使用光片荧光显微镜成像衰老的耳蜗

摘要

开发了一种光片显微镜，用于对整个耳蜗进行成像和数字化。

摘要

根据世界卫生组织的数据，耳聋是最常见的感觉功能障碍，影响全球约5%或4.3亿人¹。衰老或老年性耳聋是感音神经性听力损失的主要原因，其特征是毛细胞、螺旋神经节神经元（SGNs）以及血管纹的损伤。这些结构位于耳蜗内，而耳蜗具有复杂的螺旋状解剖结构，由悬浮在液体中的膜性组织构成，并被骨性结构包围。这些特性使得耳蜗的组织病理学变化在技术上难以研究和量化。为满足这一需求，我们开发了一种光片显微镜（TSLIM），可对整个耳蜗进行成像和数字化，以促进对内耳结构与功能关系的研究。通过对整个耳蜗进行良好对齐的连续切片，可获得一系列图像，用于三维（3D）体积重建及单个结构的分割，从而实现三维可视化和定量分析（如长度、宽度、表面积、体积和数量）。耳蜗样本仅需经过最少的处理步骤（固定、脱钙、脱水、染色和光学透明化），且所有步骤均兼容后续的扫描电镜和透射电镜高分辨率成像。由于所有组织均保留在图像堆栈中，每个结构均可单独评估，或相对于其他结构进行评估。此外，由于成像使用荧光探针，可结合免疫组织化学和配体结合技术，识别特定结构及其在耳蜗内的三维体积或分布情况。本文中，我们利用TSLIM检测了老年小鼠的耳蜗，以量化毛细胞和螺旋神经节神经元的丢失。此外，还采用高级分析方法（如聚类分析），沿Rosenthal管的三维体积可视化其局部螺旋神经节神经元的减少情况。这些方法展示了TSLIM显微镜在耳蜗内部及不同耳蜗之间量化结构与功能关系的能力。

引言

耳蜗是哺乳动物听觉的外周感觉器官。它具有复杂的螺旋结构，包含重复排列的感觉细胞和支持细胞，这些细胞在解剖结构上特化为能够探测声波振动，并将其传递至大脑以产生听觉感知。主要的感觉元件是内毛细胞和外毛细胞，以及支配它们的神经纤维，这些神经纤维的胞体构成位于罗森塔尔管内的螺旋神经节（图1）。这些感觉和神经结构呈音位式排列，使得高频声音在耳蜗基部被转导，而低频声音则在耳蜗顶部被转导²。沿基底膜螺旋长度分布的感觉细胞的解剖图谱称为细胞耳蜗图³，可与听力损失随频率变化的情况（如听力图所示）进行比较。

耳蜗的膜迷路被致密的骨组织包围，这在技术上使得同时检查多个耳蜗结构变得困难。因此，开发光片显微镜的目的是生成完整耳蜗的整齐连续光学切片，以便在三维重建中相对地观察所有耳蜗结构。Voie 等人⁴以及 Voie 和 Spelman⁵设计了第一台光片显微镜，称为正交平面荧光光学切片（OPFOS）显微镜，用于对整个耳蜗进行光学切片。然而，该显微镜从未实现商业化开发；因此，我们的目标是构建一台名为薄片激光成像显微镜（TSLIM；图2）的光片显微镜。TSLIM 的设计与构建细节此前已有发表⁸。TSLIM 在 OPFOS 的基础上进行了多项改进，包括采用低光照数字相机替代 CCD 相机进行图像采集、使用光学编码的微位移器以实现样本在光片中精确且可重复的移动、采用市售的光学透明样本腔室，以及在乙醇中进行罗丹明染色而非在透明溶液中染色，以防止染料在组织内沉淀。诸如 SPIM⁶等光片显微镜的商业化发展主要集中在对活体小型透明样本的高分辨率成像，但由于工作距离不足，不适合用于完整耳蜗的成像。Santi⁷曾发表综述，回顾了其他光片显微镜的发展历程。TSLIM 相较于其他耳蜗组织学方法的主要优势在于，能够在保持样本完整性的前提下进行光学切片并实现三维重建，从而使样本仍可用于其他组织学方法。TSLIM 成像的另一优势在于，仅使用激光产生的薄光片照射组织，而共聚焦显微镜则需将整个组织厚度暴露于激光下。通过组织透明化以减少光散射，且仅有少量组织暴露于激光，使得光片激光成像中的荧光染料褪色（光漂白）程度极小。然而，固定、脱水和透明化过程确实会改变耳蜗结构的形态，并导致组织收缩，与活体组织相比存在差异。实际发生的组织收缩程度尚未确定。

TSLIM 由 Shane Johnson 和八名德国光学工程专业学生开发（参见致谢部分）。TSLIM 的构建细节由 Santi 等人⁸ 提供，扫描式版本（sTSLIM）则由 Schröter 等人⁹ 报道。TSLIM 可作为非破坏性显微切片装置，对样本进行光学切片，同时作为显微镜，获取贯穿耳蜗全长和全厚度的二维连续光学切片。TSLIM 能够对尺寸较小（毫米级）和较大（厘米级）、较厚的样本进行成像。其物镜采用空气介质安装，可在解剖显微镜上使用 1× 和 2× 的长工作距离收集物镜。解剖显微镜还配备变倍光学系统，使 TSLIM 能够分辨细胞内的亚细胞结构和突触结构。TSLIM 配备蓝色（473 nm）和绿色（532 nm）两种激光光源，可支持多种荧光探针用于成像。TSLIM 的目标是获取贯穿整个耳蜗组织、精确对齐的二维光学切片，以实现耳蜗组织的完整数字化重建。由于该方法基于荧光成像，也可结合配体标记和免疫组织化学技术，用于识别特定的耳蜗结构。

最初使用柱面透镜产生两个相对的高斯光片，但会产生吸收成像伪影。由于Keller等人¹⁰的工作，固定柱面透镜被扫描振镜取代以生成光片⁹。此外，由于光片中心在光束腰处最薄，因此sTSLIM的二维图像通过采集贯穿样本宽度的X轴数据列组合而成（图3）。该方法最早由Buytaert和Dircks¹¹描述。用于驱动和采集图像的TSLIM定制软件是使用图形化仪器控制程序开发的。光片穿过样本，照亮组织内的一个荧光平面。该荧光平面通过透明样本正交投影，并由解剖显微镜采集。光学编码的微位移器允许沿X轴扫描光束腰，以采集单幅组合的二维图像；随后，Z轴微位移器将样本移动到组织更深层的平面，以获取一系列连续切片的二维图像堆栈（视频1，图4）。在整个耳蜗的宽度、厚度和长度方向上采集平移图像堆栈，无需进行图像拼接（视频2）。图像堆栈被传输至另一台计算机，并载入三维重建软件进行三维重建与定量分析。这些图像堆栈包含了显微镜分辨率下耳蜗形态的全部数字信息。然而，若需要更高分辨率，完整的耳蜗还可进一步通过破坏性组织学方法处理，例如切片机切片、扫描电镜和透射电镜观察。

使用三维渲染程序对不同耳蜗结构进行分割，以实现三维可视化和定量分析。在分割过程中，通过图形数位板和笔在每张二维图像上用不同颜色勾画出每一结构（图5）。截至目前，已有20种不同的耳蜗结构被成功分割（图6）。完成分割后，可进行多种三维分析。例如，三维渲染软件可沿结构的中心轴线在任意平面对耳蜗进行虚拟切片。视频3展示了与柯蒂氏器相切的切片过程，从而清晰呈现基底膜全长上的毛细胞。该过程首先需要手动分割目标结构，随后根据从结构基部到顶部中心线上设置的样条点的最小二乘法拟合计算其中心轴线，从而估算结构的长度（视频4）。类似的方法称为骨架化（skeletonization），可用于通过颜色图谱可视化结构沿其长度方向的径向宽度（视频4）。程序在分割完成后可自动计算每个结构的总体积，同时也可以在三维渲染软件中利用颜色图谱对相对距离进行量化和可视化（图7）。分割后的结构还可导出，用于制作放大的实体塑料模型（图8）。此外，也可利用三维渲染软件进行半自动化的细胞计数（图9）。通过免疫组织化学染色或配体结合技术可特异性标记特定耳蜗结构，并将这些结构从其他耳蜗组织中分离出来，进行形态计量学评估，例如生成细胞耳蜗图谱（cytocochleogram）（图10）。所有耳蜗结构的长度、宽度、表面积、体积及数量均可从三维模型中测定，使该方法成为将耳蜗损伤与功能障碍进行关联映射的理想工具。具体而言，可通过二维光学切片重建的三维耳蜗模型，直观展示并量化由衰老、噪声性损伤或其他有害因素引起的耳蜗损伤。一旦耳蜗组织完成数字化，便可利用多种图像算法，在解剖学配准的基础上评估耳蜗内任何组织的损伤情况，并与其他耳蜗组织进行对比分析。

方案

所有实验操作及活体动物的使用均已通过明尼苏达大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）的审查和批准（方案编号 #2010-38573A），且使用这些动物的研究人员在进入动物设施前，均已接受研究动物资源（RAR）兽医团队的全面培训与考核。本研究中使用了雄性和雌性小鼠。

1. 用于固定及成像用组织处理的耳蜗摘除

1. 使用 CO₂ 处死一只小鼠₂ 吸入麻醉后，用剪刀将小鼠断头，沿脑部做背腹向切口以分离颅骨。取出脑组织，辨认颅底腹侧圆形的鼓泡结构，用咬骨钳打开鼓泡，观察并取出耳蜗。
2. 固定：在通风橱内进行此操作，使用解剖显微镜（5倍放大）。佩戴手套和防护服。用尖头镊子刺破卵圆窗并取出镫骨。将镊子插入圆窗以刺破膜。
3. 用连接有装有2 mL甲醛溶液的1 mL注射器的输液器剪断后的管尖覆盖打开的圆窗。在2分钟内缓慢将甲醛溶液注入耳蜗的外淋巴间隙，注意观察甲醛溶液从耳蜗流出 通过 打开的卵圆窗。修剪耳蜗上多余的组织，将其浸入含有10%甲醛的瓶子中，并置于旋转器上过夜。
4. 脱钙：将耳蜗用 PBS 溶液冲洗 3 次，每次 5 分钟，随后置于含有 10% 乙二胺四乙酸二钠（EDTA）溶液的容器中，在旋转条件下孵育 4 天，每天更换溶液。
5. 脱水：用 PBS 灌注耳蜗 3 次，每次更换之间浸泡 15 分钟。用递增浓度的乙醇（10%、50%、70%、95%、95%、100%、100%）对耳蜗进行脱水，每个浓度处理 30 分钟。
   ​注意：脱水前必须彻底去除所有EDTA，因为EDTA会在乙醇中沉淀。此外，耳蜗可在浓度高于70%的乙醇中过夜保存。
6. 染色：将整个耳蜗浸入罗丹明B异硫氰酸盐溶液（5 µg/mL，溶于100%乙醇）中，旋转孵育过夜。用100%乙醇更换两次溶液，每次5分钟，以去除耳蜗中多余的染料。
7. 透明处理：将染色后的耳蜗转移至两份新鲜的 Spalteholz 试剂中¹² 溶液（水杨酸甲酯：苯甲酸苄酯 = 5:3），每次更换溶液30分钟，随后在透明溶液中旋转过夜。耳蜗可无限期保存于Spalteholz溶液中。

2. 耳蜗成像

1. 将耳蜗的卵圆窗和圆窗膜端固定在样品杆上，以确保透明溶液保留在耳蜗内部且不产生气泡（图2）。必须注意避免耳蜗内部形成气泡，因为气泡难以去除，若残留在组织中将导致成像伪影。
2. 使用紫外光固化胶将湿润的耳蜗粘附到干燥的样品杆上（图2），粘接位置为卵圆窗和圆窗末端。用紫外光围绕耳蜗照射10秒以固化紫外胶。
   注意：耳蜗与样品杆连接松动会导致成像缺陷。该样品杆为此实验方案专用（详见 Santi 等⁸），且专用于我们的光片显微镜。
3. 将耳蜗悬置于充满 Spalteholz 溶液的成像室中进行成像。样品室为光学透明的石英荧光比色皿（视频1）。
4. 将样品杆固定于一个可旋转的夹具上，该夹具同时连接至XZ平移台。大多数图像堆栈通过在XZ平面内移动样品获得，但也可获取旋转堆栈图像。
5. TSLIM光学切片：根据荧光染料的类型选择使用蓝色或绿色激光进行激发。将光片置于组织中部以进行对焦，并确定用于照亮耳蜗全宽度的放大倍数。然后使用定制程序，使样品沿X轴方向穿过光片（拼接图像），并在Z方向上以步进方式采集一系列2D图像，从而在整个耳蜗范围内生成图像堆栈。
6. 对于首幅图像，将光片的束腰位置对准样品边缘，程序将扫描样品的全宽度，采集宽度等于共焦参数的数据列（参见图像拼接；Santi 等⁸）（图3），以生成覆盖样品全宽度、具有最大分辨率的复合2D图像。该程序将自动完成每个Z步进的图像拼接，直至整个样品被完全成像。
7. 图像处理：将图像堆栈传输至另一台计算机，并导入三维重建软件中进行三维重建与定量分析。

结果

由于本期特刊的主题是成像耳蜗衰老的影响，将分别以年轻（3月龄，HS2479，CBA品系小鼠）和年老（23月龄，HS2521，C57品系小鼠）的耳蜗作为示例。需要注意的是，TSLIM能够成像多种样本，包括来自人类、哺乳动物、其他啮齿类动物和鱼类的耳蜗，以及其他器官如脑组织。

Johnson 等人¹³曾发表一篇关于使用 TSLIM 技术研究年轻（3周龄）CBA 小鼠螺旋神经节神经元（SGN）的文章。该研究统计了五只小鼠的全部 SGN，数量范围为 8,408–8,912 个，平均 Rosenthal 长度为 2.0 mm。在本研究中，我们统计了一只 3 月龄 CBA 小鼠的 SGN，其 Rosenthal 蜗管长度为 2.0 mm，共包含 7,913 个 SGN。而一只 23 月龄的 C57BL6 小鼠在 Rosenthal 长度为 2.11 mm 的范围内含有 6,521 个 SGN。体积渲染图像显示了双侧耳蜗中所有的 SGN，但在年老小鼠中并未明显看出 SGN 的丢失。然而，以 Rosenthal 蜗管距离为函数的 SGN 细胞计数线性...

讨论

利用光片显微镜进行光学切片以观察耳蜗结构，与传统组织学方法不同，该方法不具机械破坏性，能够提供耳蜗各结构之间关系的完整数字化视图。以往的方法，如柯蒂氏器的表面制备法¹⁴，虽可描绘出基底膜全长上毛细胞丢失的分布图，但由于组织已被剥离以暴露柯蒂氏器，无法评估螺旋神经节神经元（SGN）的损失情况。另一种方法——耳蜗的中转微切片，仅能提供罗森塔尔管全长范围内SGN状态的极小部分样本。而使用TSLIM技术，所有耳蜗结构均可在仪器分辨率水平（即亚细胞级）实现数字化。完整的耳蜗图像堆栈使得多种耳蜗结构的定量分析与可视化成为可能，而这些在传统组织学方法中无法实现。例如，本研究通过聚类算法，展示了一种全新的方式来观察和量化罗森塔尔管内SGN细胞密度，并表征因衰老导致的细胞丢失（图12）。

TSLIM 是一种早期⁸ 受Voie及其同事工作的启发，开发了一台光片显微镜^4,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Amira 3D 渲染软件	赛默飞世尔科技		地址：501 90th Ave NW, Coon Rapids, MN 55433
苯甲酸苄酯 (W213810)	Sigma-Aldrich公司		地址：邮政信箱 14508，密苏里州圣路易斯，68178
邦迪克	邦迪克		地址：235 Industrial Parkway S., Unit 18 Aurora, ON L4G 3V5 加拿大
95% 和 100% 乙醇	明尼苏达大学		地址：明尼苏达州明尼阿波利斯市通用仓库，邮编 55455
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA）  (E5134)	Sigma-Aldrich公司		地址：邮政信箱 14508，圣路易斯，密苏里州 68178
LabVIEW 图形化程序与视觉系统	国家仪器公司		地址：11500 N Mopac Expwy，奥斯汀，德克萨斯州 78759-3504
水杨酸甲酯 (M6742)	Sigma-Aldrich, Inc.		地址：邮政信箱 14508，密苏里州圣路易斯，68178
奥林巴斯 MVX10 体视显微镜	奥林巴斯公司		地址：3500 Corporate Parkway, Center Valley, PA 18034
罗丹明B异硫氰酸酯，(283924)	Sigma-Aldrich, Inc.		地址：邮政信箱 14508，圣路易斯，密苏里州 68178
斯塔纳荧光计比色皿（3-G-20）	Starna 细胞		地址：邮政信箱 1919，阿塔斯卡德罗，加利福尼亚州 82423