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方法文章

利用全基因组测序对源自罗非鱼（Oreochromis spp.）养殖场的一种致病性Escherichia coli菌株进行表征

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DOI：

10.3791/64404

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2022年12月23日

 ,  ,  , 
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, 2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

本文内容

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摘要

使用台式仪器进行全基因组测序（WGS）策略的可行性，已使实验室环境下对所有与公共卫生相关的微生物进行基因组分析变得更加简便。本文描述了细菌全基因组测序工作流程的方法学改进，并提供了一套用于分析的生物信息学流程。

摘要

水产养殖是全球增长最快的食品生产领域之一，罗非鱼（Oreochromis spp.) 养殖构成了主要的淡水鱼类养殖品种。由于水产养殖易受到来自人为来源的微生物污染，因此需要大量使用抗生素，导致水产养殖系统成为具有临床意义的抗生素耐药性和致病性细菌的重要来源，例如 大肠杆菌（Escherichia coli）. 此处描述了一种病原体的抗菌药物耐药性、毒力及可移动基因组特征 E. coli 菌株，源自内陆养殖环境 Oreochromis spp. 的基因组特征通过全基因组测序（WGS）得以阐明，且 计算机模拟 分析。进行抗菌药物敏感性试验（AST）和全基因组测序（WGS）。此外，利用多种现有的网络工具确定系统发育群、血清型、多位点序列分型（MLST）、获得性抗菌药物耐药性、毒力因子、质粒及前噬菌体组成。 E. coli 仅对氨苄西林表现为中介敏感，经基于WGS的分型鉴定为ONT:H21-B1-ST40菌株。尽管仅检测到一个与抗菌药物耐药相关的基因[mdf(A)]，来自非典型肠致病性大肠杆菌的多个毒力相关基因（VAGs） E. coli 鉴定出非典型致病性大肠杆菌（aEPEC）血清型。此外，检测到大型质粒群中的质粒复制子携带内容以及18个与前噬菌体相关的区域。综上所述，对分离自墨西哥锡那罗亚州某鱼类养殖场的aEPEC菌株进行全基因组测序（WGS）表征，有助于深入了解其潜在致病性及食用生食水产养殖产品可能带来的人类健康风险。有必要利用下一代测序（NGS）技术研究环境微生物，并采用“同一健康”（one health）框架，以探究健康问题的起源。

引言

水产养殖是全球增长最快的食品生产行业之一，其生产方式旨在满足人类日益增长的食品需求。全球水产养殖产量从1997年的3400万吨（Mt）增长至2017年的1.12亿吨（Mt）1。主要养殖物种类群包括海藻、鲤科鱼类、双壳类、鲶鱼和罗非鱼（Oreochromis spp.），其产量约占总产量的75%1。然而，由于集约化养殖模式，由微生物引起的疾病难以避免，可能导致严重的经济损失2。

在水产养殖实践中，抗生素的使用广泛用于预防和治疗细菌感染，这是影响生产效率的主要限制因素3,4。然而，残留的抗生素会在养殖沉积物和水中积累，施加选择性压力，并改变与鱼类相关及环境中固有细菌群落的结构5,6,7,8。因此，水产养殖环境成为抗菌抗性基因（ARGs）的储存库，并促进耐药细菌（ARB）在周边环境中的进一步出现和传播9。除了常见影响水产养殖的细菌性病原体外，还经常检出肠杆菌科（Enterobacteriaceae）成员，包括肠杆菌属（Enterobacter spp.）、大肠杆菌（Escherichia coli）、克雷伯菌属（Klebsiella spp.）和沙门菌属（Salmonella spp.）等人畜共患致病菌株10。其中，E. coli 是从水产养殖的鱼粉和水体中分离到的最常见微生物11,12,13,14,15。

E. coli 是一种多功能的革兰氏阴性细菌，作为哺乳动物和鸟类肠道微生物群的共生成员，栖息于其胃肠道中。然而，E. coli 具有高度适应能力，可在多种环境生态位中定植并持续存在，包括土壤、沉积物、食物和水16。由于通过水平基因转移（HGT）现象发生的基因获得与丢失，E. coli 已迅速进化为一种高度适应的耐药性病原体，能够引起人类和动物多种类型的疾病17, 18。根据分离来源的不同，致病性变异株被定义为肠致病性 E. coli（InPEC）或肠外致病性 E. coli（ExPEC）。此外，InPEC 和 ExPEC 还可根据疾病表现、遗传背景、表型特征以及毒力因子（VFs）进一步细分为明确的致病型16,17,19。

传统的培养方法和分子技术能够快速检测和鉴定致病性 E. coli 菌株的不同致病型。然而，这些方法可能耗时较长、操作繁琐，且通常需要较高的专业技术水平19。此外，由于 E. coli 遗传背景的复杂性，尚无单一方法可可靠地研究其所有致病变种。目前，随着高通量测序（HTS）技术的发展，这些局限性已得到克服。全基因组测序（WGS）方法结合生物信息学工具使得微生物DNA的大规模、低成本分析成为可能，能够在单次测序中实现对微生物的深入表征，包括亲缘关系密切的致病变种20,21,22。根据具体的生物学问题，可选用多种生物信息学工具、算法和数据库进行数据分析。例如，若主要目标是评估耐药基因（ARGs）、毒力因子（VFs）和质粒的存在情况，则ResFinder、VirulenceFinder和PlasmidFinder及其配套数据库可能是良好的起点。Carriço 等人22系统综述了从原始数据预处理到系统发育推断的整个流程中，应用于微生物全基因组测序分析的各种生物信息学软件及相关数据库。

多项研究已证明，全基因组测序（WGS）在探究来源于不同来源的临床相关E. coli变异株的抗菌药物耐药特性、致病潜力以及新发和进化关系方面具有广泛的应用价值23,24,25,26。WGS能够识别介导表型耐药的分子机制，包括那些罕见或复杂的耐药机制，其途径包括检测获得性耐药基因（ARG）变异、药物靶标基因或启动子区域中的新突变27,28。此外，WGS可在无需预先了解细菌菌株耐药表型的情况下，推断其抗菌药物耐药谱29。同时，WGS还能够对携带抗菌药物耐药性和毒力特征的可移动遗传元件（MGEs）进行表征，这些元件推动了现有病原菌的基因组进化。例如，在2011年德国E. coli疫情调查中应用WGS，揭示了一种明显新型E. coli病原型的独特基因组特征；有趣的是，这些暴发菌株源自肠聚集性E. coli（EAEC）群体，并通过获得来自肠出血性E. coli（EHEC）病原型的编码志贺毒素的前噬菌体而形成30。

本研究介绍了一种利用台式测序仪进行细菌全基因组测序（WGS）的工作流程方法学改进。此外，还提供了一个基于网络工具的生物信息学分析流程，用于分析所得序列，以支持缺乏或仅有有限生物信息学经验的研究人员。所描述的方法阐明了2011年从墨西哥锡那罗亚州内陆养殖的罗非鱼（Oreochromis spp.）中分离到的一株致病性E. coli ACM5的抗菌素耐药性、毒力因子及可移动基因组特征12。

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方案

注意：该 E. coli 通过处理并培养鱼类样本以测定粪大肠菌群（FC），分离出ACM5菌株12在鱼类采样期间，鱼类未表现出疾病的临床症状，也无细菌或真菌感染迹象，平均温度为 22.3 °C 占主导地位。分离后， E. coli 该分离株进行了生化检测，并在含8%（v/v）DMSO作为冷冻保护剂的脑心浸液（BHI）肉汤中冷冻保存。

1. 冻存样本的复苏 E. coli ACM5 菌种储备培养物

  1. 从冻存的菌种中取出冻存管，用无菌接种环、移液枪头或无菌牙签轻轻刮取冻存菌体表面。
  2. 将菌体划线接种于Luria-Bertani（LB）琼脂平板上，在37 ± 2 °C条件下培养24小时。

2. 抗菌敏感性测定

注意：此处所述的抗菌药物敏感性试验基于美国临床和实验室标准协会（CLSI）指南（M02 Ed13:2018）的纸片扩散法31。质量控制需使用大肠埃希菌（E. coli）ATCC 25922 菌株。

  1. 通过菌落悬浮法制备接种物
    1. 从步骤1.2中培养的LB平板上，挑取一个或两个菌落划线接种至Mueller-Hinton（MH）琼脂平板，于37 ± 2 °C培养18–24小时。
    2. 使用无菌接种环从MH琼脂平板上新鲜传代的E. coli分离株中挑取两至三个菌落，悬浮于3 mL无菌MH肉汤或0.85%（w/v）生理盐水中，通过涡旋振荡充分混匀，获得均匀的细菌悬液。
    3. 使用紫外-可见分光光度计（见材料表），将细菌悬液的浊度调整至相当于0.5麦氏比浊标准（相当于约1–2 × 108 个细胞/mL）。若细菌悬液浊度过低或过高，可适当添加E. coli菌落或MH肉汤进行调节。制备好的接种物应在15分钟内使用。
  2. 接种测试琼脂平板
    1. 将无菌棉签浸入已调整浊度的细菌悬液中，多次旋转棉签，并在试管内壁用力挤压，以去除棉签上多余的液体。
    2. 用棉签在整个MH琼脂平板表面均匀涂布3次，每次涂布后将平板旋转60°。同时涂布琼脂平板边缘，以确保接种物均匀分布。
    3. 将培养皿盖部分打开，静置3–5分钟，使表面水分蒸发。
  3. 将抗菌药物纸片贴于已接种的琼脂平板上
    1. 将每个抗菌药物纸片（见材料表）均匀放置并轻压于已接种琼脂平板表面，确保纸片与琼脂完全接触。在贴好纸片后15分钟内将平板倒置，于35 ± 2 °C培养16–18小时。
      注：直径为150 mm和100 mm的培养皿中，最多分别使用12个和6个纸片。
  4. 培养结束后，使用游标卡尺测量抑菌圈直径，并根据CLSI折点标准（M100 - 表2A）32对结果进行判读。

3. 基因组DNA（gDNA）提取与定量

  1. 基因组 DNA 提取
    1. 将一环 freshly cultured 的 E. coli 菌落重悬于 5 mL LB 肉汤中，在 37 ± 2 °C 条件下于摇床培养箱（180 rpm）中过夜培养。
    2. 将细菌悬液在 3,500 x g 条件下离心 5 分钟，并小心弃去上清液。
    3. 按照 DNA 提取试剂盒的说明书进行基因组 DNA（gDNA）提取（参见 材料表）。
    4. 使用紫外-可见分光光度计测定 260/280 nm 处的光密度（比值：>1.8）和 260/230 nm 处的光密度（比值：2.0–2.2），以检测 gDNA 的纯度。通过 0.8% 琼脂糖凝胶电泳验证 gDNA 的完整性。
  2. 基因组 DNA 定量
    注意：仅使用经荧光测定试剂盒制造商批准的薄壁透明 0.5 mL PCR 管（参见 材料表）。
    1. 为样品和检测标准品设置所需数量的试管。根据制造商说明书，将试剂盒提供的组分 A 和组分 B 混合，配制工作液。
    2. 向相应试管中加入 190 µL 工作液和 10 µL 各标准品，配制检测标准品（需两种标准品）。
    3. 向相应试管中加入 198 µL 工作液和 2 µL DNA 样品。将所有试管涡旋振荡 5 秒以充分混匀，注意避免产生气泡。
    4. 将所有试管在室温下避光孵育 2 分钟。根据制造商说明书，使用荧光计测定各试管的荧光值（参见 材料表）。
    5. 根据测序要求，适当调整 gDNA 样品的浓度。

4. DNA文库制备

注意：DNA文库制备和测序均按照制造商的指南和方案进行（参见材料表）。起始基因组DNA浓度为4.0 ng。

  1. 片段化、PCR 扩增和加接头
    1. 在 0.2 mL 离心管中加入 2.5 µL 片段化缓冲液和 2 µL 基因组 DNA（gDNA）模板（2.0 ng/µL），用移液器轻轻混匀。
    2. 加入 1 µL 扩增缓冲液，用移液器轻轻混匀。在室温下以 280 × g 离心 1 分钟。
    3. 将样品放入热循环仪（见材料表）中，运行以下 PCR 程序：55 °C 反应 5 分钟，然后保持在 10 °C。当样品温度降至 10 °C 时，立即进行下一步以中和反应。
    4. 向样品管中加入 1 µL 中和缓冲液，用移液器轻轻混匀。在室温下以 280 × g 离心 1 分钟，室温孵育 5 分钟。
    5. 向样品中加入每种接头引物（即 i7 和 i5 接头）各 1.7 µL，以及 3 µL 接头PCR主混合液。用移液器轻轻混匀。在室温下以 280 × g 离心 1 分钟。
    6. 将样品放入热循环仪中，进行第二轮 PCR 反应，程序如下：72 °C 3 分钟，95 °C 30 秒，进行 18 个循环（95 °C 10 秒，55 °C 30 秒，72 °C 30 秒），72 °C 延伸 5 分钟，最后保持在 10 °C。
  2. 扩增文库纯化
    1. 根据生产商说明书，通过涡旋振荡充分混匀商用磁珠溶液（见材料表）。
    2. 将片段化并加接头的 gDNA 样品转移至新的 1.5 mL 离心管中，每 µL gDNA 样品终体积（约 13 µL）加入 0.6 µL 磁珠。用移液器轻轻混匀，室温孵育 5 分钟。
    3. 将样品管置于磁力架上（见材料表）2 分钟，直至上清液澄清。小心移除并弃去上清液，避免扰动磁珠。
    4. 加入 200 µL 新配制的 80% 乙醇，不混匀。孵育 30 秒，待液体澄清后，小心移除并弃去上清液，避免扰动磁珠。
    5. 进行第二次洗涤：向磁珠中加入 200 µL 80% 乙醇，孵育 30 秒。待液体澄清后，移除并弃去上清液，将磁珠在空气中干燥 10 分钟。
    6. 向磁珠中加入 15 µL 10 mM Tris 缓冲液（pH 8），用移液器轻轻混匀。室温孵育 2 分钟。再次将样品管置于磁力架上 2 分钟，使上清液澄清。
    7. 小心将 14 µL 上清液转移至新的 0.2 mL 离心管中。此即纯化后的文库。
      注：此时纯化后的文库可在 -20 °C 保存最多 7 天。
  3. 文库标准化
    1. 采用荧光定量法对纯化后的文库进行定量（步骤见 3.2，但省略 3.2.5 步骤）。
    2. 将纯化后的文库在 1% 琼脂糖凝胶上进行电泳，以确定片段平均大小。
    3. 使用以下公式计算文库的摩尔浓度：
      DNA 浓度转摩尔浓度公式；核酸定量转换方程
    4. 根据计算所得的摩尔浓度，计算所需洗脱缓冲液（RSB）和纯化文库的体积，将各文库稀释至起始浓度为 10 nM。

5. 文库合并、变性逆转与测序仪启动

  1. 按照制造商的说明解冻试剂盒。将流动池从冰箱（4 °C）中取出，并在测序前恢复至室温。
  2. 将每种标准化文库（10 nM）各取 5 µL，加入低吸附的 1.5 mL 离心管中进行混合。用适量 RSB 将混合文库稀释至 4 nM。
  3. 在新的低吸附 1.5 mL 离心管中加入 5 µL 混合文库（4 nM）和 5 µL 0.2 N NaOH。短暂涡旋混匀，280 x g 离心 1 分钟，室温孵育 5 分钟，使混合文库变性为单链。
  4. 用移液器轻轻混合 10 µL 变性后的混合文库与 990 µL 预冷的杂交缓冲液，并置于冰上，直至进行上机测序前的最终稀释。变性后混合文库的浓度为 20 pM。
  5. 解冻并配制对照文库（见材料表），通过混合 2 µL 对照文库（10 nM）和 3 µL 无核酸酶水，将其浓度调整为 4 nM。
  6. 在 5 µL 对照文库（4 nM）中加入 5 µL 新鲜配制的 0.2 N NaOH。短暂涡旋混匀，280 x g 离心 1 分钟，室温孵育 5 分钟，使对照文库变性为单链。
  7. 用移液器轻轻混合 10 µL 变性后的对照文库与 990 µL 预冷的杂交缓冲液，并置于冰上，直至完成上机测序前的最终稀释。变性后对照文库的浓度为 20 pM。
  8. 在新的低吸附 1.5 mL 离心管中，加入 594 µL 变性后浓度为 20 pM 的混合文库和 6 µL 变性后浓度为 20 pM 的对照文库，充分混匀。
  9. 使用预冷的杂交缓冲液将最终文库混合物（20 pM）稀释至 600 µL，上机浓度为 1.2 pM。
  10. 在将最终文库混合物加载到试剂盒之前，进行额外的热预处理以实现流动池中的高效加载。将最终文库混合物在 96 °C 孵育 2 分钟，翻转混匀后立即置于冰上 5 分钟。
  11. 将 500 µL 最终文库混合物加入试剂盒指定的储液槽中。按照操作指南启动测序流程，安装流动池和试剂盒，并设置测序运行。

6. 序列数据分析

注意：检查 补充文件 1 有关全基因组测序数据预处理、软件、参数设置及序列分析的进一步描述 E. coli 基因组

  1. 连接测序数据服务器并下载 FASTQ 文件。
  2. 使用第三方软件评估原始序列数据的初始质量。从原始测序数据中去除残留的接头序列、低质量碱基（补充文件 1）。
  3. 使用第三方软件将经过质量控制的测序数据组装至重叠群（contig）或支架（scaffold）水平（参见 补充文件 1）。
  4. 通过将包含组装后基因组的 FASTA 文件提交至 RAST 服务器（https://rast.nmpdr.org/），进行基因组注释。
  5. 将 FASTA 文件上传至基因组流行病学中心（CGE）（http://www.genomicepidemiology.org/services/）和 ClermonTyping（http://clermontyping.iame-research.center/index.php）网络平台，以鉴定流行病学特征、抗生素抗性基因（ARGs）、毒力相关基因（VAGs）和质粒（参见 补充文件 1）。
  6. 将 FASTA 文件上传至 PHASTER 服务器以鉴定前噬菌体序列（https://phaster.ca/）。

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结果

采用纸片扩散法测定抗菌药物敏感性，并根据CLSI折点标准对涵盖六类不同抗菌药物（即氨基糖苷类、β-内酰胺类、氟喹诺酮类、硝基呋喃类、苯酚类和叶酸途径拮抗剂）的12种抗生素进行判读。E. coli ACM5对所有测试抗生素均敏感，仅对一种β-内酰胺类药物例外。共测试了四种β-内酰胺类药物：氨苄西林、羧苄西林、头孢噻吩和头孢三嗪。其中，氨苄西林的抑菌圈直径为14 mm。因此，根据CLSI对氨苄西林的判读标准（敏感：≥17 mm；中介：14–16 mm；耐药：≤13 mm）32，E. coli ACM5对氨苄西林表现为中介敏感。

E. coli ACM5 采用台式测序仪进行全基因组测序（WGS）。因此，按照所述方案对DNA样本进行制备、多重化并测序。总体而言，采用中等输出配置的测序运行产生了 3.37 Gb 的数据，错误率为 0.73%，其中 89.71% 的碱基质量值超过 Q3033。 specifically，对 E. coli...

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讨论

本研究介绍了一种使用台式测序仪对致病性E. coli变异株进行细菌全基因组测序（WGS）的实验流程改进方案，以及相应的基因组表征分析流程。根据所使用的测序平台不同，湿实验操作（细菌培养、基因组DNA提取、文库制备和测序）和序列分析的周转时间（TAT）可能会有所差异，特别是在研究生长缓慢的细菌时。按照上述WGS方案操作，周转时间在4天以内，与目前文献报道的结果（<5天）相当34。

基因组测序的理论测序深度 E. coli ACM5 的测序深度计算为 30x。然而，测序实际产生的基因组组装实证数据深度为 38x。如先前所建议35，这足以获得完整的基因组代表性，并进行后续数据分析，以研究其抗菌素耐药性、毒力因子和可移动基因组特征 E. coli ACM5. 针对抗菌药物耐药性，仅对获得性耐药决定因素进行了研究。 E. coli ACM5 是一种耐氨苄青霉素的分离株，但仅检测到编码 MdfA 多药外排泵的基因。然而，该...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢墨西哥国家科学技术委员会（西班牙语缩写为 CONACyT）向 José Antonio Magaña-Lizárraga [编号：481143] 提供的博士奖学金。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Accublock Mini 数字干浴器LabnetD0100用于试管孵育的干浴器
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881用于DNA文库纯化的磁珠溶液
DeNovix DS-11DeNovix Inc.紫外-可见分光光度计，用于检测提取的基因组DNA质量
DNA LoBind 管Eppendorf0030108418用于DNA文库合并的1.5 mL PCR管
DynaMag-2 磁力架Invitrogen, Thermo Fisher Scientific12321D基于磁珠的DNA纯化过程中使用的磁性微量离心管架
革兰氏阴性菌 Multibac I.D.Diagnostic Research（墨西哥）PT-35用于抗菌药物敏感性试验的商用标准抗生素纸片
MiniSeq 中通量试剂盒（300个循环）IlluminaFC-420-1004用于双端测序（2×150）的试剂盒
MiniSeq 测序系统仪器IlluminaSY-420-1001用于下一代测序的台式测序仪
MiniSpin 离心机Eppendorf5452000816用于试管的常规离心机
Nextera XT DNA文库制备试剂盒IlluminaFC-131-1024用于构建测序用DNA文库的试剂，包含用于24个样本的试剂盒1和试剂盒2
Nextera XT Index Kit v2IlluminaFC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004Index A、B、C、D 四组索引
PhiX Control v3IlluminaFC-110-3001用于测序的DNA文库对照
Precision 水浴摇床LabCare America51221081用于细菌培养的水浴摇床
Qubit 1X dsDNA HS 检测试剂盒Invitrogen, Thermo Fisher ScientificQ33231基于荧光的DNA定量检测试剂
Qubit 2.0 荧光计Invitrogen, Thermo Fisher ScientificQ32866用于荧光检测的荧光计 
Qubit 检测管Invitrogen, Thermo Fisher ScientificQ32856用于基于荧光的DNA定量检测的0.5 mL PCR管 
SimpliAmp 热循环仪Applied Biosystems, Thermo Fisher ScientificA24811用于DNA文库扩增的热循环仪
Spectronic GENESYS 10 VisThermo335900用于抗菌药物敏感性试验中细菌悬液的分光光度计
ZymoBIOMICS DNA Miniprep 试剂盒Zymo Research Inc.D4300基因组DNA提取试剂盒（50次制备）

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Formal Correction: Erratum: Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing
Posted by JoVE Editors on 2/02/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing. The Authors section was updated from:

José Antonio Magaña-Lizárraga1,
Bruno Gómez-Gil2,
Julissa Enciso-Ibarra2,
María Elena Báez-Flores1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, Ciudad Universitaria
2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

to:

José Antonio Magaña-Lizárraga1,
Bruno Gómez-Gil2,
Julissa Enciso-Ibarra2,
María Elena Báez-Flores1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa
2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

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