本文介绍了一种用于啮齿类动物的眼部显微解剖方案。该过程包括摘除眼球及其瞬膜（即第三眼睑），随后分离眼球的后部和前部眼杯。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
啮齿类动物眼球的显微解剖包括对带有瞬膜（即第三眼睑）的摘除眼球进行分割，以获得前部和后部的眼杯。利用该技术，可获取眼球的各个子结构，包括角膜组织、神经组织、视网膜色素上皮（RPE）组织以及晶状体，用于全层铺片、冷冻切片和/或特定眼组织的单细胞悬液制备。第三眼睑的存在具有独特且重要的优势，因其有助于维持眼球的方向定位，这对于理解局部干预后的眼部生理状态，或涉及眼球空间拓扑结构分析的研究至关重要。
本方法中，我们通过仔细缓慢地切断眼外肌并离断视神经，将眼球连同第三眼睑一起从眼窝中去核取出。使用显微刀片经角膜缘刺穿眼球。 该切口作为进入点，将显微剪刀插入切口，沿角膜-巩膜交界处进行剪切。沿眼球周向进行小而连续的剪切，直至杯状结构分离。随后可使用Colibri缝合镊轻轻剥离透明的神经视网膜层，以分离出神经视网膜层和视网膜色素上皮（RPE）层。进一步地，从周边部向视神经中心垂直方向作三至四个等距切口，直至到达视神经。此操作将半球形的杯状结构展开为花状，使其平铺，便于后续封片。本技术已在我实验室用于角膜全层铺片及视网膜切片研究。第三眼睑的存在可明确标示鼻侧-颞侧方向，从而便于在移植后研究各种细胞治疗干预的效果，并实现此类研究中可视化与准确表征所必需的靶向生理学验证。
引言
眼部解剖是眼科研究中一项重要的技术，使研究人员能够获取眼球的各个部分以进行靶向研究。过去，眼科研究人员依赖于来自患病个体的眼部组织进行研究。然而，随着近年来眼科啮齿类动物模型品系数量的不断增加1，对人眼组织的需求已显著减少。这些小鼠品系促进了人们对眼部疾病及其干预措施的深入理解。但同时，也催生了对创新性眼部显微解剖技术的需求。由于眼部结构微小且操作空间有限，难以有效获取眼球的各个亚结构。此外，由于前部和后部眼杯具有高度均一的细胞组成，解剖后难以实施靶向干预。目前的显微解剖技术，如激光显微切割2和手术显微解剖3,4，均难以满足此类眼科研究需求。激光显微切割在单细胞分析中非常有效，但在激光操作之前需要先对特定组织进行显微解剖2。该技术可从预先解剖的组织中分离出小范围的目标区域用于分子分析。因此，该技术不适用于制备整体装片，也不适用于分离轴向紧密排列的眼部层次结构以实现最佳观察效果。
手术方法是最广泛使用的技术，该方法包括固定眼球 通过 视神经5 然后进行解剖。这种操作十分困难，且可能损伤任何脆弱的组织，因为在解剖过程中球形的眼球会持续移动。尽管该技术有助于分....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本实验方案已获新德里国家免疫学研究所机构动物伦理委员会批准，批准文号为 IAEC#480/18。实验严格遵循印度渔业、畜牧与乳业部下属实验动物监管与控制委员会的法规指南，在国家免疫学研究所 SAF 设施专业兽医的监督下进行。
1. 准备
- 使用0.8%托吡卡胺和5%去氧肾上腺素眼用溶液，每眼各一滴，以扩张啮齿类动物的瞳孔。操作前将动物置于暗处30分钟。
注意：由于动物在完成30分钟后立即被实施安乐死，因此无需使用镇痛剂。暗适应及瞳孔扩张可使观察者在操作前检查眼球是否存在撕裂或损伤。此外，在处理有色素的眼球组织时，瞳孔扩张具有优势。 - 通过腹腔注射5倍剂量的麻醉剂实施安乐死。典型剂量为200 µL PBS，其中含有10 mg氯胺酮和1 mg赛拉嗪。
注意：用于安乐死的剂量为氯胺酮400–500 mg/kg体重，赛拉嗪50 mg/kg体重，均通过腹腔注射给予。对于一只典型体重为20 g的小鼠，剂量应为200 µL PBS，其中含10 mg氯胺酮（100 µL浓度为100 mg/mL的氯胺酮储备液）和1 mg赛拉嗪（100 µL浓度为10 mg/mL的赛拉嗪储备液）。 - 通过检查足底反射确认动物完全无反应。心跳和呼吸的消失也是重要的判断指标。
- 将小鼠置于侧卧位，以便充分接触眼球。
- 准备好Colibri缝合镊、弯镊、微型刀片（....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
为研究疾病状态下眼前段/角膜组织中潜在的淋巴管生成，制备了rd1小鼠眼球/角膜组织的整体封片。来自第三眼睑的附着结膜组织作为阳性对照，因为角膜本身缺乏淋巴管。在该研究中，将角膜组织连同结膜一同解剖，并用4%多聚甲醛固定，随后进行通透化和封闭处理。接着，组织与针对淋巴内皮标志物（LYVE1）的一抗9孵育，再与Alexa Fluor 488（绿色）标记的二抗孵育。使用荧光显微镜在4x和10x放大倍数下采集代表性图像（图4）。
制备眼杯后部神经视网膜的完整组织以观察视网膜血管结构，用于视网膜形态学、结构和功能研究7。将神经视网膜从脉络膜-视网膜色素上皮层小心剥离，并作切口使其呈花瓣状展平。为显示视网膜血管结构，将组织瓣在室温下用Isolectin IB4-Alexa Fluor 488染色1小时，并在2倍和20倍放大倍数下观察（图5）。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
由于啮齿类动物眼球体积小且呈球形，眼部显微解剖一直被认为是一项困难的操作，因此需要采用创新的技术来高效地处理啮齿类动物眼球8。
在本演示方法中，获取附有瞬膜的小鼠去核眼球，以便于有效且便捷地操作。利用瞬膜可完全固定眼球，从而使解剖过程更加顺利且减少误差。此外，瞬膜的存在有助于明确眼球各部分的方位。因此，在保留瞬膜的情况下对眼球进行解剖，以分离得到前部和后部眼杯。使用切口插入剪刀，可实现均匀且整齐的切割，更便于处理眼球的球形结构。此外，可通过轻轻剥离透明的神经视网膜层，进一步解剖后部眼杯，以获得神经视网膜和视网膜色素上皮（RPE）层，用于组织特异性研究。
此外，在本方案中，从周边向视神经中心垂直进行三至四个等距切割，以到达视神经，从而将半球形的视杯展开成平坦的花状结构，便于固定。
因此，该方法在眼组织特异性切片、单细胞分析以及全组织制备中具有优势。然而，由于需要反复固定组织，导致组织无法用于细胞培养或需要活细胞的实验。本技术已.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
美国加州大学戴维斯分校细胞生物学与人类解剖学系的 Alaknanda Mishra 博士在印度新德里国家免疫学研究所对本方法进行了培训。本研究工作得到了印度政府生物技术部向印度新德里国家免疫学研究所提供的核心资助支持。P.S. 获得了生物技术部授予的研究奖学金。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 对乙酰氨基酚（Biocetamol） | EG Pharmaceuticals | 无特定目录编号（本地采购） | |
| 碱性磷酸酶试剂盒（DEA） | Coral 临床系统，印度 | 无特定目录编号（本地采购） | |
| 自动分析仪 | 印度阿尔托桑特拉克兹郁金香 | Screen Maaster 3000 | 用于肝功能检测的生化分析仪 |
| 聚维酮碘溶液 | Win-Medicare 印度 | 无特定目录编号（本地采购） | |
| 生物安全柜（I级） | Kartos 国际；印度 | 无特定目录编号（本地采购） | |
| 明场显微镜 | 奥林巴斯，日本 | LX51 | |
| CBA/J 近交系小鼠 | 杰克逊实验室 | 品系编号 000654 | |
| 头孢噻肟（Taxim） | AlKem；印度 | 头孢噻肟钠注射液，无特定目录编号（本地采购） | |
| 细胞筛 | Sigma；美国 | CLS431752 | |
| I型胶原酶 | Gibco by Life Technologies | 17100-017 | |
| 棉签 | Pure Swabs Pvt Ltd ；印度 | 无特定目录编号（本地采购） | |
| DPX 封片剂 | Sigma；美国 | 6522 | |
| 铺巾 | JSD Surgicals，德里，印度 | 无特定目录编号（本地采购） | |
| 伊红Y醇溶液 | Sigma；美国 | HT110132 | |
| 镊子 | Major Surgicals；印度 | 无特定目录编号（本地采购） | |
| 气体麻醉系统 | Ugo Basile；意大利 | 211000 | |
| 葡萄糖 | Himedia，印度 | GRM077 | |
| 脱毛膏（Veet） | Reckitt Benckiser，印度 | 无特定目录编号（本地采购） | |
| Mayer's 苏木精溶液 | Sigma；美国 | MHS16 | |
| 肝素钠盐 | Himedia；印度 | RM554 | |
| 来自绵羊睾丸的透明质酸酶 | Sigma；美国 | H6254 | |
| I.V. 导管（Plusflon） | Mediplus，印度 | Ref 1732411420 | |
| 胰岛素注射器 | BD；美国 | REF 303060 | |
| 异氟烷（Forane） | Asecia Queenborough | 无 B506 | 吸入麻醉剂 |
| 氯胺酮（Ketamax） | Troikaa Pharmaceuticals Ltd. | 盐酸氯胺酮 IP，无特定目录号（本地采购） | |
| 美洛昔康（Melonex） | Intas Pharmaceuticals Ltd；印度 | 无特定目录编号（本地采购） | |
| 直型微针持针器 & 弯曲的 | Mercian 英格兰 | BS-13-8 | |
| 直型微持针钳 & 弯曲的 | Mercian 英格兰 | BS-13-8 | |
| 切片机 | Histo-Line Laboratories，意大利 | MRS3500 | |
| 尼龙线 | 印度 | 无特定目录编号（本地采购） | |
| 多聚甲醛 | Himedia；印度 | GRM 3660 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Refresh Tears/眼用凝胶 | Allergan India Private Limited/Sun Pharma，印度 | P3060 | 无特定目录编号 |
| RPMI | Himedia；印度 | 无特定目录编号（本地采购） | |
| 手术刀 | Major Surgicals；印度 | 无特定目录编号（本地采购） | |
| 剪刀 | Major Surgicals；印度 | 无特定目录编号（本地采购） | |
| SGOT（ASAT）试剂盒 | Coral 临床系统，印度 | 无特定目录编号（本地采购） | |
| SGPT（ALAT）试剂盒 | Coral 临床系统，印度 | 无特定目录编号（本地采购） | |
| Shandon Cryotome E 冷冻切片机 | Thermo Electron Corporation；美国 | 无特定目录号 | |
| 蔗糖 | Sigma；美国 | S0389 | |
| 手术刀22号 | 印度 La Medcare | 无特定目录编号（本地采购） | |
| 手术板 | 自制 | 无特定目录编号（本地采购） | |
| 外科用白色胶带 | 3M 印度；印度 | 1530-1 | Micropore 外科手术胶带 |
| 缝线 | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| 注射器（1 ml，26 G） | 迪斯波·范；印度 | 无特定目录编号（本地采购） | |
| 修剪器（剪切器） | Philips | NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005 | |
| 天平 | Braun | 无特定目录编号（本地采购） | |
| William's E 培养基 | Himedia；印度 | AT125 | |
| 赛拉嗪（Xylaxin） | 印度免疫学有限公司 | 镇静剂、麻醉前用药、镇痛剂和肌肉松弛剂 |
参考文献
- Choi, Y., et al. Studying cancer immunotherapy using patient-derived xenografts (PDXs) in humanized mice. Experimental and Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).
- Sutherland, C., et al.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
