一种基于人源酵母模型研究α-突触核蛋白毒性和聚集的方法

Summary

需要α-突触核蛋白的 体内 生理模型来研究和了解帕金森病的发病机制。我们描述了一种使用人源化酵母模型监测α-突触核蛋白的细胞毒性和聚集体形成的方法。

Abstract

帕金森病是第二常见的神经退行性疾病，其特征是由含有错误折叠和聚集的α突触核蛋白的路易体的形成引起的进行性细胞死亡。α-突触核蛋白是一种丰富的突触前蛋白，可调节突触囊泡运输，但其蛋白质内含物的积累会导致神经毒性。最近的研究表明，包括细菌伴侣在内的各种遗传因素可以在体外减少α-突触核蛋白聚集体的形成。然而，监测细胞中的抗聚集作用也很重要，以将其作为患者的潜在治疗方法。使用神经元细胞是理想的，但这些细胞难以处理，需要很长时间才能表现出抗聚集表型。因此，需要一种快速有效的体内工具进一步评估体内抗聚集活性。此处描述的方法用于监测和分析表达人α突触核蛋白的人源化酵母酿酒酵母中的抗聚集表型。该协议展示了可用于监测α-突触核蛋白诱导的细胞毒性以及细胞中α-突触核蛋白聚集体形成的体内工具。

Introduction

帕金森病（PD）是全球老龄化社会的一个严重问题。α-突触核蛋白的聚集与PD密切相关，α-突触核蛋白的蛋白质聚集体被广泛用作诊断疾病的分子生物标志物¹。α-突触核蛋白是一种小的酸性蛋白质（长度为 140 个氨基酸），具有三个结构域，即 N 端脂质结合α螺旋、淀粉样蛋白结合中心结构域 （NAC） 和 C 端酸性尾部²。α-突触核蛋白的错误折叠可以自发发生，并最终导致淀粉样蛋白聚集体的形成，称为路易体³。α-突触核蛋白可能以多种方式促进PD的发病机制。一般来说，人们认为其异常的可溶性低聚形式称为原纤维是有毒物种，通过影响各种细胞靶标（包括突^触功能）导致神经元细胞死亡3。

用于研究神经退行性疾病的生物学模型必须在基因组和细胞生物学方面与人类相关。最好的模型是人类神经元细胞系。然而，这些细胞系与一些技术问题有关，例如培养物维护困难，转染效率低^{以及费用高}4。由于这些原因，需要一个简单可靠的工具来加速这一研究领域的进展。重要的是，该工具应该易于用于分析收集的数据。从这些角度来看，各种模式生物已被广泛使用，包括 果蝇、 秀丽隐杆线虫、 Danio rerio、....

Protocol

1. 培养基和溶液的制备

1. 培养基制备
   1. 要制备YPD培养基，将50gYPD粉末溶解在dH₂O中，使最终体积为1L.高压灭菌器。在室温 （RT） 下储存。
   2. 要制作YPD琼脂培养基，将50gYPD粉末和20g琼脂溶解在1L dH₂O.高压灭菌器中。冷却后，倒入培养皿上。储存在4°C。
   3. 要用棉子糖（SRd）-Ura培养基制备SC，将6.7g酵母氮碱与硫酸铵溶解在795mL的dH₂O.高压灭菌器中。使用前加入 100 mL 20% 棉子糖、5 mL 20% 葡萄糖和 100 mL 10x -Ura 脱落剂。
   4. 要制作SD-Ura琼脂培养基，将6.7g酵母氮碱与不含氨基酸的硫酸铵和20g琼脂溶解在800mL的dH₂O.高压灭菌器中，体积超过2L.加入100mL的20%葡萄糖和100mL的10x -Ura脱落。搅拌均匀，倒在培养皿上。储存在4°C。
   5. 为了用半乳糖（SG）-Ura琼脂培养基制备SC，将6.7g酵母氮碱与不含氨基酸的硫酸铵和20g琼脂溶解在800mL的dH₂O.高压灭菌器中体积超过2L的烧瓶中加入100mL的20%半乳糖和100mL的10x -Ura脱落。搅拌均匀，倒在培养皿上。储存在4°C。
2. 用于标清介质的库存解决方案
   <....

Results

已知α-突触核蛋白的高表达与PD模型系统中的神经元细胞死亡和PD有关。本研究描述了三种监测α-突触核蛋白细胞毒性和酵母中聚集α-突触核蛋白病灶形成的方法。在这里，α-突触核蛋白在酵母中过表达，并检查了野生型α突触核蛋白和三种被称为PD家族突变体的α-突触核蛋白变体的表型（图1 和 材料表）。

pRS426载体中 GAL1 启动子下的α-突触核蛋白表达在含有半乳糖作为诱导剂的琼脂平板上显示出显着的生长迟缓（图2）。在液体培养物中也观察到α-突触核蛋白表达的生长差异（图3）。在两种培养条件下，野生型α-突触核蛋白和具有E46K或A53T突变的变体由于α-突触核蛋白毒性而显示出生长缺陷。然而，不形成聚集体的α-突触核蛋白A30P变体显示出无毒表型。

为了了解细胞毒性与α-突触核蛋白聚集之间的关系，需要一种.......

Discussion

鉴于人类各种细胞系统的复杂性，使用酵母作为研究人类神经退行性疾病的模型是有利的。虽然使用酵母研究人脑的复杂细胞相互作用几乎是不可能的，但从单细胞的角度来看，酵母细胞在基因组序列同源性和基本的真核细胞过程方面与人类细胞具有高度的相似性^8，13。此外，鉴于遗传操作的便利性，酵母可以促进复杂和苛刻的人类系统的研究。因此，酵母被广泛用作了解真核细胞过程和各种疾病发病机制的模型系统¹⁴，^15，16。特别是，淀粉样蛋白（包括α-突触核蛋白¹⁷）的机中、体外和体内聚集特性之间存在差异。考虑到细胞中蛋白质行为的复杂性和不可预测性，研究体内蛋白质特性非常重要。因此，要了解具有α-突触核蛋白的细胞中发生了什么，有必要在体内

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 孔板	SPL	30096
琼脂糖	TAESHIN	0158
Bacto 琼脂	BD Difco	214010
Breathe-easy	多元化生物技术	BEM-1	用于微量滴定板
盖玻片	Marienfeld		24 x 60 mm
培养管	SPL	40014
比色	皿ratiolab	2712120
D-（+）-半乳糖	sigma	G0625
D-（+）-葡萄糖		g8270
D-（+）-棉子糖五水合	Daejung	6638-4105
培养箱（摇动）	Labtron		型号：SHI1
培养箱（静态）	Vision scientific		型号：VS-1203PV-O
LiAc	sigma	L6883
微孔板检测仪	Tecan	30050303 01	型号：Infinite 200 pro
多通道移液器 20-200 µL	gilson	FA10011
多通道移液器 2-20 µL	gilson	FA10009
奥林巴斯显微镜	奥林巴斯	IX-53
PEG	sigma	P4338	平均摩尔重量 3,350
Petridish	SPL	10090
pRS426			Christianson， T. W.， Sikorski， R. S.， Dante， M.， Shero， J. H. &Hieter， P. 多功能酵母高拷贝数穿梭载体。基因。110 （1）， 119-122 （1992）。
pRS426 GAL1 启动子 &α;-突触核蛋白 A30P			Outeiro， TF &Lindquist， S. 酵母细胞提供了对 α-突触核蛋白生物学和病理生物学的见解。科学。302 （5651）， 1772-1775 （2003）
pRS426 GAL1 启动子 &α;-突触核蛋白 A53T			Outeiro， TF &Lindquist， S. 酵母细胞提供了对 α-突触核蛋白生物学和病理生物学的见解。科学。302 （5651）， 1772-1775 （2003）
pRS426 GAL1 启动子 &α;-突触核蛋白 E46K			Outeiro， TF &Lindquist， S. 酵母细胞提供了对 α-突触核蛋白生物学和病理生物学的见解。科学。302 （5651）， 1772-1775 （2003）
pRS426 GAL1 启动子 &α;-突触核蛋白 WT			Outeiro， TF &Lindquist， S. 酵母细胞提供了对 α-突触核蛋白生物学和病理生物学的见解。科学。302 （5651）， 1772-1775 （2003）
储液罐	SPL	23050
分光光度计	eppendorf	6131 05560
W303a			来自 James Bardwell 的
礼物 酵母氮碱，不含氨基酸	Difco	291940
酵母合成脱落培养基补充剂，不含尿嘧啶	sigma	Y1501
YPD	康达拉布	1547.00