本文介绍了一种用于啮齿类动物的眼部显微解剖方案。该过程包括摘除眼球及其瞬膜（即第三眼睑），随后分离眼球的后部和前部眼杯。
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本文内容
摘要
摘要
啮齿类动物眼球的显微解剖包括对带有瞬膜（即第三眼睑）的摘除眼球进行分割，以获得前部和后部的眼杯。利用该技术，可获取眼球的各个子结构，包括角膜组织、神经组织、视网膜色素上皮（RPE）组织以及晶状体，用于全层铺片、冷冻切片和/或特定眼组织的单细胞悬液制备。第三眼睑的存在具有独特且重要的优势，因其有助于维持眼球的方向定位，这对于理解局部干预后的眼部生理状态，或涉及眼球空间拓扑结构分析的研究至关重要。
本方法中，我们通过仔细缓慢地切断眼外肌并离断视神经，将眼球连同第三眼睑一起从眼窝中去核取出。使用显微刀片经角膜缘刺穿眼球。 该切口作为进入点，将显微剪刀插入切口，沿角膜-巩膜交界处进行剪切。沿眼球周向进行小而连续的剪切，直至杯状结构分离。随后可使用Colibri缝合镊轻轻剥离透明的神经视网膜层，以分离出神经视网膜层和视网膜色素上皮（RPE）层。进一步地，从周边部向视神经中心垂直方向作三至四个等距切口，直至到达视神经。此操作将半球形的杯状结构展开为花状，使其平铺，便于后续封片。本技术已在我实验室用于角膜全层铺片及视网膜切片研究。第三眼睑的存在可明确标示鼻侧-颞侧方向，从而便于在移植后研究各种细胞治疗干预的效果，并实现此类研究中可视化与准确表征所必需的靶向生理学验证。
引言
眼部解剖是眼科研究中一项重要的技术，使研究人员能够获取眼球的各个部分以进行靶向研究。过去，眼科研究人员依赖于来自患病个体的眼部组织进行研究。然而，随着近年来眼科啮齿类动物模型品系数量的不断增加1，对人眼组织的需求已显著减少。这些小鼠品系促进了人们对眼部疾病及其干预措施的深入理解。但同时，也催生了对创新性眼部显微解剖技术的需求。由于眼部结构微小且操作空间有限，难以有效获取眼球的各个亚结构。此外，由于前部和后部眼杯具有高度均一的细胞组成，解剖后难以实施靶向干预。目前的显微解剖技术，如激光显微切割2和手术显微解剖3,4，均难以满足此类眼科研究需求。激光显微切割在单细胞分析中非常有效，但在激光操作之前需要先对特定组织进行显微解剖2。该技术可从预先解剖的组织中分离出小范围的目标区域用于分子分析。因此，该技术不适用于制备整体装片，也不适用于分离轴向紧密排列的眼部层次结构以实现最佳观察效果。
手术方法是最广泛使用的技术，该方法包括固定眼球 通过 视神经5 然后进行解剖。这种操作十分困难，且可能损伤任何脆弱的组织，因为在解剖过程中球形的眼球会持续移动。尽管该技术有助于分离视网膜各层结构，但在解剖后无法标示组织的空间方位。
在解剖过程中，保留瞬膜或第三眼睑的存在（图1）具有独特且重要的优势。本方法中，首先将眼球连同第三眼睑一同摘除。随后利用第三眼睑固定眼球6（图2A）。接着从角膜缘处刺穿眼球，并以该切口作为进入点（图2B、C）。然后沿眼球前部和后部的周缘剪开，将眼杯分离（图2D–G）。进一步解剖后部眼杯，可辨识出神经视网膜的半透明层，并轻柔地将其剥离。随后，在获得的半球形前部和后部眼杯上做三到四个等距切口，使这些花形眼杯能够平整地贴附于载玻片上（图2H）。
第三眼睑有助于在解剖过程中方便而高效地操作，从而在接触各种眼层结构以及制备全层铺片时最大限度地减少对组织的损伤。此外，在观察过程中，第三眼睑的存在有助于定位和检查局部干预区域。
在本实验室中，该操作已在 P28 期的 CBA/J 或 rd1 小鼠品系上进行，小鼠性别不限。该操作可应用于任何品系、年龄和性别的动物，且在这些特征上无任何偏向性。
动物从商业渠道获得（见 材料表）并饲养于国家免疫学研究所（NII）的小型动物设施（SAF）中。动物置于独立通气笼具（IVC）中饲养，并给予 随意摄取 可自由获取酸化高压灭菌水和食物。饲养环境温度维持在21–23 °C，光照周期为14小时光照/10小时黑暗。
以下是一种改良的小鼠眼球显微解剖手术方法。
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方案
本实验方案已获新德里国家免疫学研究所机构动物伦理委员会批准，批准文号为 IAEC#480/18。实验严格遵循印度渔业、畜牧与乳业部下属实验动物监管与控制委员会的法规指南，在国家免疫学研究所 SAF 设施专业兽医的监督下进行。
1. 准备
- 使用0.8%托吡卡胺和5%去氧肾上腺素眼用溶液，每眼各一滴，以扩张啮齿类动物的瞳孔。操作前将动物置于暗处30分钟。
注意：由于动物在完成30分钟后立即被实施安乐死，因此无需使用镇痛剂。暗适应及瞳孔扩张可使观察者在操作前检查眼球是否存在撕裂或损伤。此外，在处理有色素的眼球组织时，瞳孔扩张具有优势。 - 通过腹腔注射5倍剂量的麻醉剂实施安乐死。典型剂量为200 µL PBS，其中含有10 mg氯胺酮和1 mg赛拉嗪。
注意：用于安乐死的剂量为氯胺酮400–500 mg/kg体重，赛拉嗪50 mg/kg体重，均通过腹腔注射给予。对于一只典型体重为20 g的小鼠，剂量应为200 µL PBS，其中含10 mg氯胺酮（100 µL浓度为100 mg/mL的氯胺酮储备液）和1 mg赛拉嗪（100 µL浓度为10 mg/mL的赛拉嗪储备液）。 - 通过检查足底反射确认动物完全无反应。心跳和呼吸的消失也是重要的判断指标。
- 将小鼠置于侧卧位，以便充分接触眼球。
- 准备好Colibri缝合镊、弯镊、微型刀片（15°，3 mm大小）、弹簧微型剪刀和角度弹簧微型剪刀，以备操作使用。
2. 小鼠眼球连同第三眼睑的去核处理
- 将小鼠置于侧卧位，以便完全暴露眼部。用镊子打开外眼睑，以充分观察第三眼睑。
注：第三眼睑，也称为瞬膜，位于鼻侧上角（图1A）。 - 识别第三眼睑为一微小半透明突起，具有色素边界（图1B）。
- 将弯镊环绕眼球，轻捏以分离眼球与周围组织的连接，从而减少周围组织向眼球内出血。
- 将弯镊替换为弹簧式显微剪刀，沿眼球周围剪切，使第三眼睑仍附着于眼球上。采用连续的小幅度剪切动作，逐步分离眼球与周围组织的连接。
- 将弯头弹簧显微剪刀置于眼球下方，剪断视神经以完全游离眼球。确保眼球已完全脱离眼眶。
3. 清除多余组织
- 将安乐死小鼠的去核眼球置于含有 pH 7.4 磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中，加入足量 PBS 使眼球完全浸没。
- 用镊子一只手固定附有第三眼睑的小鼠去核眼球，以保持稳定。
- 将眼球悬浮于液体培养基中，以便更高效地操作。部分眼外肌或组织会开始从眼球漂离，使用弹簧显微剪将其剪除。
- 使用显微剪从眼球基部剪断并移除视神经，以便于进行全层铺片时更好地分离视网膜。
注意：若进行组织切片，则无需移除视神经。 - 用 PBS 清洗眼球，然后转移至含有 1 mL 4% 多聚甲醛（PFA）的 1.5 mL 离心管中，在 4 °C 下固定至少 2 小时。
注意：此步骤可暂停，将组织在 4 °C 下保存于 PFA 中最多 12 小时。然而，若需分离活细胞，则不应进行固定步骤，整个操作过程需连续完成，不得中断。
4. 解剖去核眼球以获取前部和后部眼杯
- 在PFA固定后（若采集活细胞，则无需固定眼球），将眼球转移至含有PBS的培养皿中，并置于解剖显微镜下进行后续操作。
- 用科利布里缝合镊牢固压住瞬膜，以固定眼球。
- 使用显微刀在角巩膜缘处刺入并做一小切口。角巩膜缘即角膜与巩膜的交界处。切口位置宜选择在瞬膜对侧，以便为弹簧显微剪提供进入通道。
注意：使用15°、3 mm大小的显微刀可能更有利于控制切口深度。 - 接下来，以该切口为起点，用一对显微剪沿角巩膜缘周向进行小而连续的剪切。首先，从切口处开始向瞬膜方向完成半圈剪切；然后，在另一侧完成剩余半圈的剪切。最后，在瞬膜周围做一圈剪切，以分离后部眼杯和前部眼杯。
注意：根据所需的眼杯类型，可将瞬膜保留在前部或后部眼杯上。 - 用镊子将晶状体从前部眼杯中取出，从而获得包含神经视网膜和视网膜色素上皮（RPE）层的后部眼杯。至此，晶状体、后部眼杯和前部眼杯已完全分离。
注意：若处理未固定的组织，此时可对前部和后部眼杯进行酶消化，以获得角膜或视网膜的单细胞悬液。 - 如需固定组织，将上述眼杯转移至含有1 mL 4% PFA的1.5 mL离心管中，在4 °C下固定12小时。
注意：固定后，组织可包埋于适当的包埋介质中，进行冷冻切片或石蜡切片，以获得角膜或视网膜切片。
5. 神经视网膜和视网膜色素上皮层的分离
- 将后半杯状组织重新放入含有 PBS 缓冲液的培养皿中，使其完全浸没。
- 检查神经视网膜是否存在。神经视网膜可被观察为附着在色素上皮层（RPE）周边环形边缘的一层不透明结构。
- 用镊子夹住第三眼睑以固定后半杯状组织，并用另一把镊子从周边开始剥离神经视网膜。
注意：建议操作时手部动作极为轻柔且幅度微小，以避免损伤组织。若在视神经出口处神经视网膜仍有附着，可将弯头弹簧剪插入神经视网膜下方，进行剪切以完全分离各层，如图3所示。也可选择使用软毛刷轻轻刷动，使视网膜松脱。但若需保留视网膜用于组织学分析，则不宜采用此方法。
注意：至此已获得神经视网膜、带第三眼睑的色素化 RPE 层。
6. 视网膜及视网膜色素上皮层全眼标本的分层分割
- 将前部和后部眼杯重新放入含有 PBS 缓冲液的培养皿中，并将培养皿置于解剖显微镜下。
- 通过压住第三眼睑固定前部眼杯。
- 使用弯头弹簧显微剪，在靠近第三眼睑处沿垂直于周边向视神经中心的方向，于眼杯直径约 3/4 处进行剪切。
- 保持对第三眼睑的固定，并在第一次剪切的旁边再进行一次剪切。
- 在第二次剪切与第三眼睑之间进行类似的剪切。
注意：通过进行三到四条等距剪切，可将半球形眼杯展开成花朵状，使其平铺，便于后续封片。 - 通过压住第三眼睑固定后部眼杯。
- 参照前部眼杯剪切的相同步骤（步骤 6.3–6.5），在后部眼杯上进行三到四条等距剪切。
注意：对于步骤 5 中分离出的神经视网膜进行组织学分析时，也应进行类似的剪切，以确保其能平整地贴附于载物表面。剪切时不要过深地剪至眼杯中心，以免叶片部分容易断裂或分离。 - 进行染色处理，并将组织整体封片以实现有效观察7,8。
注意：瞬膜的存在在整体封片中可作为眼杯鼻侧的恒定物理标志，有助于区分眼杯的背侧与腹侧，因为眼杯的第三眼睑指示了鼻侧/腹侧的方向。
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结果
为研究疾病状态下眼前段/角膜组织中潜在的淋巴管生成，制备了rd1小鼠眼球/角膜组织的整体封片。来自第三眼睑的附着结膜组织作为阳性对照，因为角膜本身缺乏淋巴管。在该研究中，将角膜组织连同结膜一同解剖，并用4%多聚甲醛固定，随后进行通透化和封闭处理。接着，组织与针对淋巴内皮标志物（LYVE1）的一抗9孵育，再与Alexa Fluor 488（绿色）标记的二抗孵育。使用荧光显微镜在4x和10x放大倍数下采集代表性图像（图4）。
制备眼杯后部神经视网膜的完整组织以观察视网膜血管结构，用于视网膜形态学、结构和功能研究7。将神经视网膜从脉络膜-视网膜色素上皮层小心剥离，并作切口使其呈花瓣状展平。为显示视网膜血管结构，将组织瓣在室温下用Isolectin IB4-Alexa Fluor 488染色1小时，并在2倍和20倍放大倍数下观察（图5）。
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讨论
由于啮齿类动物眼球体积小且呈球形，眼部显微解剖一直被认为是一项困难的操作，因此需要采用创新的技术来高效地处理啮齿类动物眼球8。
在本演示方法中，获取附有瞬膜的小鼠去核眼球，以便于有效且便捷地操作。利用瞬膜可完全固定眼球，从而使解剖过程更加顺利且减少误差。此外，瞬膜的存在有助于明确眼球各部分的方位。因此，在保留瞬膜的情况下对眼球进行解剖，以分离得到前部和后部眼杯。使用切口插入剪刀，可实现均匀且整齐的切割，更便于处理眼球的球形结构。此外，可通过轻轻剥离透明的神经视网膜层，进一步解剖后部眼杯，以获得神经视网膜和视网膜色素上皮（RPE）层，用于组织特异性研究。
此外，在本方案中，从周边向视神经中心垂直进行三至四个等距切割，以到达视神经，从而将半球形的视杯展开成平坦的花状结构，便于固定。
因此，该方法在眼组织特异性切片、单细胞分析以及全组织制备中具有优势。然而，由于需要反复固定组织，导致组织无法用于细胞培养或需要活细胞的实验。本技术已...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
美国加州大学戴维斯分校细胞生物学与人类解剖学系的 Alaknanda Mishra 博士在印度新德里国家免疫学研究所对本方法进行了培训。本研究工作得到了印度政府生物技术部向印度新德里国家免疫学研究所提供的核心资助支持。P.S. 获得了生物技术部授予的研究奖学金。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 对乙酰氨基酚（Biocetamol） | EG Pharmaceuticals | 无特定目录编号（本地采购） | |
| 碱性磷酸酶试剂盒（DEA） | Coral 临床系统，印度 | 无特定目录编号（本地采购） | |
| 自动分析仪 | 印度阿尔托桑特拉克兹郁金香 | Screen Maaster 3000 | 用于肝功能检测的生化分析仪 |
| 聚维酮碘溶液 | Win-Medicare 印度 | 无特定目录编号（本地采购） | |
| 生物安全柜（I级） | Kartos 国际；印度 | 无特定目录编号（本地采购） | |
| 明场显微镜 | 奥林巴斯，日本 | LX51 | |
| CBA/J 近交系小鼠 | 杰克逊实验室 | 品系编号 000654 | |
| 头孢噻肟（Taxim） | AlKem；印度 | 头孢噻肟钠注射液，无特定目录编号（本地采购） | |
| 细胞筛 | Sigma；美国 | CLS431752 | |
| I型胶原酶 | Gibco by Life Technologies | 17100-017 | |
| 棉签 | Pure Swabs Pvt Ltd ；印度 | 无特定目录编号（本地采购） | |
| DPX 封片剂 | Sigma；美国 | 6522 | |
| 铺巾 | JSD Surgicals，德里，印度 | 无特定目录编号（本地采购） | |
| 伊红Y醇溶液 | Sigma；美国 | HT110132 | |
| 镊子 | Major Surgicals；印度 | 无特定目录编号（本地采购） | |
| 气体麻醉系统 | Ugo Basile；意大利 | 211000 | |
| 葡萄糖 | Himedia，印度 | GRM077 | |
| 脱毛膏（Veet） | Reckitt Benckiser，印度 | 无特定目录编号（本地采购） | |
| Mayer's 苏木精溶液 | Sigma；美国 | MHS16 | |
| 肝素钠盐 | Himedia；印度 | RM554 | |
| 来自绵羊睾丸的透明质酸酶 | Sigma；美国 | H6254 | |
| I.V. 导管（Plusflon） | Mediplus，印度 | Ref 1732411420 | |
| 胰岛素注射器 | BD；美国 | REF 303060 | |
| 异氟烷（Forane） | Asecia Queenborough | 无 B506 | 吸入麻醉剂 |
| 氯胺酮（Ketamax） | Troikaa Pharmaceuticals Ltd. | 盐酸氯胺酮 IP，无特定目录号（本地采购） | |
| 美洛昔康（Melonex） | Intas Pharmaceuticals Ltd；印度 | 无特定目录编号（本地采购） | |
| 直型微针持针器 & 弯曲的 | Mercian 英格兰 | BS-13-8 | |
| 直型微持针钳 & 弯曲的 | Mercian 英格兰 | BS-13-8 | |
| 切片机 | Histo-Line Laboratories，意大利 | MRS3500 | |
| 尼龙线 | 印度 | 无特定目录编号（本地采购） | |
| 多聚甲醛 | Himedia；印度 | GRM 3660 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Refresh Tears/眼用凝胶 | Allergan India Private Limited/Sun Pharma，印度 | P3060 | 无特定目录编号 |
| RPMI | Himedia；印度 | 无特定目录编号（本地采购） | |
| 手术刀 | Major Surgicals；印度 | 无特定目录编号（本地采购） | |
| 剪刀 | Major Surgicals；印度 | 无特定目录编号（本地采购） | |
| SGOT（ASAT）试剂盒 | Coral 临床系统，印度 | 无特定目录编号（本地采购） | |
| SGPT（ALAT）试剂盒 | Coral 临床系统，印度 | 无特定目录编号（本地采购） | |
| Shandon Cryotome E 冷冻切片机 | Thermo Electron Corporation；美国 | 无特定目录号 | |
| 蔗糖 | Sigma；美国 | S0389 | |
| 手术刀22号 | 印度 La Medcare | 无特定目录编号（本地采购） | |
| 手术板 | 自制 | 无特定目录编号（本地采购） | |
| 外科用白色胶带 | 3M 印度；印度 | 1530-1 | Micropore 外科手术胶带 |
| 缝线 | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| 注射器（1 ml，26 G） | 迪斯波·范；印度 | 无特定目录编号（本地采购） | |
| 修剪器（剪切器） | Philips | NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005 | |
| 天平 | Braun | 无特定目录编号（本地采购） | |
| William's E 培养基 | Himedia；印度 | AT125 | |
| 赛拉嗪（Xylaxin） | 印度免疫学有限公司 | 镇静剂、麻醉前用药、镇痛剂和肌肉松弛剂 |
参考文献
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