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体外筛选靶向表观遗传沉默的工程化转录抑制因子

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DOI：

10.3791/64403

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2023年5月5日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1San Raffaele Telethon Institute for Gene Therapy (SR-Tiget), IRCCS San Raffaele Scientific Institute, 2Center for Omics Sciences, IRCCS San Raffaele Institute, 3Institute for Biomedical Technologies, National Research Council, 4Vita-Salute San Raffaele University

本文内容

摘要

在此，我们提出一种用于 体外 筛选具有高效、长期、稳定靶向沉默效果且全基因组范围内脱靶活性低的工程化转录抑制子（ETRs）。该工作流程可将初始复杂的候选ETRs文库缩减为适用于在治疗相关背景下进一步评估的精简列表。

摘要

基因失活对于研究基因功能至关重要，并且是治疗多种疾病的一种有前景的策略。在传统技术中，RNA干扰存在靶点抑制不完全以及需要终生治疗的局限性。相比之下，人工核酸酶可通过诱导DNA双链断裂（DSB）实现稳定的基因失活，但近期研究对该方法的安全性提出了质疑。靶向性表观遗传编辑 通过 工程化转录抑制因子（ETRs）可能是一种解决方案，因为单次给予特定的ETR组合即可实现持久的基因沉默，且不会诱导DNA断裂。

ETR 是包含可编程 DNA 结合域（DBD）以及天然转录抑制因子效应元件的蛋白质。具体而言，由三种 ETR 组成的组合——分别携带人源 ZNF10 的 KRAB 结构域、人源 DNMT3A 的催化结构域以及人源 DNMT3L——已被证明可在 ETR 靶基因上诱导可遗传的抑制性表观遗传状态。该平台具有“命中即逃逸”（hit-and-run）的特性，不改变靶标 DNA 序列，且可通过按需进行 DNA 去甲基化逆转至抑制状态，使表观遗传沉默成为一种变革性的工具。其中关键的一步是确定 ETR 在靶基因上的最佳作用位置，以最大化靶向沉默效果并最小化脱靶沉默。在最终的体外（ex vivo）或体内（in vivo）临床前环境中执行此步骤可能较为繁琐。

以CRISPR/催化失活Cas9系统作为ETRs的典型DNA结合域，本文描述了一种实验方案，包括 体外 针对高效靶向沉默，对与三重ETR组合偶联的向导RNA（gRNAs）进行筛选，随后评估筛选出的最优gRNAs的全基因组特异性谱型。该策略可将初始候选gRNAs的集合缩减为少量具有前景的候选者，其复杂度适于在具有治疗相关性的最终实验体系中进行验证。 在具有治疗相关性的目标环境中进行评估。

引言

基因失活传统上在细胞和动物模型中研究基因功能方面发挥着关键作用。此外，在过去二十年中，随着基因治疗的发展，基因失活被认为是一种具有变革潜力的策略，可用于治疗由功能获得性突变1、感染性疾病2或某些病理状态引起的疾病，其中沉默一个基因可能补偿另一个基因的遗传缺陷3。最后，有研究提出，通过遗传学手段失活细胞适应性和功能调控中的关键因子，可提高用于癌症免疫治疗4 和再生医学5的细胞产品的效率。

在实现基因失活的各种技术中，最有前景的技术之一是靶向性表观遗传沉默6,7。该技术的核心是所谓的工程化转录抑制子（ETRs），其为嵌合蛋白，由可编程的DNA结合结构域（DBD）和具有表观遗传抑制功能的效应结构域（ED）组成。锌指蛋白（ZFPs）8、转录激活因子样效应子（TALEs）9或基于CRISPR/dCas910的DBD均可被设计用于将ED特异性锚定至待沉默靶基因的启动子/增强子序列。一旦定位成功，ETR的ED即通过施加诱导异染色质的抑制性表观遗传标记来发挥其沉默功能，这些标记包括组蛋白修饰（如H3K911,12 或H3K2713 甲基化、H3或H4去乙酰化14）以及CpG DNA甲基化15，具体修饰类型取决于所使用的抑制结构域。

特别是受到植入前胚胎中内源性逆转录病毒发生永久性转录抑制的分子过程的启发16，已开发出三种ETR的组合，以利用以下效应结构域（EDs）：i）人ZNF10的KRAB结构域；ii）人DNMT3A的催化结构域；iii）人DNMT3L̈人ZNF10的ppel相关盒（KRAB）结构域；ii）人DNMT3A的催化结构域 从头 DNA甲基转移酶3A（DNMT3A）；以及iii）全长的人源DNA甲基转移酶3类似物（DNMT3L）。KRAB是高等脊椎动物中多种锌指蛋白（ZFPs）共有的保守抑制结构域17,18，其沉默活性主要基于其招募KAP1的能力19一种支架蛋白，随后与多种其他异染色质诱导因子相互作用20-包含核小体重塑和去乙酰化（NuRD）复合物21，组蛋白H3K9甲基转移酶SETDB122以及H3K9甲基化识别蛋白HP123,24，以及其他。

DNMT3A 能够在 DNA 的 CpG 序列上主动转移甲基基团25。DNMT3A 的催化活性在其与 DNMT3L 发生物理结合后得以增强；DNMT3L 是 DNMT3A 在胚胎细胞和生殖细胞中特异性表达的同源蛋白，缺乏负责甲基转移的催化结构域26，27。位于哺乳动物基因启动子/增强子元件内的富含 CpG 的区域——即 CpG 岛（CGIs）——其 DNA 甲基化通常与转录沉默相关28。重要的是，一旦建立，CpG 甲基化可通过 UHRF1-DNMT1 分子复合物在有丝分裂过程中稳定地遗传29。

在靶细胞中稳定过表达ETR可能存在问题，原因可能是随着时间推移，脱靶活性的风险增加，以及内源性相互作用分子从其生理靶位点被异常竞争（squelching）的可能性升高。然而，单个ETR组分的瞬时表达可能无法高效诱导长期的基因沉默30，限制了其在治疗中的应用。因此，该领域的一项开创性突破在于，基于KRAB、DNMT3A和DNMT3L的三种ETR联用可产生协同效应，即使仅短暂共递送，也能在靶基因启动子序列上诱导H3K9修饰和CpG甲基化。这些表观遗传标记可在细胞有丝分裂过程中被识别并持续传递，从而在多种人源和小鼠细胞系中实现可遗传的基因沉默，以及 体外 培养的原代细胞30.

值得注意的是，通过靶向（例如，在沉默位点招募基于CRISPR/dCas9的TET1 DNA去甲基化酶）或药物学方法（给予DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza）诱导DNA去甲基化，可按需逆转ETR介导的表观遗传沉默。30，可在发生与ETR相关的不良事件时作为潜在的解毒剂。此外，还描述了一体化的ETR，其包含基于KRAB、DNMT3A和DNMT3L的三个效应结构域（EDs），在细胞系中表现出显著的沉默效率31,32 针对绝大多数蛋白质编码基因。此外，多项采用工程化转录抑制因子（ETRs）的研究报道了其具有较高的安全性，在脱靶活性方面未见显著异常 从头 CpG甲基化或染色质可及性的改变30,31,32然而，在临床应用之前，建议对配备新设计的DNA结合域（DBD）的工程化转录抑制因子（ETR）进行专门的特异性谱型分析。

从临床角度来看，靶向性表观遗传沉默相较于基于RNA干扰（RNAi）的基因敲低33 和基于人工核酸酶的基因破坏8，可能具有关键优势。与RNAi不同，靶向性表观遗传沉默可在单个细胞中实现靶基因的完全抑制，且无需重复给药即可维持长期沉默效果；与基因破坏不同，该方法不改变DNA序列，避免产生DNA双链断裂（DSBs）。DSBs可能诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞，进而可能导致具有功能性p53通路的细胞被选择性清除34,35 ，尤其在多重基因编辑情况下，还可能引发染色体结构重排35。此外，基因破坏依赖于非同源末端连接介导的DNA双链断裂修复，该修复过程具有不可逆和嵌合性的特点36，因此无法避免靶位点修复后仍形成可翻译的开放阅读框，即产生有功能的编码序列作为最终结果之一；而表观遗传沉默则可根据需要被彻底逆转。

最后，表观遗传沉默有望将可靶向的遗传元件范围扩展至对RNA干扰和基因破坏完全或至少部分不敏感的类别，例如非转录调控元件和非编码RNA30,32。任何靶向性表观遗传沉默应用的首要关键步骤是设计一组覆盖目标基因不同调控序列的工程化转录抑制子（ETR），并鉴定出效果最佳的ETR。需要测试的ETR数量可能至关重要，因为可编程DNA结合技术不断发展，使得基因组中可靶向的区域比例持续增加37。直接在拟进行治疗性基因沉默的细胞类型中开展ETR筛选是最具相关性的选择。然而，由于原代细胞在培养中存活时间有限且通常基因操作效率较低，高通量筛选在技术上较为困难。体内的大规模筛选甚至更加难以实现。

一种更为实用的替代方案是，首先在易于基因操作的细胞系中对大量 ETR 进行初步筛选，随后仅对其中最具前景的候选者在具有治疗相关性的细胞类型中进行验证。另一个并行的问题是选择适当的检测指标以评估 ETR 的沉默效率。通过 RT-qPCR、Western 印迹或 ELISA 直接检测靶基因的转录本或蛋白水平可能成本较高且耗时较长，且灵敏度可能不足，从而限制其在高通量规模下的应用。因此，构建 临时的 通过将荧光蛋白置于目标基因调控序列的转录控制之下而构建的工程化报告细胞系，可利用基于流式细胞术的方法在单细胞水平上以高通量方式检测表观遗传沉默效应。

基于上述总体考虑，本文描述了一种实验方案：首先对表观遗传编辑因子（ETR）进行体外阵列式筛选，以评估其靶向沉默效率，随后对筛选出的最优候选因子进行全基因组范围的脱靶活性分析。该工作流程可将初始的候选ETR集合缩减为少量具有前景的候选者，从而降低复杂性，便于在具有治疗相关性的目标细胞类型中进行最终 评估。

在可用于构建 ETR 的多种可编程 DNA 结合域（DBD）中，本方案将重点采用 CRISPR/dCas9 技术，因为设计覆盖目标基因启动子区域的大量 gRNA 具有较高的便捷性。然而，下文所述的相同概念性工作流程也可用于评估配备其他 DBD 的 ETR 在效率和特异性方面的表现。

方案

1. 构建基于荧光的报告细胞系，通过流式细胞术监测目标基因的转录活性

  1. 确定表达待沉默目标基因的细胞系。在人类蛋白质图谱（Human Protein Atlas）38 中浏览待沉默的目标基因，并进入其“细胞系”部分，以鉴定代表目标体组织的细胞系（例如，若最终目标为肝细胞，则选择肝源性细胞系）。或者，可查询公开可用的RNA测序（RNA-Seq）数据库（如NCBI GEO）。
  2. 在候选细胞系中，优先选择已具备高效瞬时基因递送方案的细胞系，这对于ETR递送至关重要。
    注：在多种递送方式中，核转染（nucleofection）是最佳选择之一，因其可实现高转染效率。本实验中选用人红白血病K-562细胞，构建报告β-2-微球蛋白（B2M）基因转录活性的细胞系（以下简称B2MTdTomato K-562细胞）。
  3. 进一步筛选候选细胞系，避免选择目标基因对细胞存活至关重要的细胞系，因为这会妨碍在培养中维持目标基因稳定沉默的细胞。若此前未见报道，可通过将细胞转染Cas9核酸酶及靶向该基因首个编码外显子的gRNA，构建基因敲除对照，以评估目标基因在所选细胞类型中的必需性。
    注：基因敲除本质上是稳定事件；随时间推移对敲除细胞的负向选择表明，该目标基因对所选细胞的生理功能至关重要。
    1. 确定所选细胞系中优先使用的剪接异构体（本方案中靶向B2M基因的NM_004048.4异构体）。
    2. 选择可有效且特异性切割目标异构体首个编码外显子的gRNA（例如Chopchop（http://chopchop.cbu.uib.no/）39，这是一种有效且用户友好的在线gRNA筛选工具）。
    3. 对于K-562细胞，每5 × 105个细胞通过核转染递送1 µg的spCas9编码质粒（hCas9；见材料表）和250 ng的gRNA编码质粒（phU6-gRNA；见材料表）（按照制造商说明书操作）。
    4. 培养细胞（K-562细胞在37 °C、5% CO2条件下，使用含10%胎牛血清[FBS]、L-谷氨酰胺及青霉素/链霉素[100 U/mL]的RPMI-1640培养基），并利用突变检测试剂盒（遵循制造商说明书）随时间监测基因敲除水平。
  4. 克隆用于同源重组介导的供体质粒，以在目标基因转录调控下整合荧光报告基因（图1）。
    1. 确定目标基因中用于整合荧光蛋白表达盒的区域。
      注：避免靶向具有转录重要性的元件，如CpG岛及H3K27乙酰化富集区（活性启动子和增强子的标志）。改变这些调控元件（可能为ETR介导表观遗传沉默的关键靶点）会使报告细胞系对目标基因生理调控的预测能力下降。
      1. 若目标基因不编码分泌蛋白，可通过2A自剪切肽将报告基因融合至目标基因的最后一个密码子，以维持目标基因的功能性。
      2. 若目标基因编码分泌蛋白，为避免报告基因可能被分泌，应将报告基因置于目标基因的内含子区域。通过剪接受体位点（SA）强制报告基因整合至剪接后的转录本，并通过内部核糖体进入位点（IRES）启动翻译，但此方式会损害目标基因的功能性。
    2. 使用Chopchop工具选择在目标区域切割的gRNA（本实验中选择靶向B2M基因第一内含子序列5′-AGGCTACTAGCCCCATCAAGAGG-3′的gRNA）。
    3. 设计针对gRNA切割位点的供体质粒，包括：i）左同源臂（n个碱基对[bp]，与gRNA切割位点上游区域匹配）；ii）无启动子的转基因表达盒（本实验中为SA-3X终止密码子-IRES-tdTomato-BGH poly(A)，有利于与B2M基因第一内含子剪接）；iii）右同源臂（n bp，与gRNA切割位点下游区域匹配）。
      注：有效诱导同源重组所需的同源臂长度因细胞类型而异（K-562细胞的合适范围为100–500 bp）。
  5. 将CRISPR/Cas9核酸酶系统和供体质粒递送至目标细胞系。对于K-562细胞，每5 × 105个细胞通过核转染递送1 µg的spCas9编码质粒（hCas9；见材料表）、250 ng的gRNA编码质粒（phU6-gRNA；见材料表）和1 µg的供体质粒（按照制造商说明书操作）。
  6. 培养细胞至少14天（K-562细胞），并使用流式细胞仪随时间监测荧光报告基因的表达水平（激活藻红蛋白[PE]通道以检测tdTomato报告基因的荧光强度，并遵循制造商说明书进行流式细胞术操作）。
    注：供体质粒（尤其是基于质粒的）可能含有隐蔽启动子序列，导致非整合的供体拷贝表达荧光报告基因。培养细胞可通过细胞分裂稀释这些非整合拷贝，最终仅保留整合至目标基因组的供体拷贝所表达的报告基因。
  7. 通过荧光激活细胞分选（FACS）在单细胞水平克隆报告基因阳性细胞。本方案中，激活PE通道检测tdTomato报告基因的荧光强度，并遵循制造商说明书，将单个tdTomato阳性K-562细胞分选至96孔板的每个孔中。
  8. 细胞在培养中扩增后（K-562细胞通常需20–30天），通过PCR筛选报告基因阳性克隆，选择在目标位点实现报告基因盒双等位基因整合的克隆。
    注：这可最大化报告基因表达，并在ETR处理后通过流式细胞术更清晰地区分报告基因表达与沉默的细胞。
    1. 使用DNA提取试剂盒（遵循制造商说明书），从每个报告基因阳性克隆的1 × 105个细胞中提取基因组DNA。
    2. 使用正向引物（5'-GTATTTGCTGGTTATGTTAG-3'）和反向引物（5'-AATGGTTGAGTTGGAC-3'）扩增B2M目标区域（遵循PCR扩增试剂盒说明书）。该引物对在Taq DNA聚合酶及0.5 µM引物浓度下的退火温度为47.7 °C。
    3. 使用1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物（遵循制造商说明书）。筛选显示tdTomato整合至B2M目标位点的条带（3,413 bp），且无野生型目标位点条带（1,027 bp）的克隆。

2. 设计用于CRISPR/dCas9介导的靶基因表观遗传沉默的gRNA

  1. 在 UCSC 基因组浏览器中浏览目标基因40，并提取可能调控其转录活性的区域的核苷酸序列，例如 CpG 岛以及 H3K27 乙酰化富集位点（活性启动子和增强子的标志）。
    注意：根据最近的一项研究，最佳靶向区域是以目标基因转录起始位点为中心的 1 千碱基（kb）窗口32。
  2. 将选定的序列粘贴至 Chopchop 在线工具中，并选择抑制作为待获取 gRNA 的用途。等待 Chopchop 提供映射到目标基因序列上的 gRNA 列表，该列表将根据脱靶匹配数量和预测的靶向效率综合评分进行排序（图 2）。
  3. 为每个目标序列选择至少 10 条 gRNA。如有可能，尽量选择覆盖整个待研究区域的 gRNA，且在整个基因组中与其他基因内序列无完全匹配。

3. 在报告细胞系中阵列式瞬时递送基于 CRISPR/dCas9 的 ETRs

  1. 在先前报道的针对目标细胞系的转基因递送系统中，选择仅允许瞬时转基因表达、递送效率最大化且细胞操作相关毒性最小化的系统。对于 K-562 细胞，强烈推荐使用质粒和 mRNA 核转染，其中质粒制备是一种技术上更简便且成本更低的替代方案。
  2. 将第 2 节中选定的 gRNA 以及基于 CRISPR/dCas9 的表观遗传靶向调控系统（ETR）克隆至所选的转基因递送系统中。以下步骤提供了将 ETR 克隆至质粒 DNA 中的实验方案。
    注意：分别编码 dCas9:KRAB、dCas9:DNMT3A 和 dCas9:DNMT3L30 的质粒未在 Addgene 上提供。这些质粒是通过将质粒 pAC154-dual-dCas9VP160-sgExpression41（见材料表）中的 VP160 转录激活域替换为 KRAB、DNMT3A 或 DNMT3L 编码序列而构建的30。一种编码一体化 ETR（称为 CRISPRoff-v2.132）的质粒可获取（见材料表）。
    1. 将编码 ETR 的质粒转化至化学感受态 E. coli 细胞中（按照制造商说明书操作）。通过限制性酶切和 Sanger 测序筛选含有 ETR 质粒的菌落，最终选择一个阳性菌落进行质粒 DNA 中量制备（按照制造商说明书操作）。
    2. 将 gRNA 克隆至 phU6-gRNA 载体骨架中（图 3）。
      1. 使用分子生物学设计软件，在原间隔序列（所选 gRNA 的前 20 个可变核苷酸 [nt]）上游添加 5'-CACCG-3' 序列，在计算机中生成一条长度为 25 nt 的寡核苷酸，称为 SGfw。
      2. 类似地，在所选 gRNA 原间隔序列的反向互补序列上游添加 5'-AAAC-3'，下游添加 5'-C-3'，生成一条长度为 25 nt 的寡核苷酸，称为 SGrv。
      3. 订购 SGfw 和 SGrv 序列，作为无盐单链 DNA 寡核苷酸，以水溶解至 100 µM 浓度。
      4. 将每种寡核苷酸各取 1 µL 加入 2 µL 退火缓冲液（10 mM Tris [pH 7.5–8.0]，50 mM NaCl，1 mM EDTA）和 16 µL 水中。
      5. 将溶液置于热循环仪中进行寡核苷酸退火：程序设置为 95 °C 保持 10 分钟，随后在 45 分钟内逐渐降温至 25 °C。
      6. 将退火后的寡核苷酸取 1 µL 用 99 µL 无核酸酶水中稀释，然后取 1 µL 该稀释液与 50 ng 经 BsaI 限制性内切酶消化的 phU6-gRNA 质粒进行连接（遵循 BsaI 和连接酶试剂盒供应商提供的消化与连接操作说明）。
      7. 取 2 µL 连接产物转化 20 µL 化学感受态 E. coli 细胞（遵循制造商说明书进行转化操作）。
      8. 挑取多个菌落进行质粒 DNA 小量制备（遵循供应商说明书），并使用以下引物对 U6 启动子区域进行 Sanger 测序以验证原间隔序列的正确克隆：5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATT-3'。
      9. 选择一个阳性菌落进行质粒 DNA 中量制备（遵循制造商说明书）。
  3. 将选定的 gRNA 和基于 CRISPR/dCas9 的 ETR 以阵列形式递送至报告细胞系中（每种条件对应一个特异性 gRNA）（图 3）。
    注意：作为代表性示例，以下步骤展示了将编码 dCas9:KRAB、dCas9:DNMT3A、dCas9:DNMT3L 以及靶向 B2MTdTomato K-562 细胞中 B2M CpG 岛 gRNA 的质粒进行核转染的工作流程。
    1. 准备若干独立的离心管，每管分别含有 500 ng 编码 dCas9:KRAB、dCas9:DNMT3A 和 dCas9:DNMT3L 的质粒，但各管中待测试的 gRNA 不同（每管含 125 ng 编码 gRNA 的质粒）。设置一组不含 gRNA 和 ETR 的核转染条件作为模拟处理对照样本。每一样本至少进行三次技术重复。
    2. 每管收集 5 × 105 个 B2MTdTomato K-562 细胞，进行核转染（按照制造商说明书操作）。
    3. 将细胞重悬于 200 µL 预先温育的 RPMI-1640 哺乳动物细胞培养基中，并放回培养箱继续培养。

4. 随时间分析目标基因的转录活性

  1. 在递送ETRs后的不同时间点，使用流式细胞术测量沉默细胞的百分比（图4）。使用不携带荧光报告基因编码序列的野生型（WT）细胞来设定报告基因阴性细胞的阈值。使用模拟处理样本设定报告基因阳性细胞的门控范围。
    注意：如步骤1.3所述，实验中应包含基因敲除对照。这有助于同时监测CRISPR递送效率以及靶基因缺失后细胞的适应性；随着时间推移，若转录沉默和基因敲除效应均逐渐丧失，可能提示该靶基因在所选细胞类型中具有必需性。应包括短期（第3天、第7天、第10天）和长期（第21天、第35天）的时间点，以评估沉默作用的即时和持续效率。
  2. 根据长期沉默效率筛选出表现最佳的三个gRNA。使用FACS分选在这些样本中稳定维持的报告基因阴性亚群。同时，对总体模拟处理样本进行FACS操作，使其经历与实验组相同的处理流程，以便在后续分析中实现准确比较。

5. 通过RNA-seq和甲基化DNA免疫沉淀（MeDIP）-seq评估ETR处理的特异性

  1. 使用RNA-seq评估ETR递送后可能发生的全基因组转录失调。
    1. 对于经三种高效能gRNA处理后报告基因沉默的细胞亚群以及模拟处理的细胞，使用市售试剂盒提取RNA。使用市售试剂盒评估RNA的质量和浓度。
    2. 使用市售的RNA-seq文库制备试剂盒进行RNA片段化、逆转录和文库构建（遵循生产商说明书操作）。
    3. 使用与下一代测序和数字电泳兼容的质量控制仪器进行文库定量和质量控制。
    4. 按照制造商说明，在下一代测序仪上对序列文库进行测序，采用100 bp双端测序方案，目标为每个样本平均获得4500万条读段。
    5. 将测序读段比对至相应参考基因组，并定量转录本表达水平。对 tdTomato 序列进行单独比对并定量。
      注意：此处使用 STAR 软件（v 2.3.0）43，使用默认参数，与 Rsubread 软件包结合44 被使用。
    6. 根据已发表的最佳实践对RNA-seq数据进行分析45.
      注意：R/Bioconductor 软件包 edgeR46 此处采用每百万计数中至少在一个样本中达到1个计数（cpm）的标准，且该标准需在至少三个样本中满足，以剔除低表达基因。或者，也可使用edgeR中的filterByExpr函数进行筛选。
    7. 使用 edgeR 软件包中实现的负二项广义对数线性模型（函数 glmFit）评估基因表达差异47. 将校正后的阈值设为 0.01 p 值（Benjamini-Hochberg [BH] 校正）以保留差异表达基因。
  2. 通过 MeDIP-seq 评估 ETRs 可能存在的脱靶 CpG 甲基化活性。
    1. 对于经排名前三的gRNA处理后报告基因沉默的细胞亚群以及模拟处理的细胞，使用市售试剂盒提取基因组DNA（遵循生产商说明书）。
    2. 使用超声波破碎仪，对500 ng基因组DNA进行超声处理，参数如下： 占空比：20%；脉冲强度峰值：175；每簇周期数：200；时间：40 s.
    3. 使用市售的 MeDIP-seq 试剂盒（遵循生产商说明书）制备测序文库。
    4. 连接接头后，使用商用文库定量试剂盒（按照生产商说明书）通过荧光定量法测定文库浓度，并利用qPCR检测连接效率。
    5. 通过随机选择文库并混合以获得文库池，以减少技术偏差。每个文库使用相等的量（ng）进行混合，以平衡文库池。向每个文库池中加入试剂盒提供的甲基化和非甲基化外源对照DNA。为对照目的，保留10%体积的文库，标记为“input”，不进行免疫沉淀。使用MeDIP-seq试剂盒中提供的针对5-甲基胞嘧啶的单克隆抗体，对剩余90%的文库进行免疫沉淀。
    6. 使用5-甲基胞嘧啶免疫沉淀产物纯化试剂盒，按照制造商说明书对富集文库和输入文库进行纯化。
    7. 使用试剂盒提供的引物，对内参 spike-in 对照进行定量实时 PCR，以评估富集效率。针对每次免疫沉淀（IP），根据甲基化与非甲基化 DNA 的回收情况计算富集特异性，采用 qPCR 反应获得的 MeDIP 和 input 组分的循环阈值（Ct 值）进行计算（见公式 1 和 2）：
      MeDIP 效率的回收率计算公式，显示百分比计算方法及方程。 (1)
      特异性公式，非甲基化DNA回收率/甲基化DNA回收率，生物学研究中的计算公式。 (2)
      注意：如果特异性值 ≥0.95，则认为免疫沉淀文库构建成功。
    8. 使用 MeDIP-seq 文库构建试剂盒，按照生产商说明书扩增文库，并对产物进行定量及文库片段大小分布分析。
    9. 在下一代测序仪上进行文库测序。采用双端测序，读长为100 bp，目标平均测序深度为每样本3000万条读段。
    10. 使用 bwa（v 0.7.5 或更高版本）将测序读段标签比对至相应参考基因组（例如 hg38）48 然后使用 MACS（v 2.0.10 或更高版本）识别峰49，从而能够识别出宽广的峰（-slocal = 0，-llocal = 500000）。
    11. 使用 BEDTools 的 multiintersection 工具从不同样本创建一组共有区域50，启用聚类选项。
    12. 使用 BEDTools 的 multicov 计算每个样本在最终区域列表上的覆盖度，排除重复的读段。
    13. 使用 edgeR 对矩阵计数进行分析。应用过滤条件：至少在三个样本中每百万计数（cpm）不低于1，以剔除富集度较低的区域。
      注意：也可以使用 edgeR 中的 filterByExpr 函数。
    14. 通过采用 edgeR 中实现的广义对数线性模型（函数 glmFit）并结合条件分位数标准化，识别差异甲基化51 通过按区域校正 GC 含量，应用 BH 调整后 p 值阈值 0.01 筛选差异甲基化区域 p 数值。按如下步骤进行重复序列的分析。
      注意：有关所有选项和参数的完整列表，请参考 edgeR 用户指南（https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html）。
      1. 筛选 MeDIP-seq 结果以获得名义上的 p 值 <0.01，并创建两组区域：选择具有 logFC 的区域 >第一组中具有 logFC 的区域 <第二组中的 -1。
      2. 获取所选基因组的 RepeatMasker 注释文件（bed 格式），并统计每组中元件的数量。将计数结果转换为每个数据集区域数量的比值。
      3. 提取与每类重复序列重叠的甲基化组比例，并进行卡方检验以检测是否存在显著富集。
  3. 评估在ETR处理样本与模拟处理样本之间差异转录或差异甲基化的区域是否定位于 计算机模拟预测的脱靶gRNA结合位点
    1. 使用 CRISPR 设计工具套件52 作为脱靶gRNA结合预测工具。
    2. 对于每个推测的脱靶区域，查看其最近的转录起始位点（TSS）和最近的甲基化区域。若该区域与一个以FDR调控的基因相关，或与一个甲基化区域重叠，则将其视为真实的脱靶效应。 <0.01 且与转录起始位点（TSS）距离小于 10 Kb，或受 FDR 调控的甲基化区域 <0.01 且距离小于 1 Kb。
    3. 确定经三种表现最佳的gRNAs处理的样本与模拟处理样本相比，转录水平发生改变或过度甲基化的区域数量及特征图5）以确定gRNA中特异性最高的序列。根据脱靶位点对目标细胞生理功能影响的潜在程度，按以下顺序进行排序（从影响最大到影响最小）：
      i) 基因内调控区-生理表达基因
      ii) 基因内含子外区域—生理条件下表达的基因
      iii) 基因内含子区域—生理条件下表达的基因
      iv) 基因内部调控区—非表达基因
      v) 基因内部外显子区域—非表达基因
      vi) 基因内部的内含子区域—非表达基因
      vii) 基因间区

结果

在将供体模板与CRISPR/Cas9系统联用以实现荧光报告基因在靶位点通过同源重组介导的整合后（例如，通过电穿孔将质粒导入K-562细胞），处理后的样本中会出现报告基因阳性细胞（图1，底部）。如果未出现阳性细胞，应重新检查供体模板和CRISPR/Cas9试剂的设计与克隆准确性。若确认无误，则尝试优化试剂剂量及递送方案本身。

获得报告细胞系后，选择目的基因的启动子/增强子序列，并设计一组相应的gRNA。使用Chopchop等in silico预测工具来识别gRNA序列，并根据预测的效率和特异性对其进行排序（图2）。如果未检索到任何gRNA，请检查目标序列中是否存在典型的Cas9原间隔序列邻近基序（PAM）（5'-NGG-3'）。若无PAM序列存在，可考虑改用基于非PAM依赖型Cas9变体的表观靶向调控系统（ETR）（目前尚未发表使用这些变体的ETR），或转向其他DNA结合结构域平台，如ZFPs53或TALEs30。如果仅检索到预测效能/特异性较低的gRNA，则可考虑：1）测试这些低质量gRNA，或2）扩展目标DNA序列范围，以寻找更优的gRNA。在将三重ETR组合（或CRISPRoff；v2.1）与gRNA瞬时递送后，对荧光报告基因的表达进行纵向流式细胞术分析，通常在急性期分析时观察到报告基因抑制达到峰值，随后由于编码ETR的质粒在细胞分裂过程中逐渐稀释，抑制效果至少部分被逆转（图4C）。如果ETR/gRNA组合能够在目标位点有效沉积CpG甲基化，则在相当比例的处理细胞中将实现报告基因的持久性抑制（图4C）。不同的gRNA可能表现出差异化的长期沉默效率（图4B、C）。

对于全基因组特异性评估，可使用 MeDIP-seq 技术鉴定长期沉默靶基因的细胞与未处理细胞之间差异甲基化的区域。理想情况下，高特异性的 gRNA 应仅在靶位点诱导出一个从头 CpG 甲基化峰（图 5）。若未达到此结果，可考虑对在靶向效率列表中排名较低的 gRNA 进行脱靶活性表征。

使用CRISPR结合HDR进行基因编辑的示意图；包含tdTomato表达的流式细胞术结果。
图1：通过同源定向修复在人类B2M基因调控元件下整合tdTomato报告基因。顶部：利用CRISPR/Cas9诱导的同源定向修复，将tdTomato荧光报告基因整合至人类B2M基因第一内含子的策略示意图。底部：B2M基因第一内含子中整合tdTomato报告基因前后K-562细胞的代表性散点图。缩写：HA = 同源臂；HDR = 同源定向修复；IRES = 内部核糖体进入位点；pa = BGH多聚腺苷酸化信号（poly(A)）；SA = 剪接受体位点；WT = 野生型；3XSTOP = 三个串联的终止密码子。请点击此处查看该图的放大版本。

CRISPR sgRNA序列分布；比对图；基因组位置、GC含量数据分析。
图2：体外鉴定靶向B2M基因CpG岛的gRNA，按预测效率和特异性排序。Chopchop输出界面显示靶向B2M基因启动子区域内嵌CpG岛的gRNA，按与脱靶序列完全匹配（MM0）、1个错配（MM1）、2个错配（MM2）或3个错配（MM3）的数量以及预测的靶向效率进行排序。请点击此处查看该图的放大版本。

使用CRISPR/dCas9质粒核转染和阵列化筛选流程的基因编辑示意图。
图3：用于dCas9 ETR介导的表观遗传沉默的gRNA克隆与阵列化核转染。顶部：通过寡核苷酸介导的原间隔序列克隆至表达人源U6-gRNA的质粒中。底部：在K-562B2M/tdTomato细胞中，通过质粒核转染进行靶向B2M基因的gRNA阵列化筛选，实现基于CRISPR/dCas9的表观遗传沉默。请点击此处查看该图的放大版本。

基因编辑实验示意图；K-562细胞中B2M基因敲除；流式细胞术，CRISPR-dCas9结果。
图4：筛选有效诱导B2M基因长期沉默的gRNA。（A）上图：放大区域中B2MtdTomato基因的示意图，显示基于dCas9的ETR复合物与gRNA结合的相对顺序和方向。下图：B2MtdTomato K-562细胞在ETR沉默前（左）和沉默后（右）的代表性散点图。分析时间为转染编码gRNA及三重dCas9:KRAB + dCas9:D3A + dCas9:D3L组合质粒后第30天。（B）转染后第30天，靶向B2M基因CpG岛的指定gRNA（以混合物或单个gRNA形式）在K-562 B2MtdTomato细胞中的沉默活性（示意图上部的红色箭头表示gRNA的方向）。数据表示tdTomato阴性细胞的百分比（均值 ± 标准误；n = 每种处理条件下四次独立转染实验）。（C）转染表达三重ETR组合及指定靶向B2M CpG岛的gRNA质粒（或模拟转染，即无gRNA和ETR的对照组）后，B2MtdTomato K-562细胞的时间进程分析。数据表示tdTomato阴性细胞的百分比（均值 ± 标准误；n = 每种处理条件下三次独立转染实验）。未发表数据。图A和B改编自Amabile等30。缩写：CGI = CpG岛；IRES = 内部核糖体进入位点；pa = BGH多聚腺苷酸化信号；SA = 剪接受体位点；SD = 剪接供体位点；TSS = 转录起始位点；UT = 未转染；3XSTOP = 三个串联终止密码子。请点击此处查看该图的放大版本。

基因沉默分析；散点图、环形图、转录起始位点；B2M-IRES-tdTomato 研究。
图 5：通过 RNA-seq 和 MeDIP-seq 对 ETR 特异性进行全基因组分析。左侧：对照处理的 B2MtdTomato K-562 细胞与经三重 dCas9:KRAB、dCas9:DNMT3A、dCas9:DNMT3L ETR 组合及靶向 B2M 基因 CpG 岛的 gRNA 处理的细胞中基因表达水平的比较。数值以每千碱基每百万比对读段的 log2（RPKM）表示。黑点代表在所有条件下表达水平相近的基因；黄色圆圈代表在 FDR < 0.01 条件下差异调控的基因；红色圆圈代表 B2M-IRES-tdTomato 转录本。右上方：环状图显示对照处理的 B2MtdTomato K-562 细胞（蓝色）与经三重 dCas9:KRAB、dCas9:DNMT3A、dCas9:DNMT3L ETR 组合及靶向 B2M 基因 CpG 岛（CGI）的 gRNA 处理的细胞（绿色）的全基因组 MeDIP-seq 谱。右下方：显示了在指定样本中 B2MtdTomato 位点的甲基化状态。每个堆积图中包含三个重复；比对读段的堆积图使用高斯窗口进行平滑处理。本图改编自 Amabile 等人30。缩写：TSS = 转录起始位点。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

靶向表观遗传沉默可能为治疗需要永久性基因失活的疾病提供一种有前景的解决方案，这些疾病包括由功能获得性突变引起的疾病1、感染性疾病2，以及沉默某一基因可补偿另一基因遗传缺陷3 或充分释放过继细胞治疗潜力的病理状态4,5。通过在染色质水平发挥作用并由细胞自身进行自我传播7,30,32，表观遗传沉默可避免靶基因DNA序列发生毒性改变（例如染色体重排），以及人工核酸酶介导的基因破坏技术所存在的靶标部分且短暂沉默的问题8,34,35 ，同时也克服了RNA干扰介导的基因敲低技术的相应局限33。

在任何表观遗传沉默实验方案中，一个关键的初步步骤是确定靶基因上的合适位置，以引导表观遗传编辑器（ETR）在该位点沉积抑制性表观遗传修饰，从而关闭靶基因的转录活性。不同的转录起始位点近端和远端调控元件可能共同参与调控特定人类基因的转录输出54。此外，得益于可编程DNA结合技术的不断发展，现在可以针对特定调控元件识别出多个不同的靶向位点6。因此，在进入最终治疗相关场景中耗时且繁琐的候选位点评估之前，可利用本文所述这类在基因工程细胞系中开展的实验方案，预先筛选出适合ETR介导表观遗传沉默的单个靶位点或基因组区域。以下将进一步描述该实验方案中的一些关键环节。

构建可预测最终治疗靶点的报告细胞系
尽管细胞工程技术流程已持续优化——此处需将编码荧光报告基因的表达盒插入靶基因，并递送人工转录抑制因子（ETR）——但不能默认适用于最接近最终治疗靶点的细胞系的工程化方案已现成可用。在此情况下，可采用不同的应对策略：a) 利用供应商提供的优化试剂盒，在本实验室中针对目标细胞系优化转染方案；b) 转而使用其他表达该靶基因但来源于非最终治疗靶点组织的细胞系，这些细胞系的工程化流程已有充分优化。若上述选项均不可行，可考虑采用代表最终靶点的原代细胞或类器官。对于基于ETR的表观遗传沉默在临床前研究和治疗应用中的普遍情况，应排除靶基因对目标细胞类型具有必需功能的情形。ETR介导的必需基因完全且长期的沉默将导致靶细胞随时间推移被负向筛选（并可能引发治疗毒性）。在此类情况下，更宜采用可实现部分靶点抑制的替代技术，例如RNA干扰（RNAi）33。

评估ETR的靶向基因沉默活性
基于KRAB、DNMT3A和DNMT3L效应结构域组合的ETR已被证明对大多数蛋白编码基因有效，其容许的靶向窗口较宽，长度约为1千碱基，以转录起始位点为中心32。为了展示一次成功的表观遗传沉默实验应有的结果，本文提供了在K-562细胞中沉默B2M基因的技术细节与实验结果。该实验可作为重要的阳性对照，不仅适用于使用K-562细胞的研究人员，也适用于首次采用ETR技术的研究者。如实验方案所述，建议采用人工核酸酶（例如CRISPR/Cas9）介导的基因敲除作为额外对照，以评估目的细胞类型中基因递送的效率以及靶基因缺失细胞的表型。在初步筛选与CRISPR/dCas9系统偶联的gRNA后，若所测试的gRNA均无法实现对靶基因的长期沉默，则应依次考虑以下策略：1）增加递送的gRNA和ETR的量；2）测试表现最佳的gRNA组合，以探索其间的协同效应。若仍无法实现长期沉默，则应进一步考虑：3）测试其他gRNA，可能靶向更有利于诱导表观遗传沉默的位点；4）改用ZFP8或TALE9为基础的DNA结合结构域（DBD）平台，其对靶染色质的结合能力可能更强；5）从瞬时表达转为稳定表达，例如采用整合型病毒载体表达ETR（在使用CRISPR/dCas9技术时，可分别或同时稳定表达gRNA或dCas9融合结构）。由于本研究团队开发并长期使用三种独立ETR的共递送策略30，本文所述方案及结果均基于该方法。然而，类似的概念性工作流程也可能适用于一体化的CRISPR系统32。

ETR脱靶活性的评估
多项研究已显示出初步结果 体外 基于KRAB、DNMT3A和DNMT3L效应结构域组合的ETR特异性的相关证据30,31,32然而，如果在测试的gRNAs中，没有任何一个在转录调控和/或特异性谱型方面表现出满意的结果， 从头 DNA甲基化，可采取两种并非相互排斥的策略：a）通过降低ETR的剂量或测试替代性递送系统，减少ETR在细胞内的停留时间（从而降低其潜在的脱靶活性）。例如，与质粒相比，mRNA和蛋白质递送均有望缩短细胞暴露于ETR的时间，进而降低脱靶活性的可能性55；b）更换为经过优化以减少平台脱靶结合的较新Cas9变体56，或替代性ZFP8- 或 TALE9基于DNA结合的技术。需要注意的是，与模拟处理的样本相比，基因沉默的靶向和脱靶效应不仅受到DNA结合域（DBD）与其靶序列结合的影响，还可能受到表观遗传效应结构域通过其天然内源性共因子被招募至其他基因位点的能力的影响。因此，缩短ETR在靶细胞中的滞留时间，可能不仅降低DBD与脱靶位点结合的可能性，也减少ETR与内源性共因子相互作用的机会，从而在特异性方面具有潜在优势，但在靶向活性方面可能存在不利影响。最后，与模拟处理的样本相比，在沉默细胞中检测到的部分转录变化以及可能性更小的CpG甲基化改变，可能仅仅是由于靶基因缺失所致。这些不应被视为沉默技术的脱靶效应。为识别此类变化，实验设计中还应包括使用人工核酸酶进行基因破坏的对照组。8,9,10由于目标基因功能丧失所导致的生物学改变将在表观遗传沉默与该替代技术之间共享。

披露

AL 是 Chroma Medicine, Inc. 的联合创始人、持股人及顾问。

致谢

作者谨此感谢Angelo Amabile、Paola Capasso、Ilaria Caserta、Tania Baccega、Alice Reschigna、Valeria Mollica和Deborah Cipria多年来在开发表观遗传沉默技术过程中所付出的协作努力；感谢Dejan Lazarevic和Francesca Giannese对本方案中所述RNA-seq和MeDIP-seq分析的审阅。本研究工作获得了A.L.所获Telethon基金会（TIGET项目编号F1）和欧盟“地平线2020”计划（UPGRADE项目）资助的支持。插图使用BioRender.com制作。

作者贡献
A.M、M.A.C.、F.G. 和 A.C. 参与了实验方案的设计及论文撰写；S.V.、I.M. 和 D.C. 设计了方案中的生物信息学部分并修订了论文；A.M. 和 A.L. 设计了实验方案，并在所有作者的共同参与下构思和撰写了论文。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4200 TapeStation 系统AgilentG2991BADNA 定量
4D-核转染 X 装置Lonza Bioscience AAF-1003X核转染
B2M 沉默 gRNA #1  Lombardo's lab GCAATCAGGACAAGGCCCGC基因沉默
B2M 沉默 gRNA #2 Lombardo's lab GGGGTAGGAGAGACTCACGC基因沉默
B2M 沉默 gRNA #3 Lombardo's lab GAGTCCAGGGCTGGATCTCG基因沉默
BD FACSAria Fusion 流式细胞仪BD Bioscienceshttps://www.bdbiosciences.com/en-us/products/instruments/flow-cytometers/research-cell-sorters/bd-facsaria-fusion荧光激活细胞分选
bedtoolsBedtoolshttp://bedtools.readthedocs.io/en/latest/基因组区段处理
bwaIh3https://github.com/lh3/bwaMeDIP-seq 读段比对
Chopchop Valen's labhttp://chopchop.cbu.uib.no/gRNA 选择软件
Corning RPMI 1640 培养基（改良型）1× 含 L-谷氨酰胺Corning10-040-CV细胞培养
cqnBioconductorhttp://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cqn.html基于 GC 含量的区域归一化
CRISPR 设计套件Zhang's labhttps://zlab.bio/resources-2脱靶 gRNA 结合预测 
CRISPRoff-v2.1 质粒Addgene 167981基因沉默
CytoFLEX S V4-B4-R3-I2 流式细胞仪 Beckman CoulterC01161流式细胞术
B2M 基因第一内含子中 tdTomato 插入的供体模板序列 Lombardo's lab 

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cccatggatggtctagtcatgcctctcattttgg
aaagtactgtttctgaaacattaggcaatatatt
cccaacctggctagtttacagcaactgca

基因工程
E220 聚焦超声破碎仪Covaris500239DNA 超声破碎
edgeRBioconductorhttps://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html差异丰度检验
EnGen 突变检测试剂盒NEBE3321基因破坏定量
胎牛血清Sigma-AldrichF2442细胞培养
FlowjoBD Bioscienceshttps://www.flowjo.com/solutions/flowjo流式细胞术数据分析软件
凝胶上样染料，紫色（6×）NEBB7024SDNA 凝胶上样
Go Taq G2 热启动 DNA 聚合酶PromegaM7401PCR 扩增
B2M 基因第一内含子中 dTomato 插入的 gRNA 序列 Lombardo's lab AGGCTACTAGCCCCATCAAG基因工程
hCas9 质粒Addgene 41815基因工程
高灵敏度 D1000 试剂Agilent5067-5585DNA 定量
高灵敏度 D1000 ScreenTapeAgilent5067-5584DNA 定量
高灵敏度 RNA ScreenTapeAgilent5067-5579RNA 定量
高灵敏度 RNA ScreenTape 标准品Agilent5067-5581RNA 定量
高灵敏度 RNA ScreenTape 样品缓冲液Agilent5067-5580RNA 定量
IPure 试剂盒DiagenodeC03010011 5-甲基胞嘧啶免疫沉淀产物的纯化
K-562 细胞ATCCCCL-243细胞工程
KAPA 文库定量试剂盒RocheKK4824MeDIP-Seq 文库制备
MACS2Taoliuhttps://github.com/macs3-project/MACS甲基化富集区域的鉴定
MagMeDIP 试剂盒DiagenodeC02010020 5-甲基胞嘧啶免疫沉淀
NextFlex Methylseq 试剂盒 1 Bioo Scientific5118-01MeDIP-Seq 文库制备
NextSeq 500 / NovaSeq 6000IlluminaSY-415-1002 / 20012850下一代测序
转染级质粒 DNA 的 NucleoBond Xtra Midi 试剂盒Macherey-nagel740410.50中量提质粒制备
One Shot TOP10 化学感受态 细胞 ThermoFisherC404010质粒转化
pAC154-dual-dCas9VP160-sgExpression 质粒Addgene 48240基因激活
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB 质粒 Lombardo's lab 可应要求提供（lombardo.angelo@hsr.it）基因沉默
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB 质粒Lombardo's lab 可应要求提供（lombardo.angelo@hsr.it）基因沉默
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB 质粒 Lombardo's lab 可应要求提供（lombardo.angelo@hsr.it）基因沉默
青霉素/链霉素Sigma-AldrichP0781细胞培养
phU6.sgRNA 质粒Addgene 53188基因工程
PowerPac Basic 电源供应器Biorad1645050琼脂糖凝胶电泳
检测 B2M 基因第一内含子中 tdTomato 插入的正向引物序列 Lombardo's lab GTATTTGCTGGTTATGTTAG基因工程
检测 B2M 基因第一内含子中 tdTomato 插入的反向引物序列 Lombardo's lab AATGGTTGAGTTGGAC基因工程
QIAamp DNA Mini 试剂盒 Qiagen51304DNA 提取
QubitThermo FisherQ33238DNA 定量
Qubit dsDNA HS（高灵敏度）检测试剂盒Thermo FisherQ32851DNA 定量
Qubit RNA HS（高灵敏度）检测试剂盒Thermo FisherQ32852RNA 定量
限制性内切酶NEBDNA 消化
RNeasy Mini 试剂盒 Qiagen74106RNA 提取
RsubreadBioconductorhttps://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/Rsubread.html基因表达定量
SF 细胞系 4D-核转染 X 试剂盒 S（32 次）Lonza Bioscience V4XC-2032核转染
SnapGeneDotmaticshttps://www.snapgene.com/分子生物学设计软件
STARAlexander Dobinhttps://github.com/alexdobin/STARRNA-seq 读段比对
T100 梯度 PCR 仪Biorad1861096PCR 扩增
T4 DNA 连接酶PromegaM1801DNA 连接
TAE 缓冲液Fisher scientificBP1332500琼脂糖凝胶电泳
TruSeq Stranded Total RNA 试剂盒 Illumina20020597RNA-Seq 文库制备
UltraPure 琼脂糖ThermoFisher16500500琼脂糖凝胶 

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CRISPR dCas9 RNA CpG

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