研究和理解帕金森病的发病机制需要一种α-突触核蛋白的体内生理模型。我们描述了一种利用人源化酵母模型监测α-突触核蛋白细胞毒性及聚集体形成的方法。
研究和理解帕金森病的发病机制需要一种α-突触核蛋白的体内生理模型。我们描述了一种利用人源化酵母模型监测α-突触核蛋白细胞毒性及聚集体形成的方法。
帕金森病是第二常见的神经退行性疾病，其特征是由于错误折叠和聚集的α-突触核蛋白形成路易小体，导致进行性细胞死亡。α-突触核蛋白是一种丰富的突触前蛋白，可调节突触囊泡的转运，但其蛋白聚集物的积累会引起神经毒性。近期研究表明，多种遗传因素（包括细菌分子伴侣）可能减少α-突触核蛋白聚集体的形成 帕金森病，α-突触核蛋白，路易小体，神经退行性疾病，蛋白聚集，细菌分子伴侣，突触囊泡转运，神经毒性 体外然而，要将此方法作为患者的潜在治疗手段，还需在细胞中监测其抗聚集效果。理想情况下应使用神经元细胞，但这类细胞难以操作，且表现出抗聚集表型所需时间较长。因此，需要一种快速而有效的方法 体内 需要工具进行进一步评估 体内 抗聚集活性。本文所述方法用于监测和分析人源化酵母中的抗聚集表型 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），该细胞表达人源α-突触核蛋白。本实验方案演示了 体内 可用于监测α-synuclein诱导的细胞毒性以及细胞内α-synuclein聚集体形成的工具。
帕金森病（PD）是全球老龄化社会面临的一个严重问题。α-突触核蛋白的聚集与帕金森病密切相关，其蛋白聚集体被广泛用作诊断该疾病的分子生物标志物1。α-突触核蛋白是一种小型酸性蛋白（由140个氨基酸组成），包含三个结构域：N端脂质结合α-螺旋、淀粉样结合中央结构域（NAC）以及C端酸性尾部2。α-突触核蛋白可自发发生错误折叠，最终形成称为路易小体的淀粉样聚集体3。α-突触核蛋白可能通过多种机制参与帕金森病的发病过程。通常认为，其异常的可溶性寡聚体形式（称为原纤维）具有毒性，可通过影响包括突触功能在内的多种细胞靶点，导致神经元细胞死亡3。
用于研究神经退行性疾病的生物模型必须在基因组和细胞生物学方面与人类具有相关性。最佳的模型应为人类神经元细胞系。然而，这些细胞系存在多种技术难题，例如培养难以维持、转染效率低以及成本高昂4。由于这些原因，迫切需要一种简便且可靠的工具来加速该研究领域的进展。重要的是，该工具应便于分析所收集的数据。基于这些考虑，多种模式生物已被广泛使用，包括Drosophila、Caenorhabditis elegans、Danio rerio....
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1. 培养基与溶液的配制
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已知α-突触核蛋白的高表达与帕金森病（PD）模型系统中的神经元细胞死亡和PD相关。本研究描述了三种在酵母中监测α-突触核蛋白细胞毒性及其聚集灶形成的方法。在此，我们在酵母中过表达了α-突触核蛋白，并检测了野生型α-突触核蛋白以及三种已知为家族性PD突变体的α-突触核蛋白变体的表型（图1 和材料表）。
在含有半乳糖作为诱导剂的琼脂平板上，pRS426 载体中 GAL1 启动子驱动的 α-突触核蛋白表达显示出显著的生长迟滞（图 2）。在液体培养中也观察到 α-突触核蛋白表达引起的生长差异（图 3）。在这两种培养条件下，野生型 α-突触核蛋白以及携带 E46K 或 A53T 突变的变体均表现出因 α-突触核蛋白毒性导致的生长缺陷。然而，不能形成聚集体的 α-突触核蛋白 A30P 变体则表现出非毒性表型。
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鉴于人类体内各种细胞系统的复杂性，利用酵母作为研究人类神经退行性疾病的模型具有显著优势。尽管使用酵母几乎无法研究人类大脑中复杂的细胞间相互作用，但从单细胞角度来看，酵母细胞在基因组序列同源性以及基本的真核细胞生命过程方面与人类细胞具有高度相似性。8,13此外，由于酵母易于进行遗传操作，可促进对复杂且高要求的人类系统的深入研究。因此，酵母已被广泛用作模式系统，以揭示真核细胞的生命活动过程以及多种疾病的发病机制。14,15,16特别是在两者之间存在差异 计算机模拟, 体外，以及 体内 α-突触核蛋白等淀粉样蛋白的聚集特性17考虑到蛋白质在细胞内行为的复杂性和不可预测性，研究蛋白质特性非常重要 体内因此，为了理解细胞中α-s.......
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作者声明无利益冲突。
我们感谢 James Bardwell 和 Tiago F. Outeiro 慷慨分享含有 α-突触核蛋白的质粒。Changhan Lee 获得了韩国国家研究基金会（NRF）由韩国政府（MSIT）资助的项目（资助号 2021R1C1C1011690）、韩国教育部资助的 NRF 基础科学研究计划（资助号 2021R1A6A1A10044950）以及 ajou 大学新进教师研究基金的资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 96 孔板 | SPL | 30096 | |
| 琼脂糖 | TAESHIN | 0158 | |
| 细菌琼脂 | BD Difco | 214010 | |
| Breathe-easy | diversified biotech | BEM-1 | 微孔板透气密封膜 |
| 盖玻片 | Marienfeld | 24 × 60 mm | |
| 培养管 | SPL | 40014 | |
| 比色皿 | ratiolab | 2712120 | |
| D-(+)-半乳糖 | sigma | G0625 | |
| D-(+)-葡萄糖 | sigma | G8270 | |
| D-(+)-棉子糖五水合物 | Daejung | 6638-4105 | |
| 摇床培养箱 | Labtron | 型号：SHI1 | |
| 静止培养箱 | Vision scientific | 型号：VS-1203PV-O | |
| LiAc | sigma | L6883 | |
| 酶标仪 | Tecan | 30050303 01 | 型号：Infinite 200 pro |
| 多通道移液器 20-200 µL | gilson | FA10011 | |
| 多通道移液器 2-20 µL | gilson | FA10009 | |
| Olympus 显微镜 | Olympus | IX-53 | |
| PEG | sigma | P4338 | 平均分子量 3,350 |
| 培养皿 | SPL | 10090 | |
| pRS426 | Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. & Hieter, P. 多功能酵母高拷贝穿梭质粒. Gene. 110 (1), 119-122 (1992)。 | ||
| pRS426 GAL1 启动子 α-突触核蛋白 A30P | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. 酵母细胞为α-突触核蛋白的生物学与病理生物学提供见解. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 启动子 α-突触核蛋白 A53T | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. 酵母细胞为α-突触核蛋白的生物学与病理生物学提供见解. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 启动子 α-突触核蛋白 E46K | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. 酵母细胞为α-突触核蛋白的生物学与病理生物学提供见解. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 启动子 α-突触核蛋白 WT | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. 酵母细胞为α-突触核蛋白的生物学与病理生物学提供见解. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| 试剂槽 | SPL | 23050 | |
| 分光光度计 | eppendorf | 6131 05560 | |
| W303a | 由 James Bardwell 提供 | ||
| 不含氨基酸的酵母氮源基础培养基 | Difco | 291940 | |
| 不含尿嘧啶的酵母合成培养基补充剂 | sigma | Y1501 | |
| YPD | Condalab | 1547.00 |
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