方法文章

使用全基因组测序表征源自Oreochromis spp.农场的致病性大肠杆菌菌株

DOI：

10.3791/64404

⸱

2022年12月23日

 ,  ,  , 
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, 2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

本文内容

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摘要

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使用台式仪器进行全基因组测序（WGS）策略的可行性简化了实验室环境中对每种与公共卫生相关的微生物的基因组询问。描述了细菌WGS工作流程的方法学调整，并介绍了用于分析的生物信息学管道。

摘要

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水产养殖是全世界增长最快的粮食生产部门之一，罗非鱼养殖是养殖的主要淡水鱼品种。由于水产养殖做法容易受到人为来源的微生物污染，因此需要广泛使用抗生素，导致水产养殖系统成为具有临床相关性的抗生素耐药性和致病细菌（如大肠杆菌）的重要来源。在这里，通过全基因组测序（WGS）和计算机分析阐明了从内陆养殖的Oreochromis属中回收的致病性大肠杆菌菌株的抗菌素耐药性，毒力和移动组特征。进行了抗菌药敏试验（AST）和WGS。此外，使用各种可用的网络工具测定系统发育组、血清型、多位点序列分型（MLST）、获得性抗菌素耐药性、毒力、质粒和噬菌体含量。大肠杆菌分离株仅表现出对氨苄青霉素的中等敏感性，并通过基于WGS的分型法表征为ONT:H21-B1-ST40菌株。虽然仅检测到单个抗菌素耐药性相关基因[mdf（A）]，但鉴定出来自非典型肠致病性大肠杆菌（aEPEC）病理型的几个毒力相关基因（VAG）。此外，还检测到来自大型质粒组和18个噬菌体相关区域的质粒复制子的货物。总之，从墨西哥锡那罗亚州一个养鱼场回收的aEPEC分离株的WGS表征可以深入了解其致病潜力以及食用原始水产养殖产品可能造成的人类健康风险。有必要利用下一代测序（NGS）技术来研究环境微生物，并采用一个健康框架来了解健康问题的起源。

引言

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水产养殖是全球增长最快的食品生产部门之一，其生产实践旨在满足人类消费不断增长的食品需求。全球水产养殖产量从1997年的3400万吨增加到2017年的112吨，增加了两倍1。占产量近75%的主要物种群是海藻、鲤鱼、双壳类、鲶鱼和罗非鱼（Oreochromis spp）。1. 然而，由于集约化养鱼，微生物实体引起的疾病的出现是不可避免的，导致潜在的经济损失2.

众所周知，鱼类养殖实践中的抗生素用于预防和治疗细菌感染，这是生产力的主要限制因素3，4。尽管如此，残留的抗生素在水产养殖沉积物和水中积聚，施加选择压力并改变鱼类相关和居住的细菌群落5，6，7，8。因此，水产养殖环境是抗菌素耐药性基因（ARGs）的储存库，以及抗生素耐药细菌（ARB）在周围环境中的进一步出现和传播9。除了通常观察到的影响鱼类养殖实践的细菌病原体外，还经常遇到肠杆菌科的成员，包括肠杆菌属、大肠杆菌属、克雷伯氏菌属和沙门氏菌属 10 的人类病原体株。大肠杆菌是从鱼类养殖中从鱼粉和水中分离出的最常见微生物11，12，13，14，15。

大肠杆菌是一种多功能革兰氏阴性细菌，栖息在哺乳动物和鸟类的胃肠道中，作为其肠道微生物群的共生成员。然而，大肠杆菌具有高度的适应性，可以在不同的环境生态位中定植和持续存在，包括土壤，沉积物，食物和水16。由于通过水平基因转移（HGT）现象获得和损失，大肠杆菌已迅速进化为适应性强的抗生素耐药病原体，能够在人类和动物中引起广泛的疾病17，18。根据分离的起源，致病变异被定义为肠道致病性大肠杆菌（InPEC）或肠外致病性大肠杆菌（ExPEC ）。此外，InPEC和ExPEC根据疾病表现，遗传背景，表型性状和毒力因子（VF）细分为明确定义的病理型16，17，19。

致病性大肠杆菌菌株的传统培养和分子技术允许快速检测和鉴定不同的病理型。然而，它们可能既费时又费力，并且经常需要高技术培训19。此外，由于其遗传背景的复杂性，没有一种方法可用于可靠地研究大肠杆菌的所有致病变异。目前，随着高通量测序（HTS）技术的出现，这些缺点已被克服。全基因组测序（WGS）方法和生物信息学工具以经济实惠的方式大规模改善了对微生物DNA的探索，有助于在单次运行中对微生物进行深入表征，包括密切相关的致病变异20，21，22。根据生物学问题，可以使用几种生物信息学工具、算法和数据库来执行数据分析。例如，如果主要目标是评估ARG，VF和质粒的存在，则ResFinder，VirulenceFinder和PlasmidFinder等工具及其相关数据库可能是一个很好的起点。Carriço等人22详细概述了应用于微生物WGS分析的不同生物信息学软件和相关数据库，从原始数据预处理到系统发育推断。

一些研究表明，WGS在基因组询问抗菌素耐药性属性、致病潜力以及跟踪来自不同来源的大肠杆菌临床相关变体的出现和进化关系方面具有广泛的实用性23，24，25，26.WGS能够鉴定抗菌剂表型耐药性的分子机制，包括那些罕见或复杂的耐药机制。这是通过检测获得性ARG变异，药物靶基因中的新突变或启动子区域27，28。此外，WGS提供了推断抗菌素耐药性特征的潜力，而无需事先了解细菌菌株的耐药性表型29。或者，WGS允许表征具有抗菌素耐药性和毒力特征的移动遗传元件（MGE），这推动了现有病原体的细菌基因组进化。例如，在2011年德国大肠杆菌疫情调查期间应用WGS揭示了一种明显新颖的大肠杆菌病理型的独特基因组特征;有趣的是，这些暴发菌株起源于肠聚集性大肠杆菌（EAEC）组，该组从肠出血性大肠杆菌（EHEC）病理型30中获得了编码志贺毒素的噬菌体。

这项工作介绍了使用台式测序仪对细菌WGS工作流程的方法学调整。此外，使用基于Web的工具提供生物信息学管道来分析结果序列，并进一步支持生物信息学专业知识有限或没有生物信息学专业知识的研究人员。所描述的方法可以阐明致病性 大肠杆菌 菌株ACM5的抗菌耐药性，毒力和移动组特征，该菌株于2011年从墨西哥锡那罗亚州的内陆养殖 Oreochromis 属中分离出来12。

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方案

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注意: 大肠杆菌 菌株ACM5通过处理和培养鱼样品进行粪便大肠菌群（FC）测定12来回收。在鱼类取样期间，鱼类没有表现出疾病、细菌或真菌感染的临床症状，平均温度为22.3°C。分离后，将 大肠杆菌 分离株进行生化检测，并用DMSO（8%v/v）作为冷冻保护剂冷冻保存在脑心脏输液（BHI）肉汤中。

1. 重新激活冷冻 大肠杆菌 ACM5原液培养物

  1. 从冷冻的细菌原液中，打开试管并使用无菌环、移液器吸头或牙签刮擦冷冻细菌培养物的表面。
  2. 将细菌划线到Luria-Bertani（LB）琼脂平板上，并在37±2°C孵育24小时。

2.抗菌敏感性的测定

注意:此处描述的抗菌药敏试验对应于基于临床和实验室标准协会（CLSI）指南（M02 Ed13:2018）31的圆盘扩散方法。 大肠杆菌 质量控制需要ATCC 25922应变。

  1. 菌落悬浮法制备接种物
    1. 从步骤1.2中孵育的LB平板中，将一个或两个菌落划线到Mueller-Hinton（MH）琼脂平板上，并在37±2°C下孵育18-24小时。
    2. 使用无菌环从MH琼脂平板上新鲜传代培养的大 肠杆菌 分离物中挑选两个或三个菌落，并将它们重悬于3mL无菌MH肉汤或0.85%（w / v）盐水溶液中，通过涡旋充分混合以获得均匀的细菌悬浮液。
    3. 使用紫外可见分光光度计（见 材料表），将细菌悬浮液调节至与0.5麦克法兰标准品相当的浊度（相当于约1-2 x 108 个细胞/ mL）。如果细菌悬浮液太轻或太重，请酌情添加更多的 大肠杆菌 菌落或MH肉汤。在制备后15分钟内使用准备好的接种物。
  2. 接种测试琼脂平板
    1. 将无菌棉签浸入调整后的细菌悬浮液中。将拭子旋转几次并将其牢固地按在管子的内壁上，以去除拭子中多余的液体。
    2. 通过在整个琼脂表面上划线 3 次来接种 MH 琼脂平板，每次将平板旋转 60°。也擦拭琼脂的边缘，以确保接种物的均匀分布。
    3. 将培养皿盖半开3-5分钟，让水分蒸发。
  3. 将抗菌盘应用于接种的琼脂平板
    1. 均匀分布并将每个抗菌盘（见 材料表）向下压到接种的琼脂平板的表面上，以确保完全接触。在圆盘施用后15分钟内倒置板，并在35±2°C孵育16-18小时。
      注意:在分别150毫米和100毫米的培养皿中最多必须使用12个和6个圆盘。
  4. 孵育后，使用游标卡尺测量抑制尺寸区域，并根据CLSI断点标准（M100 - 表2A）32解释所得直径。

3. 基因组DNA（gDNA）提取和定量

  1. 基因组DNA提取
    1. 将一环新鲜培养的大 肠杆菌 菌落重悬于5mL LB肉汤中，并在37±2°C的振荡培养箱（180rpm）中孵育过夜。
    2. 将细菌悬浮液以3，500× g 离心5分钟，然后小心地弃去上清液。
    3. 按照DNA提取试剂盒指南提取gDNA（参见 材料表）。
    4. 通过使用紫外可见分光光度计测量 260/280 nm（比率:>1.8）和 260/230 nm（比率:2.0-2.2）的光密度来检查 gDNA 的纯度。进行0.8%琼脂糖凝胶电泳以验证gDNA的完整性。
  2. 基因组DNA定量
    注意:仅使用荧光检测试剂盒制造商批准的薄壁透明 0.5 mL PCR 管（参见 材料表）。
    1. 设置样品和检测标准品所需的试管数量。按照制造商的指南，通过混合试剂盒中提供的组分A和组分B来制备工作测定溶液。
    2. 通过将 190 μL 工作溶液和 10 μL 每种标准品加入适当的试管中来制备测定标准品（需要两种标准品）。
    3. 将 198 μL 工作溶液和 2 μL DNA 样品加入适当的试管中。通过涡旋所有管5秒来剧烈混合。小心不要产生气泡。
    4. 将所有试管在室温下孵育2分钟，避光。根据制造商的指南使用荧光计测量所有试管的荧光（参见 材料表）。
    5. 正确调整gDNA样品浓度以进行测序。

4. DNA文库制备

注意:DNA文库的制备和测序按照制造商的指南和方案进行（见 材料表）。起始gDNA浓度为4.0ng。

  1. 标记、PCR 扩增和索引
    1. 在 0.2 mL 管中，加入 2.5 μL 标记缓冲液和 2 μL 起始 gDNA （2.0 ng/μL）。通过移液轻轻混合。
    2. 加入 1 μL 扩增缓冲液，通过移液轻轻混合。在室温下以280× g 旋转1分钟。
    3. 将样品放入热循环仪（参见 材料表）中并运行以下PCR程序:55°C5分钟，然后保持在10°C。 当样品达到10°C时，立即进行中和反应。
    4. 向样品管中加入 1 μL 中和缓冲液，并通过移液轻轻混合。以280× g 旋转1分钟，并在室温下孵育5分钟。
    5. 添加 1.7 μL 的每个索引适配器（即索引 i7 和 i5）和 3 μL 索引 PCR 预混液。通过移液轻轻混合。在室温下以280× g 旋转1分钟。
    6. 将样品放入热循环仪中进行第二次PCR反应，如下所示:72°C3分钟，95°C30秒，18个循环95°C10秒，55°C30秒，72°C30秒，72°C5分钟，并保持在10°C。
  2. 放大库清理
    1. 根据制造商的指南涡旋商业磁珠溶液（见 材料表）进行混合。
    2. 将标记/索引的 gDNA 样品转移到新的 1.5 mL 管中，并为每 μL 最终体积的 gDNA 样品 （≈13 μL） 添加 0.6 μL 磁珠。通过移液轻轻混合，并在室温下孵育5分钟。
    3. 将样品管放在磁性架（参见 材料表）上2分钟，直到上清液清除。小心地取出并丢弃上清液，不要干扰珠子。
    4. 加入 200 μL 新鲜制备的 80% 乙醇，无需混合。孵育30秒，直到洗脱液清除，小心地取出并丢弃上清液而不干扰珠子。
    5. 执行第二个洗涤步骤。向珠子中加入 200 μL 80% 乙醇并孵育 30 秒。洗脱液清除后，取出并丢弃上清液，将珠子风干10分钟。
    6. 向磁珠中加入 15 μL 10 mM tris 缓冲液 （pH 8），并通过移液轻轻混合。在室温下孵育2分钟。将样品管再次放在磁性架上2分钟，使上清液清除。
    7. 小心地将 14 μL 上清液从样品管转移到新的 0.2 mL 管中。这是清理过的库。
      注意:此时，清理后的库可以在-20°C下储存长达7天。
  3. 库规范化
    1. 如步骤3.2所述，通过荧光测定继续定量净化的文库，步骤3.2.5除外。
    2. 在1%琼脂糖凝胶电泳上可视化净化后的文库，以确定平均片段大小。
    3. 使用以下公式计算库的摩尔浓度值:
      figure-protocol-1
    4. 使用摩尔浓度值，计算适当体积的重悬缓冲液（RSB）和净化的文库，以10 nM的起始浓度稀释单个文库。

5. 文库池化、去自然化和音序器启动

  1. 按照制造商的说明解冻试剂盒。从冰箱（4°C）中提取流通池，并在测序前将其置于室温。
  2. 将每个标准化文库 （10 nM） 的 5 μL 池化到低结合的 1.5 mL 管中。用适当体积的RSB在4 nM稀释合并库。
  3. 在新的低结合 1.5 mL 管中加入 5 μL 混合文库 （4 nM） 和 5 μL 0.2 N NaOH。通过涡旋短暂混合，以280× g 旋转1分钟，并在室温下孵育5分钟，使汇集的文库变性为单链。
  4. 通过移液轻轻混合 10 μL 变性混合文库和 990 μL 预冷杂交缓冲液，并置于冰上，直到执行测序仪上样的最终稀释液。变性合并库的浓度为20 pM。
  5. 通过混合 2 μL 对照文库 （10 nM） 和 3 μL 无核酸酶水，解冻并制备浓度为 4 nM 的对照文库（参见 材料表）。
  6. 混合 5 μL 对照文库 （4 nM） 和 5 μL 新鲜制备的 0.2 N NaOH。通过涡旋短暂混合，以280× g 旋转1分钟，并在室温下孵育5分钟以使对照库变性为单链。
  7. 通过移液轻轻混合 10 μL 变性对照库和 990 μL 预冷杂交缓冲液，并置于冰上，直到完成测序仪上样的最终稀释液。变性对照库的浓度为20pM。
  8. 在新的低结合 1.5 mL 管中，在 20 pM 时合并 594 μL 变性混合文库，在 20 pM 时合并 6 μL 变性对照文库。适当混合。
  9. 使用预冷杂交缓冲液在 600 μL 的体积中将最终文库混合物 （20 pM） 稀释至 1.2 pM 的最终上样浓度。
  10. 在将最终文库混合物加载到试剂盒之前，请执行额外的热预处理以实现高效上样到流通池中。将最终文库混合物在96°C下孵育2分钟。 倒置试管混合，并将试管放在冰上5分钟。
  11. 将 500 μL 最终文库混合物加载到试剂盒上的设计储液槽中。按照指南启动测序。加载流通池和试剂盒并设置测序运行。

6. 序列数据分析

注意:检查 补充文件 1 ，进一步描述大 肠杆菌 基因组的一般 WGS 数据预处理、软件、参数设置和序列分析。

  1. 连接到测序数据服务器并下载 FASTQ 文件。
  2. 使用第三方软件评估原始序列数据的初始质量。从原始测序数据中删除残留的接头序列、低质量碱基 （补充文件 1）。
  3. 使用第三方软件将经过质量检查的测序数据组装到重叠群或支架级别（参见 补充文件 1）。
  4. 通过将包含组装基因组的 FASTA 文件提交到 RAST 服务器 （https://rast.nmpdr.org/） 来执行基因组注释。
  5. 将FASTA文件上传到基因组流行病学中心（CGE）（http://www.genomicepidemiology.org/services/）和ClermonType（http://clermontyping.iame-research.center/index.php）网络平台，以确定流行病学特征，ARG，VAG和质粒（见补充文件1）。
  6. 将 FASTA 文件上传到 PHASTER 服务器以鉴定噬菌体序列 （https://phaster.ca/）。

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结果

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通过椎间盘扩散法测定抗菌药敏性，并通过CLSI断点标准解释跨越六个不同抗菌类别的12种抗生素，即氨基糖苷类、β-内酰胺类、氟喹诺酮类、硝基呋喃类、苯尼科尔和叶酸途径拮抗剂。 大肠杆菌 ACM5表现出对所有抗生素的敏感性，除了一种β-内酰胺类药物。测试了四种β-内酰胺类药物:氨苄西林、羧苄西林、头孢噻嗪和头孢噻肟。其中，测量了氨苄西林的14 mm抑制晕。因此，根据CLSI对氨苄西林（敏感:≥17毫米;中间:14-16毫米;耐药:≤13毫米） 32的解释类别， 大肠杆菌 ACM5显示出对氨苄西林的中等敏感性。

使用台式测序仪对 大肠杆菌 ACM5进行WGS。因此，按照所述方案制备、多路复用和测序 DNA 样品。总体而言，使用中间输出配置进行的测序运行产生了3.37 Gb的数据，错误率为0.73%，89.71%的碱基质量高于Q3033。特别是， 大肠杆菌 ACM5的测序总共产生了1，490，594个配对的末端（PE）读数。...

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讨论

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本研究介绍了使用台式测序仪和用于致病性 大肠杆菌 变体基因组表征的管道对细菌 WGS 工作流程的适应。根据所使用的测序平台，湿实验室程序（细菌培养、gDNA 提取、文库制备和测序）和序列分析的周转时间 （TAT） 可能会有所不同，尤其是在研究生长缓慢的细菌时。按照上述WGS协议，TAT在4天内，这与目前文献所述（<5天）相当 34。

计算大肠杆菌ACM5基因组测序的理论覆盖深度为30倍。尽管如此，测序为38倍深度的基因组组装生成了经验数据。如之前推荐的35，这足以获得整个基因组表征，并跟踪有关大肠杆菌ACM5的抗菌素耐药性，毒力和移动组特征的下游数据分析。关于抗菌素耐药性，仅研究了获得的决定因素。大肠杆菌ACM5是一种氨苄西林耐药分离株，但仅观察到MdfA多药外排泵编码基因。然而，这并不赋予β-内酰胺类 36 的抗性，并且没有发现与 β-内酰胺耐药有关的其他获得性决定因...

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

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墨西哥国家科学技术委员会（CONACyT西班牙语缩写）授予何塞·安东尼奥·马加尼亚-利扎拉加[第481143号]的博士奖学金。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Accublock 迷你数字干浴LabnetD0100用于试管孵育的干浴
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881用于 DNA 文库纯化的溶液中的磁珠
DeNovix DS-11DeNovix Inc.紫外-可见分光光度计，用于检查 gDNA 提取的
DNA 的质量 LoBind 管Eppendorf00301084181.5 mL PCR 管，用于 DNA 文库混合
DynaMag-2 磁力架，Thermo Fisher Scientific12321D基于磁珠的 DNA 纯化中使用的磁性微管架
革兰氏阴性 Multibac I.D.诊断研究（墨西哥）PT-35用于药敏试验的商用标准抗生素转盘
MiniSeq Mid Output Kit（300 次循环）IlluminaFC-420-1004用于双端测序的试剂试剂试剂 （2x150）
MiniSeq 系统仪器IlluminaSY-420-1001用于下一代测序的台式测序仪
MiniSpin 离心机Eppendorf5452000816标准离心机，用于试管
Nextera XT DNA 文库制备试剂盒，IlluminaFC-131-1024试剂，用于执行 DNA 文库测序。包括用于 24 个样品的盒 1 和盒 2 试剂
Nextera XT 索引试剂盒 v2IlluminaFC-131-2001、FC-131-2002、FC-131-2003、FC-131-2004索引集 A、B、C、D
PhiX 对照 v3IlluminaFC-110-3001用于测序的 DNA 文库对照
精密水浴LabCare America51221081用于细菌培养的水浴摇床
Qubit 1X dsDNA HS 检测试剂盒Invitrogen， Thermo Fisher ScientificQ33231用于荧光 DNA 定量测定的试剂
Qubit 2.0 荧光计Invitrogen， Thermo Fisher ScientificQ32866荧光计，用于荧光测定 
Qubit 检测管Invitrogen，Thermo Fisher ScientificQ328560.5 mL PCR 管，用于基于荧光的 DNA 定量检测 
SimpliAmp 热循环仪Applied Biosystems，Thermo Fisher ScientificA24811热循环仪，用于 DNA 文库扩增
Spectronic GENESYS 10 可见光Thermo335900光谱光度计，用于抗菌药物敏感性测试中的细菌悬浮
ZymoBIOMICS DNA 小量制备试剂盒Zymo Research Inc.D4300基因组 DNA 提取试剂盒（50 次制备）
液

参考文献

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勘误

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing
Posted by JoVE Editors on 2/02/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing. The Authors section was updated from:

José Antonio Magaña-Lizárraga1,
Bruno Gómez-Gil2,
Julissa Enciso-Ibarra2,
María Elena Báez-Flores1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, Ciudad Universitaria
2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

to:

José Antonio Magaña-Lizárraga1,
Bruno Gómez-Gil2,
Julissa Enciso-Ibarra2,
María Elena Báez-Flores1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa
2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

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