研究和理解帕金森病的发病机制需要一种α-突触核蛋白的体内生理模型。我们描述了一种利用人源化酵母模型监测α-突触核蛋白细胞毒性及聚集体形成的方法。
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摘要
摘要
帕金森病是第二常见的神经退行性疾病，其特征是由于错误折叠和聚集的α-突触核蛋白形成路易小体，导致进行性细胞死亡。α-突触核蛋白是一种丰富的突触前蛋白，可调节突触囊泡的转运，但其蛋白聚集物的积累会引起神经毒性。近期研究表明，多种遗传因素（包括细菌分子伴侣）可能减少α-突触核蛋白聚集体的形成 帕金森病，α-突触核蛋白，路易小体，神经退行性疾病，蛋白聚集，细菌分子伴侣，突触囊泡转运，神经毒性 体外然而，要将此方法作为患者的潜在治疗手段，还需在细胞中监测其抗聚集效果。理想情况下应使用神经元细胞，但这类细胞难以操作，且表现出抗聚集表型所需时间较长。因此，需要一种快速而有效的方法 体内 需要工具进行进一步评估 体内 抗聚集活性。本文所述方法用于监测和分析人源化酵母中的抗聚集表型 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），该细胞表达人源α-突触核蛋白。本实验方案演示了 体内 可用于监测α-synuclein诱导的细胞毒性以及细胞内α-synuclein聚集体形成的工具。
引言
帕金森病（PD）是全球老龄化社会面临的一个严重问题。α-突触核蛋白的聚集与帕金森病密切相关，其蛋白聚集体被广泛用作诊断该疾病的分子生物标志物1。α-突触核蛋白是一种小型酸性蛋白（由140个氨基酸组成），包含三个结构域：N端脂质结合α-螺旋、淀粉样结合中央结构域（NAC）以及C端酸性尾部2。α-突触核蛋白可自发发生错误折叠，最终形成称为路易小体的淀粉样聚集体3。α-突触核蛋白可能通过多种机制参与帕金森病的发病过程。通常认为，其异常的可溶性寡聚体形式（称为原纤维）具有毒性，可通过影响包括突触功能在内的多种细胞靶点，导致神经元细胞死亡3。
用于研究神经退行性疾病的生物模型必须在基因组和细胞生物学方面与人类具有相关性。最佳的模型应为人类神经元细胞系。然而，这些细胞系存在多种技术难题，例如培养难以维持、转染效率低以及成本高昂4。由于这些原因，迫切需要一种简便且可靠的工具来加速该研究领域的进展。重要的是，该工具应便于分析所收集的数据。基于这些考虑，多种模式生物已被广泛使用，包括Drosophila、Caenorhabditis elegans、Danio rerio、酵母和啮齿类动物5。其中，酵母是最佳的模式生物，因为其遗传操作简便，且成本低于其他模式生物。最重要的是，酵母与人类细胞具有高度相似性，例如与人类直系同源基因的序列同源性达60%，与人类疾病相关基因有25%具有密切同源性6，并且它们共享基本的真核细胞生物学特征。酵母中含有许多与人类细胞中序列相似且功能类似的功能蛋白7。事实上，表达人类基因的酵母已被广泛用作研究细胞过程的模型系统8。这种酵母菌株被称为“人源化酵母”，是探索人类基因功能的有力工具9。由于酵母中的遗传操作技术成熟，人源化酵母在研究基因互作方面具有显著优势。
在本研究中，我们采用酵母Saccharomyces cerevisiae作为模式生物来研究帕金森病（PD）的发病机制，特别是α-突触核蛋白聚集物的形成及其细胞毒性10。为了在出芽酵母中表达α-突触核蛋白，我们使用W303a菌株，并通过携带野生型及家族性PD相关α-突触核蛋白变异体编码序列的质粒进行转化。由于W303a菌株在URA3基因上具有营养缺陷型突变，因此可用于筛选含有携带URA3标记质粒的细胞。质粒中编码的α-突触核蛋白表达受GAL1启动子调控，因而其表达水平可被控制。此外，在α-突触核蛋白的C末端融合绿色荧光蛋白（GFP），可实现对α-突触核蛋白焦点形成的实时监测。为了深入了解家族性PD相关α-突触核蛋白变异体的特性，我们还在酵母中表达了这些变异体，并分析了其对细胞的影响。该系统是一种简便有效的工具，可用于筛选对α-突触核蛋白细胞毒性具有保护作用的化合物或基因。
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方案
1. 培养基与溶液的配制
- 培养基制备
- 制备YPD培养基时，将50 g YPD粉末溶解于dH2O中，定容至1 L，高压灭菌。室温（RT）保存。
- 制备YPD琼脂培养基时，将50 g YPD粉末和20 g琼脂溶解于1 L dH2O中，高压灭菌。冷却后倒入培养皿中，4 ˚C保存。
- 制备含棉子糖的SC（SRd）-Ura培养基时，将6.7 g含硫酸铵且不含氨基酸的酵母氮源基础培养基溶解于795 mL dH2O中，高压灭菌。使用前加入100 mL 20%棉子糖、5 mL 20%葡萄糖和100 mL 10x -Ura缺失培养基补充液。
- 制备SD-Ura琼脂培养基时，将6.7 g含硫酸铵且不含氨基酸的酵母氮源基础培养基和20 g琼脂溶解于800 mL dH2O中，在体积超过2 L的烧瓶中高压灭菌。加入100 mL 20%葡萄糖和100 mL 10x -Ura缺失培养基补充液，充分混匀后倒入培养皿中，4 ˚C保存。
- 制备含半乳糖的SC（SG）-Ura琼脂培养基时，将6.7 g含硫酸铵且不含氨基酸的酵母氮源基础培养基和20 g琼脂溶解于800 mL dH2O中，在体积超过2 L的烧瓶中高压灭菌。加入100 mL 20%半乳糖和100 mL 10x -Ura缺失培养基补充液，充分混匀后倒入培养皿中，4 ˚C保存。
- SD培养基所用储备液
- 制备20%碳源（葡萄糖、半乳糖和棉子糖）溶液时，将100 g葡萄糖、半乳糖或棉子糖溶解于dH2O中，定容至500 mL，高压灭菌后室温保存。
- 制备10倍酵母合成缺失培养基补充液（不含尿嘧啶，即10x-Ura drop-out）时，将19.2 g "酵母合成缺失培养基补充液（不含尿嘧啶）"溶解于dH2O中，定容至1 L，高压灭菌后室温保存。
注意：配制含琼脂的培养基时，需在烧瓶中加入磁力搅拌子，以便在倒入培养皿前充分混匀所有溶液。
2. 酵母转化
注意：使用 pRS426 质粒克隆 α-synuclein 基因，并以 URA3 基因为筛选标记。α-突触核蛋白存在与家族性帕金森病相关的突变体，可导致严重的疾病表型（例如细胞毒性）。本实验也使用了这些突变体，以检测其细胞毒性和聚集灶的形成。为获得一致的实验结果，所有实验应使用同一批酵母转化子的菌落。
- 进行酵母表达质粒转化时，使用空载体（pRS426）作为对照以及含α-突触核蛋白的质粒。参照标准的醋酸锂（LiAc）方法11，制备六份感受态细胞，并加入每种质粒各0.5 µg，进行转化。
- 为筛选含有 质粒的酵母转化子，使用不含尿嘧啶的合成定义培养基（SD培养基，SD-Ura），将平板在30 ˚C下培养2–3天。
- 将三个单菌落转接到SD-Ura琼脂平板上，用于筛选含有质粒的细胞，以进行后续实验。
注意：为获得准确且可靠的结果，每种菌株至少进行三次生物学重复实验。
3. 斑点实验
注意：已知在酵母中，高拷贝数质粒表达GFP标记的α-突触核蛋白与细胞毒性相关10。
- 每种菌株分别接种三个酵母转化子斑块至3 mL SRd-Ura培养基中，该培养基含有2%棉子糖以抑制α-突触核蛋白在GAL1启动子下的诱导表达，并含有0.1%葡萄糖。将细胞培养物于30 °C、200 rpm振荡条件下培养。
注意：重复使用不同菌落进行所有实验非常重要。若在三个以上独立菌落中获得相同结果，则表明该结果可靠。 - 次日，将过夜培养的细胞以OD600为0.2的浓度接种至3 mL新鲜SRd-Ura培养基中，并于30 °C、200 rpm振荡条件下培养6小时。
- 当OD600达到0.6–0.8时，将细胞稀释后点样至96孔板中进行点板实验，具体步骤如下：
- 测定所有样品的OD600，并用无菌dH2O将各样品稀释至OD600为0.5（混合体积为100 µL），加入96孔板第1列，以使各培养物中的细胞数量一致。
- 通过向后续五列中各加入160 µL无菌dH2O，对酵母细胞进行五倍梯度稀释。每列连续稀释时确保总体积为40 µL。
注意：较低的稀释倍数可能导致样品间差异更明显。进行梯度稀释时需充分吹打以确保混合均匀。每次稀释均应更换移液器吸头，否则附着在吸头表面的细胞可能被带入下一孔，影响细胞数量。
- 使用多通道移液器从每孔中转移10 µL样品，点样于SD-Ura琼脂平板作为对照，以及SG-Ura琼脂平板以监测毒性。
注意：平板应干燥至点样的样品完全被吸收为止。 - 将点样后的平板倒置于30 °C培养4天。
- 每隔24小时拍摄一次平板图像，直至第4天，然后通过肉眼比较各菌株点样后的生长差异进行数据分析。可统计最高稀释度样品中的单菌落数量，计算每种菌株原始培养物中的活细胞数，或比较单个菌落的大小。
使用微孔板读数仪测量酵母生长
- 将每种菌株的三个酵母转化子接种到3 mL SRd-Ura培养基中，30 °C、200 rpm振荡培养过夜。
注意：为了全面了解表达α-突触核蛋白的人源化酵母菌株的各个菌落表型，所有实验应使用相同的转化子。 - 第二天，将过夜培养的细胞接种至96孔板中，总体积为200 µL的新鲜SD-Ura和SG-Ura培养基。调整最终体积（含细胞）至200 µL，并调节初始细胞OD600 至 0.05。
- 调节 项目 微孔板中的设置如下：设置 目标温度 到 30 ˚ C，设置 振荡（线性）时长 到 890 s，设置 线性振幅 到 5 mm，设置 间隔时间 到 00:15:00，并设置 测量 作为 600 nm 处的吸光度.
- 在微孔板读板仪中孵育平板，使所有菌株在2-3天内达到稳定期。
- 通过绘制生长曲线分析数据（例如，使用 Workbook）。取三个生物学重复的吸光度值的平均值作为数据点，并标示误差线。以仅含培养基的吸光度值作为空白对照，从培养细胞的吸光度值中减去该对照值（可选）。
5. 荧光显微镜
- 将酵母转化子接种至3 mL SRd-Ura培养基中，在30 °C、200 rpm振荡条件下过夜培养。
注意：为确定表型与细胞毒性及焦点形成之间的相关性，实验应使用相同的菌落。 - 次日，将过夜培养的细胞重新接种至3 mL新鲜SRd-Ura培养基中，调整初始OD600为0.003。在30 °C、200 rpm振荡条件下培养，直至OD600达到0.2（约18小时）。
- 当OD600达到0.2时，加入300 µL 20%半乳糖，随后继续在30 °C、200 rpm振荡条件下培养6小时。
- 以800 x g离心5分钟收集细胞，弃去上清液。
- 用30 µL蒸馏水轻轻重悬细胞沉淀。
- 取5 μL重悬细胞滴加到载玻片上。制备琼脂糖凝胶垫12，覆盖于样品上，使其均匀展开。
- 使用100倍物镜，结合明场和GFP荧光滤光片进行显微成像。
- 首先使用100倍物镜和浸油在明场下对细胞进行聚焦。通过软件的屏幕截图功能获取图像。
- 切换至GFP荧光滤光片。调节图像的曝光时间至50 ms至300 ms之间，以平衡信噪比获得清晰图像，并使用软件进行屏幕截图。
- 应从多个视野采集大量细胞图像，而非仅限于单一位置。
- 使用分析软件统计含α-突触核蛋白聚集焦点的细胞百分比，对图像进行分析。观察可溶性GFP蛋白信号与形成焦点的GFP信号之间的差异，以及GFP标记的α-突触核蛋白A30P突变体的扩散情况。
注意：α-突触核蛋白的野生型、E46K和A53T突变体会出现焦点形成现象。
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结果
已知α-突触核蛋白的高表达在帕金森病（PD）模型系统中与神经元细胞死亡相关。本研究描述了三种在酵母中监测α-突触核蛋白细胞毒性及聚集性α-突触核蛋白焦点形成的方法。在此，我们在酵母中过表达α-突触核蛋白，并检测了野生型α-突触核蛋白以及三种已知为家族性帕金森病突变体的α-突触核蛋白变体的表型（图1 和材料表）。
在含有半乳糖作为诱导剂的琼脂平板上，pRS426 载体中 GAL1 启动子驱动的 α-突触核蛋白表达显示出显著的生长迟滞（图 2）。在液体培养基中也观察到 α-突触核蛋白表达导致的生长差异（图 3）。在这两种培养条件下，野生型 α-突触核蛋白以及携带 E46K 或 A53T 突变的变体均表现出因 α-突触核蛋白毒性引起的生长缺陷。然而，不能形成聚集体的 α-突触核蛋白 A30P 变体则表现出非毒性表型。
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讨论
鉴于人类体内各种细胞系统的复杂性，利用酵母作为研究人类神经退行性疾病的模型具有显著优势。尽管使用酵母几乎无法研究人类大脑中复杂的细胞间相互作用，但从单细胞角度来看，酵母细胞在基因组序列同源性以及基本的真核细胞生命过程方面与人类细胞具有高度相似性。8,13此外，由于酵母易于进行遗传操作，可促进对复杂且高要求的人类系统的深入研究。因此，酵母已被广泛用作模式系统，以揭示真核细胞的生命活动过程以及多种疾病的发病机制。14,15,16特别是在两者之间存在差异 计算机模拟, 体外，以及 体内 α-突触核蛋白等淀粉样蛋白的聚集特性17考虑到蛋白质在细胞内行为的复杂性和不可预测性，研究蛋白质特性非常重要 体内因此，为了理解细胞中α-s...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢 James Bardwell 和 Tiago F. Outeiro 慷慨分享含有 α-突触核蛋白的质粒。Changhan Lee 获得了韩国国家研究基金会（NRF）由韩国政府（MSIT）资助的项目（资助号 2021R1C1C1011690）、韩国教育部资助的 NRF 基础科学研究计划（资助号 2021R1A6A1A10044950）以及 ajou 大学新进教师研究基金的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 96 孔板 | SPL | 30096 | |
| 琼脂糖 | TAESHIN | 0158 | |
| 细菌琼脂 | BD Difco | 214010 | |
| Breathe-easy | diversified biotech | BEM-1 | 微孔板透气密封膜 |
| 盖玻片 | Marienfeld | 24 × 60 mm | |
| 培养管 | SPL | 40014 | |
| 比色皿 | ratiolab | 2712120 | |
| D-(+)-半乳糖 | sigma | G0625 | |
| D-(+)-葡萄糖 | sigma | G8270 | |
| D-(+)-棉子糖五水合物 | Daejung | 6638-4105 | |
| 摇床培养箱 | Labtron | 型号：SHI1 | |
| 静止培养箱 | Vision scientific | 型号：VS-1203PV-O | |
| LiAc | sigma | L6883 | |
| 酶标仪 | Tecan | 30050303 01 | 型号：Infinite 200 pro |
| 多通道移液器 20-200 µL | gilson | FA10011 | |
| 多通道移液器 2-20 µL | gilson | FA10009 | |
| Olympus 显微镜 | Olympus | IX-53 | |
| PEG | sigma | P4338 | 平均分子量 3,350 |
| 培养皿 | SPL | 10090 | |
| pRS426 | Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. & Hieter, P. 多功能酵母高拷贝穿梭质粒. Gene. 110 (1), 119-122 (1992)。 | ||
| pRS426 GAL1 启动子 α-突触核蛋白 A30P | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. 酵母细胞为α-突触核蛋白的生物学与病理生物学提供见解. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 启动子 α-突触核蛋白 A53T | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. 酵母细胞为α-突触核蛋白的生物学与病理生物学提供见解. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 启动子 α-突触核蛋白 E46K | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. 酵母细胞为α-突触核蛋白的生物学与病理生物学提供见解. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 启动子 α-突触核蛋白 WT | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. 酵母细胞为α-突触核蛋白的生物学与病理生物学提供见解. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| 试剂槽 | SPL | 23050 | |
| 分光光度计 | eppendorf | 6131 05560 | |
| W303a | 由 James Bardwell 提供 | ||
| 不含氨基酸的酵母氮源基础培养基 | Difco | 291940 | |
| 不含尿嘧啶的酵母合成培养基补充剂 | sigma | Y1501 | |
| YPD | Condalab | 1547.00 |
参考文献
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