磺酸（PFOS）和全氟辛酸（PFOA）是全球使用最广泛的两种PFAAs4,5,6，尽管这些化合物已分别于2009年和2019年被列入《关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约》7,8。由于其持久性及广泛使用，PFOS和PFOA已在多种环境介质中被广泛检出。全球不同河流和湖泊地表水中PFOA和PFOS的浓度分别为0.15–52.8 ng/L和0.09–29.7 ng/L9。由于地下水或再生水用于灌溉以及将生物固体用作肥料，PFOA和PFOS在土壤中普遍存在，其浓度范围分别为0.01–123 µg/kg和0.003–162 µg/kg10，这可能导致大量PFAAs进入植物体内，对人类健康构成潜在风险。农业土壤和谷物（小麦和玉米）中PFAA（C4–C8）浓度之间存在显著的正线性相关关系11。因此，深入研究PFAAs在植物体内的积累与转运过程至关重要。
PFAAs在植物体内的转运首先从根部向地上部分组织进行，而PFAAs从根部向可食用组织的转运被视为长距离运输12,13先前的研究已在蔬菜和水果中检测出双酚A、壬基酚和天然雌激素14，这表明这些化学物质可能会迁移 通过 韧皮部。因此，揭示全氟烷基酸（PFAAs）在植物体内的转运过程对于评估其潜在风险具有重要意义。然而，PFAAs的积累与转运受其在土壤中生物有效性的制约，因而难以准确评价目标PFAAs在植物中的转运能力。此外，水培实验通常受限于多种因素，使得获取植物可食用组织更为困难。通常，研究人员直接从植物中采集韧皮部以观察有机化合物在植物体内的长距离转运，但从小苗植物中获取韧皮部组织十分困难。15因此，引入了一种简单而有效的方法——分根法，用于研究植物在相对较短暴露时间内PFAAs的转运情况。在分根实验中，将一株植物幼苗的根系分为两部分：一部分置于含有目标PFAAs的营养液中（A管），另一部分则置于不含PFAAs的营养液中（B管）。经过数天暴露后，采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定B管中PFAAs的含量。B管中PFAAs的浓度反映了PFAAs通过植物韧皮部的转运潜力。16,17,18.
分根实验已被用于研究多种物质在植物体内的长距离转运，例如CuO纳米颗粒17，类固醇雌激素18和磷酸酯类有机化合物16这些研究提供了证据，表明这些化合物能够转移 通过 将韧皮部运输至植物的可食用部分。然而，全氟烷基酸（PFAAs）是否有助于植物体内物质的转运，以及化合物性质对其影响，仍有待进一步研究。基于上述报道，本研究采用分根实验，以揭示PFAAs在小麦体内的长距离转运过程。
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方案
小麦种子（Triticum aestivum L.）购自供应商（见材料表），并用于本研究。
1. 小麦幼苗萌发与水培培养
- 选取大小相近的小麦种子，用8%（w/w）过氧化氢溶液消毒15分钟。
- 用去离子水彻底冲洗消毒后的种子，然后将其置于湿润的滤纸上，在室温避光条件下萌发5天。
- 选取约九株大小均匀的已萌发幼苗，转移至装有250 mL营养液（1/4浓度的霍格兰营养液；其化学成分见表1）的塑料烧杯中。
注意：九粒种子中，分别选取三粒用于空白组、PFOA组和PFOS组。 - 将幼苗置于人工气候室中培养7天后再进行处理，培养条件为14小时22 °C和10小时27 °C的循环。
2. 根系分割实验
- 在两个50 mL离心管（A和B）中进行幼苗培养。
注意：离心管A中含有50 mL无菌的1/4浓度霍格兰营养液，离心管B中也含有相同体积的营养液。- 将市售的PFOA和PFOS（见材料表）溶于甲醇中，并用无菌营养液稀释，配制成储备液。然后将储备液加入B管中，使PFOA/PFOS的浓度为100 µg/L。
- 每组处理设三个重复，并设置空白对照以监测背景污染。分根暴露实验的示意图见图1。
- 用镊子将小麦幼苗的整个根部分成两等份，确保根部仍连接在同一株地上部分上，并小心地分别插入A管和B管中。
- 用铝箔密封两个离心管，在培养箱中培养7天。培养条件应与步骤1.4中所述保持一致。
- 培养7天后收集小麦幼苗，并使用无菌剪刀将小麦分为三个部分：生长在添加PFAAs溶液中的地上部分和根部，以及生长在未添加溶液中的根部。
- 将植物样品置于冷冻干燥机中，在−55 °C下冷冻干燥48小时。
- 均质化并称量根和地上部分样品，同时收集添加和未添加溶液的样品。
3. 从植物组织中提取全氟辛酸和全氟辛烷磺酸
- 向一个15 mL聚丙烯管中加入2 mL碳酸钠缓冲液（0.25 mol/L）、1 mL四丁基硫酸氢铵（0.5 mol/L）和5 mL甲基叔丁基醚（见材料表），并加入已均质化的根或茎组织。
- 在250 rpm条件下振荡20分钟，然后在室温下以2,000 × g离心10分钟，收集上层有机相。重复提取过程两次。
- 合并收集的提取液，在温和的氮气（N2）气流下吹干，再用5 mL甲醇复溶，涡旋混合约30秒，保持相同转速。
- 用5 mL含0.1% NH4OH的甲醇溶液、5 mL水和5 mL甲醇依次对Pesticarb固相萃取柱（见材料表）进行活化处理。
- 将5 mL甲醇提取液过Pesticarb固相萃取柱（500 mg/6 mL），以去除色素，再用5 mL甲醇淋洗柱子，并将洗脱液收集至同一试管中。
- 将收集的10 mL甲醇溶液蒸发至近干，加入200 µL甲醇复溶，涡旋混匀后在室温下以10,000 × g离心20分钟。
4. 从营养液中制备样品
- 使用 5 mL 甲醇和 5 mL 水对极性增强型聚合物（PEP）固相萃取柱（60 mg/g，3 mL）进行活化（参见材料表）。
- 分别将 1 mL 加标溶液或 50 mL 未加标溶液样品（步骤 2.6）通过萃取柱。
- 用 10 mL 甲醇洗脱目标全氟烷基酸（PFAAs），用温和的 N2 气流将洗脱液吹干，然后用 200 µL 甲醇重新溶解，用于分析。
5. 仪器分析
- 采用超高效液相色谱（UPLC）与串联质谱（LC-MS/MS）联用技术，在多反应监测模式（MRM）和负离子电喷雾电离（ESI-）条件下对目标全氟烷基酸（PFAAs）进行定量分析（参见材料表）。
- 进样量为10 µL，使用C18液相色谱柱（1.7 µm，2.1 mm × 50 mm，参见材料表）分离目标PFAAs，流动相为水相含2 mM乙酸铵（A相）和甲醇（B相），UPLC流速为0.3 mL/min，色谱柱温度维持在50 °C。
注：PFOA和PFOS的离子跃迁分别为413→369和499→80。目标PFAAs的梯度洗脱程序及LC-MS/MS仪器参数详见表2。 - 使用数据分析软件处理数据（参见材料表）。
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结果
分根实验研究了全氟烷基酸（PFAAs）在小麦中的长距离转运。如图2A、C所示，全氟辛酸（PFOA）和全氟辛烷磺酸（PFOS）均可被小麦根系吸收并转运至地上部分。在空白对照组的A管中，未在小麦根系及溶液中检测到PFOS和PFOA。研究发现，在未添加目标物的营养液中培养的小麦根系中检测到PFOS和PFOA，其浓度分别为0.26 ng/g ± 0.02 ng/g和0.64 ng/g ± 0.05 ng/g干重（dw）（n = 3），分别占整株小麦中累积量的1.5%和1.8%。该结果表明，PFOS和PFOA可通过韧皮部从地上部分向根部进行长距离转运。值得注意的是，在未添加目标物的营养液中也检测到PFOS和PFOA，浓度分别为17.8 ng/L ± 0.28 ng/L和28.5 ng/L ± 5.9 ng/L（n = 3），这表明PFOA和PFOS能够穿过根部凯氏带19,20并释放到周围环境中。本研究结果提供了有力证据，表明长距离转运也是...
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讨论
为确保本方法的准确性，操作时必须小心，避免B管中的加标溶液污染A管中的未加标溶液。本研究中目标全氟烷基酸（PFAAs）的添加浓度相对高于其在真实环境中的浓度，以确保能够通过液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）对小麦样品和未加标溶液中的目标PFAAs进行有效监测。
该方法存在一定的局限性。由于每个处理组仅使用了一株小麦幼苗，且将其根部分为两半，若加标溶液的初始浓度相对较低，则最终处理所得的生物量较少，可能导致在未加标溶液中培养的小麦根部全氟烷基酸（PFAAs）浓度低于检测限。此外，由于暴露时间较短，无法确定PFAAs从根部向小麦可食用部分的转运情况。分裂根实验仅能分析具有不同性质的PFAAs在植物体内韧皮部的转运过程16。
该方法对于理解污染物在植物组织中的长距离运输具有重要意义12,13。根据研究结果，PFAAs 可被根部吸收，并主要通过木质部运输至地上部分；...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们衷心感谢国家自然科学基金委员会（NSFC 21737003）、高等学校博士学科点专项科研基金（编号：2452021103）以及中国博士后科学基金（编号：2021M692651、2021M702680）提供的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱 | Waters, Milford, MA | 液相色谱柱 | |
| Cleanert PEP 小柱 | Bonna-Angel Technologies, 中国 | 固相萃取柱 | |
| Clearnert Pesticarb 小柱 | Bonna-Angel Technologies, 中国 | 固相萃取柱 | |
| LC-MS/MS（Waters Acquity UPLC i-Class 联用 Xevo TQ-S） | Waters, Milford, MA | 液相色谱-串联质谱 | |
| 冷冻干燥机 | 博医康仪器有限公司，北京，中国 | FD-1A50 | 用于样品冷冻干燥 |
| Masslynx | Waters, Milford, MA | 数据分析软件 | |
| 甲基叔丁基醚 | Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US) | 用于从植物组织中提取目标化合物 | |
| MPFAC-MXA | Wellington Laboratories (安大略省，加拿大) | PFACMXA0518 | 内标物 |
| PFAC-MXB | Wellington Laboratories (安大略省，加拿大) | PFACMXB0219 | 全氟羧酸校准标准品混合物 |
| PFOA | Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US) | 335-67-1 | 一种代表性的全氟羧酸类化合物 |
| PFOS | Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US) | 2795-39-3 | 一种代表性的全氟羧酸类化合物 |
| 碳酸钠缓冲液 | Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US) | 用于从植物组织中提取目标化合物 | |
| 四丁基硫酸氢铵 | Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US) | 用于从植物组织中提取目标化合物 | |
| 小麦种子 | 中国农业科学院（北京，中国） | Triticum aestivum L. |
参考文献
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