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方法文章

从人窦状卵泡中提取、标记和纯化谱系特异性细胞

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DOI：

10.3791/64402

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2022年11月30日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Reproductive Medicine and Infertility, Weill Cornell Medical College, 2Tri-Institutional Stem Cell Derivation Laboratory, Weill Cornell Medical College

本文内容

摘要

本文介绍了从窦状卵泡中鉴定和纯化卵巢细胞的实验方案。我们详细阐述了对整个卵巢进行处理的方法，以便冷冻保存皮质条带，同时收集完整的窦状卵泡；这些卵泡通过酶消化处理，以分离出多种卵泡定居细胞类型，包括颗粒细胞、膜细胞、内皮细胞、造血细胞和基质细胞。

摘要

卵母细胞的激活、生长、发育和成熟是一个复杂的过程，不仅涉及卵巢内多种细胞类型之间的协调，还涉及下丘脑/垂体/卵巢轴中多个调控节点的协同作用。在卵巢内，多种特化的细胞类型与卵母细胞在卵巢卵泡内紧密相伴生长。这些细胞在后期阶段的生物学特性已有较为详尽的描述，此时它们可作为辅助生殖治疗的副产品被较容易地获取。然而，由于人类卵巢组织来源稀少，且接受辅助生殖治疗的患者难以获得卵巢组织，直接从卵巢中分离的小窦卵泡的深入分析并不常见。

这些处理整个卵巢的方法可用于皮质条带的冷冻保存，同时实现卵巢驻留细胞的鉴定与分离，从而能够对窦状卵泡发育的早期阶段进行高分辨率分析。我们展示了通过酶法处理不同大小和发育阶段的窦状卵泡，分离颗粒细胞、膜细胞、内皮细胞、造血细胞及基质细胞等特定细胞类型的实验方案。从不同大小和发育阶段的窦状卵泡中分离细胞，有助于全面分析驱动卵泡生长和卵巢生理的细胞与分子机制，并可提供可用于培养的活性细胞来源 关键词：卵巢，冷冻保存，皮质条带，窦状卵泡，细胞分离，颗粒细胞，膜细胞，内皮细胞，造血细胞，基质细胞，卵泡发育，卵巢生理 体外 模拟卵泡微环境。

引言

人类卵巢的主要功能单元是卵泡，其调控卵母细胞的生长与发育。在体外受精（in vitro fertilization）背景下，卵泡细胞的分离方案已较为成熟，但这些方法仅适用于在取卵时收集黄体化卵泡中的细胞1。我们开发了一种方案，可从天然卵巢或异种移植的卵巢组织中不同发育阶段的窦状卵泡中分离出独立的细胞群体2。尽管学界普遍认为卵泡内驻留细胞对卵母细胞的培育具有重要作用，但极少有研究前瞻性地识别并提取出窦状期卵泡中存在的独特表型亚型。深入理解特化细胞在不同发育阶段中的分化层级及其信号转导机制，有助于拓展我们对稳态及病理条件下卵巢生理学的认识。此外，明确不同细胞亚型及其分子功能在卵泡生长与成熟过程中的作用，可能为构建体外（ex vivo）替代系统提供途径，以重建卵巢功能，促进卵母细胞成熟和/或治疗内分泌功能障碍。

卵巢内每种独特的细胞类型共同参与卵泡的复杂功能，卵泡作为一个独立的微型器官，有效促进其所含卵母细胞的生长与成熟。卵母细胞是卵泡的核心，其周围由一层连续的颗粒细胞（GCs）直接包绕，而膜细胞（TCs）则形成第二层细胞，与卵母细胞及颗粒细胞共同构成卵泡功能单位。尽管颗粒细胞和膜细胞被分为两大类，但二者均包含多种亚型。颗粒细胞根据其在卵泡内的位置进行分类：围绕卵母细胞的颗粒细胞与邻近基底膜的颗粒细胞分别被称为卵丘颗粒细胞和壁层颗粒细胞，这些亚型表现出独特的转录组特征。膜细胞具有多种亚型，发挥类固醇生成、代谢及结构支持功能。内皮细胞、血管周细胞和免疫细胞在维持正常卵巢生理功能中起核心作用。卵巢间质不仅为卵泡生长提供基质，还可能提供可分化为膜细胞的前体细胞来源。卵巢内这种多层次的细胞亚型复合结构，使其能够同时发挥内分泌和生殖器官的功能。

本文介绍了一种从窦状卵泡中鉴定和纯化颗粒细胞、膜细胞、基质细胞、内皮细胞及造血细胞的实验方案。我们已利用该方案分离这些卵巢细胞，并通过单细胞测序对其进行分析，随后对不同发育阶段的卵泡进行特异性染色。该方案提供了一种简便且可重复的方法，有助于对卵巢的生理与病理过程进行高分辨率分析。

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方案

所有涉及小鼠的操作均经威尔康奈尔医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。使用卵巢组织进行的所有异种移植实验均依照相关指南和规定进行。卵巢组织取自一名14岁脑死亡器官捐献者，该捐献者无放疗/化疗史，且无内分泌或生殖系统疾病记录。威尔康奈尔医学院机构审查委员会（IRB）批准了组织采集，且已获得器官捐献者家属在知情同意基础上的使用许可。

1. 卵巢组织的采集与处理

  1. 采集完整的卵巢及附属组织，用无菌生理盐水冲洗。
  2. 使用无菌镊子将卵巢放入无菌容器中，加入无菌、缓冲、低温的溶液（例如 Leibovitz's L-15 培养基），确保组织完全浸没于液体中。
  3. 盖紧容器，并用无菌塑料袋双层封装。将容器置于冰上，放入独立的隔热箱（例如聚苯乙烯泡沫箱）中运输。尽快将样本转移至处理卵巢的实验室，最好在不超过 5 小时内完成3,4。

2. 卵巢组织的处理

注意：确保在组织到达实验室之前准备好所有试剂和工具，以尽可能缩短缺血时间。缓冲液可在冷冻前最多1周配制，并冷藏备用。

  1. 卵巢处理与冷冻前的准备工作
    1. 在生物安全柜中放置已灭菌的手术器械，以备组织处理使用：21号手术刀一把；11号手术刀一把；精细弯头剪刀一把；长镊子（约150 mm长）一把；中号镊子（约110 mm长）两把。
    2. 准备100 mL组织处理培养基（参见材料表）：含抗生素-抗真菌溶液的Leibovitz's L-15培养基，使用0.2 μm滤器过滤，保持培养基低温。
    3. 标记冻存管，每管加入1.5 mL冷冻保护液（参见材料表），并于4 °C保存。
    4. 准备一个6孔板备用。
  2. 组织送达后的处理
    1. 用70%乙醇溶液喷洒容器表面，彻底擦拭后放入生物安全柜内。
    2. 佩戴无菌手套打开容器，将卵巢置于无菌培养皿中，加入步骤2.1.2中的低温培养基以润湿组织，确保卵巢一半浸没在培养基中。
    3. 去除任何缝线或其他材料，并将卵巢周围残留的附属组织剥离干净。

3. 窦卵泡的分离

  1. 选择单个卵泡进行分离。在挑选健康卵泡时，应排除任何充血、颜色发暗或形态不对称的卵泡，因为这些卵泡可能已发生闭锁退化。
  2. 使用解剖刀从整个卵巢中分离选定的窦状卵泡，通过切除包围卵泡的皮质组织，保持卵泡腔的完整性。
  3. 将每个完整切除的窦状卵泡置于6孔板的一个孔中。如需测量描述，可在培养皿下方放置一把尺子以确定卵泡直径。
  4. 使用解剖刀将完整的窦状卵泡切开成两半，以进入窦腔，并加入4 mL酶消化细胞解离液。将培养板置于含5% CO2、37 °C的湿润化培养箱中孵育10分钟。
  5. 根据需要重复提取更多的窦状卵泡。

4. 卵泡驻留细胞的分离

  1. 孵育后，加入4 mL含20% FBS的培养基，用P1,000移液器反复用力吹打培养基，冲洗被切开的卵泡。
  2. 收集培养基，并通过 100 μm 滤膜 过滤器
  3. 离心过滤后的上清液，300 × g 4 °C 下离心 3 分钟。吸除上清液，将细胞沉淀（富含 GCs）置于冰上，用于后续标记及荧光激活细胞分选（FACS）。
  4. 将剩余组织置于含有胶原酶（100 U/mL）和分散酶（1 U/mL）的平衡盐溶液（如Hanks液）中，混匀后于5% CO₂条件下孵育30分钟。2 在10分钟和20分钟后，分别通过吹打（即移液器头反复吹打10–15次）进行两次剧烈的机械性组织破碎，温度保持在37 °C。
  5. 回收含有组织的培养基并冲洗 通过 使用P1,000移液枪枪头吹打混匀，并通过100 μm细胞筛过滤 过滤器
  6. 300 × g 离心 g 4 °C 下离心 3 分钟。吸除上清液，将细胞沉淀（富含 TCs 和基质细胞）置于冰上，用于后续标记和流式细胞分选（FACS）。

5. 荧光激活细胞分选

  1. 用封闭液（PBS + 0.1% FBS）重悬细胞沉淀，在 4 °C 下孵育 10 分钟。
  2. 在 300 × g 和 4 °C 条件下离心 3 分钟，吸除上清液。
  3. 用含有直接偶联抗体的封闭液重悬细胞沉淀（参见表 1中用于鉴定 GC 和 TC 的合适抗体组合），并在冰上孵育 10 分钟。
  4. 以 300 × g 和 4 °C 离心洗涤细胞 3 分钟。将细胞重悬于含有 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的 FACS 缓冲液中，通过 FACS 仪器运行细胞悬液，利用荧光偶联抗体的荧光强度设门，捕获少量细胞（500–1,000 个）。
  5. 为鉴定独特的亚群，采用以下设门策略：
    1. 为纯化 GC，围绕 CD45+ 细胞设门（图 1B），并将该群体从 CD99+ 群体中排除（图 1A 和 图 1C）；然后，进一步将剩余的 CD99+ 组分划分为 PVRL+/- 亚群（图 1A 和 图 1C）。
    2. 为纯化 TC 和基质细胞，对总的 ENG+（图 1A）或 CD55+（图 1D）群体设门，以排除 CD34+ 内皮细胞组分（图 1E），并区分类固醇生成性（ANPEP+）与非类固醇生成性（ANPEP-）细胞。注意对发射光谱相近的荧光染料之间的信号溢出进行补偿校正。
  6. 为验证分选后细胞组分的纯度，取总捕获体积的 5% 通过 FACS 仪器检测，确认细胞位于预期的设门区域内，且纯度达到 >95%。

6. 卵巢皮质组织的处理

  1. 将剩余的卵巢组织沿中线切开，使用弯头精细剪刀和手术刀小心切除髓质，注意避免损伤卵巢皮质。
  2. 通过轻柔刮除继续处理并减薄卵巢皮质，直至仅残留少量髓质。确保使用最小必要力度。
    注意：皮质组织的厚度应保持在 1 mm 至 1.5 mm 之间。
  3. 沿卵巢长轴方向将皮质组织切成 2–3 mm 宽的条状。

7. 卵巢组织慢速冷冻

  1. 冷冻前准备
    1. 将一条皮质条放入每个含有冷冻液的预冷冻存管中。
    2. 将装有皮质条的冻存管置于旋转板上，在 4 °C 下振摇 20 分钟。
  2. 卵巢组织的慢速冷冻5
    1. 将装有卵巢组织的冻存管放入程序降温仪中，起始温度设为 0 °C。
    2. 以 2 °C/min 的速率降温至 −7 °C。
    3. 在此温度下维持冻存管 10 分钟。
    4. 用经液氮（LN2）短暂浸泡的棉签触碰每支冻存管，以诱发冰晶成核。
    5. 以 0.3 °C/min 的速率继续降温，直至样品温度达到 −40 °C。
    6. 将降温速率提高至 10 °C/min，直至样品温度达到 −140 °C。
    7. 将冻存管转移至液氮（LN2）中进行长期保存。

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结果

我们从卵巢表面分离卵泡，并通过酶处理分离出卵泡腔周围的颗粒细胞（GCs）以及卵泡膜细胞和基质细胞。收集细胞后，利用流式细胞分选术（FACS）对来自卵泡腔卵泡（直径范围在0.5毫米至4毫米之间）的细胞组分进行分选。 >纯度 95%图 1).

为了标记和纯化人类窦卵泡内独特的细胞组分，我们将酶消化法与流式细胞分选技术相结合。我们先前已鉴定出特异性标记卵泡驻留组分的表面蛋白2。我们已证明，CD99（图 1A 中红色所示）特异性标记颗粒细胞，而随着窦卵泡体积增大，PVRL1（图 1A 中黄色所示）逐渐定位于卵丘颗粒细胞区室2。我们还证实，针对内皮糖蛋白（ENG，图 1A 中绿色所示）或 CD55（图 1D

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讨论

更清晰地解析卵巢卵泡内细胞多样性的临床意义重大，原因有多个方面。在应用上述方案分离窦状期卵泡内独特的表型亚型时，需考虑若干因素。首先，获取窦状卵泡的卵巢组织的健康状况和细胞活性，对于决定所获细胞的质量以及后续实验应用的成功至关重要。可通过缩短缺血时间、快速操作（最好两人配合）、并提前准备好用于组织处理和流式细胞分选（FACS）的实验空间来优化组织质量。其次，这些方案特别适用于窦状期卵泡，正是因为这些卵泡易于识别并从卵巢中分离，从而可高效进入窦腔；若采用类似方法研究早期或前窦状期卵泡，则所获得的细胞群体异质性将显著增加。最后，从卵泡中获得的细胞数量和质量会因卵泡发育阶段的差异以及是否已进入闭锁状态而存在较大差异。尽管这些限制因素使得卵泡发生过程的重建研究面临挑战，但高效且稳定的卵泡来源细胞分离方法将有助于进一步探究人类卵巢生物学及不孕症的潜在机制。

我们课题组此前已利用从窦状卵泡中纯化颗粒细胞（GCs）的方法，证明了抗苗勒管激素（AMH）超生理水平对卵泡发育的有害影响6。在该研究中，来自生育力保存患者和器官捐献者的冷冻保存并解冻的卵巢组...

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披露

所有作者均声明不存在利益冲突。

致谢

作者感谢Queenie Victorina Neri研究学者奖（D.J.）和Hung-Ching Liu研究学者奖（L.M.）提供的支持。N.L.G. 受到NYSTEM干细胞与再生医学博士后培训基金的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
化学试剂
抗生素-抗真菌素 100xThermo Fisher Scientific15240062Anti-Anti
抗荧光淬灭封片剂溶液Thermo Fisher Scientific P36930ProLong Gold
来自 Clostridium histolyticum的胶原酶Millipore SigmaC 2674
DAPIThermo Fisher ScientificD1306
Dispase II，粉末Thermo Fisher Scientific17105041
DMSOMillipore SigmaD 2650二甲基亚砜
不含钙、不含镁的DPBSThermo Fisher Scientific14190144
酶法细胞解离培养基 Thermo Fisher Scientific00-4555-56Accutase
胎牛血清，热灭活Thermo Fisher Scientific10438026
Hanks′平衡盐溶液Thermo Fisher Scientific14175079不含钙、不含镁、不含酚红
Leibovitz’s L-15 培养基 Thermo Fisher Scientific11415064
生理盐水Quality Biological114-055-101
蔗糖Millipore SigmaS 1888
冻存液（100 mL，经0.2微米滤器过滤）
- 69.64 mL Leibovitz's L-15
- 17.66 mL 胎牛血清
- 3.42 g 蔗糖
- 10.65 mL DMSO
- 1 mL 抗生素-抗真菌素
实验室塑料器皿与耗材
6孔透明平底未处理培养板 Corning351146Falcon
100 µm 细胞滤网Fisher scientific352360Corning, Falcon
冻存管Thermo Fisher Scientific377267CryoTube 1.8 mL
培养皿，直径 × 高度 150 mm × 25 mm Millipore SigmaCLS43059960EA
带滤网旋盖的圆底聚苯乙烯试管，5 mLFisher scientific352235Corning, Falcon
真空过滤/储存瓶系统，0.22 µmCorning431154
抗体
ANPEPBioLegend301703
CD34R&D SystemsFAB7227A
CD45BioLegend304019
CD55BioLegend311306
CD 99BioLegend371308
PVRLBioLegend340404
手术器械
长镊子（约150 mm长）Fisherbrand12-000-128Fisher Scientific
中号镊子（约110 mm长）Fisherbrand12-000-157Fisher Scientific
21号手术刀Andwin Scientific EF7281HFisher Scientific
11号手术刀Andwin Scientific FH/CX7281AFisher Scientific
尖头精细弯剪Roboz SurgicalRS-5881
仪器
FACSJazz 荧光激活细胞分选仪BD
LSM 710 META 共聚焦显微镜Zeiss

参考文献

  1. Aghadavod, E., et al. Isolation of granulosa cells from follicular fluid; Applications in biomedical and molecular biology experiments. Advanced Biomedical Research. 4, 250(2015).
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