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利用组织破碎、匀浆及连续过滤相结合的方法从牛卵巢中分离小型前腔卵泡

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DOI：

10.3791/64423

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2022年9月27日

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1Department of Animal Science, University of California Davis

通讯作者： Anna C. Denicol <acdenicol@ucdavis.edu>

本文内容

摘要

推进原始卵泡发育的研究需要从单个卵巢中高效分离卵泡的方法。本文介绍了一种利用组织切片机和匀浆器从牛卵巢中分离卵泡的简化机械法。该方法可从单个卵巢中收集大量具有活性的原始卵泡。

摘要

了解哺乳动物卵泡发生全过程对于提高家畜、人类以及濒危物种的辅助生殖技术至关重要。由于难以分离较小的前窦卵泡，尤其是大型哺乳动物（如牛）中的前窦卵泡，相关研究大多局限于窦状卵泡和较大的前窦卵泡。本研究提出一种高效方法，可从单个牛卵巢中获取大量小型前窦卵泡。将单个牛卵巢皮质使用组织切片器切成500 µm的立方体，随后用10 mm探头在9,000–11,000 rpm条件下匀浆处理6分钟。先用纱布去除匀浆液中的大块碎片，再依次通过300 µm和40 µm细胞筛进行连续过滤。将截留在40 µm筛网上的物质冲洗至搜索皿中，在显微镜下识别并将其卵泡收集至液滴培养基中。对所收集卵泡的活力进行检测 通过 台盼蓝染色。该方法可在约90分钟内从单个牛卵巢中分离出大量有活力的小型前腔卵泡。重要的是，该方法完全采用机械方式，避免使用可能损伤卵泡的酶来解离组织。通过本方案获得的卵泡可用于后续应用，如提取RNA用于RT-qPCR、特定蛋白质的免疫定位等。 体外 培养

引言

卵巢卵泡是卵巢的功能单位，负责配子（卵母细胞）的产生以及对生殖功能和整体健康至关重要的激素分泌。原始卵泡在胎儿发育期或出生后早期（取决于物种）于卵巢中形成1，并构成了女性的卵巢储备。卵泡生长始于原始卵泡的激活，这些卵泡离开静止池并进入生长期。卵泡发生中的前窦状卵泡阶段（即窦状卵泡形成之前的所有卵泡阶段）是一个高度动态的过程，需要卵母细胞及其周围颗粒细胞在形态和代谢上的同步变化，这一过程由这两类细胞之间的紧密通讯所驱动2,3。前窦状卵泡在任一时间点均占卵巢中卵泡单位的大多数4。据估计，卵泡发生过程中前窦状阶段的发育时间比窦状卵泡阶段长约数周5,6，这段时期对于卵母细胞和体细胞获得足够的成熟度以进入最终发育阶段（即窦状卵泡阶段），并为排卵、受精及胚胎发育做好准备至关重要7,8,9。

目前关于卵巢前腔卵泡发生的大部分知识来源于小鼠模型10,11,12,13，部分原因是从体积更小且纤维较少的卵巢中回收大量此类卵泡较为容易。尽管从牛卵巢中分离大量前腔卵泡的报道可追溯至约30年前14，对调控这些早期卵泡发育过程的更全面理解仍未实现，这主要归因于缺乏优化、高效且可重复的方法来获取足量的、具有活性的原始卵泡，尤其是处于发育早期阶段的卵泡。随着人类辅助生殖中对保存卵巢储备功能以供未来使用的需求日益增加，牛因其卵巢结构与人类更为相似而成为一个有吸引力的模型15然而，与小鼠卵巢相比，牛卵巢中的胶原蛋白含量显著更高16，使得采用小鼠相关方法进行机械分离的效率极低。拓展生育力保存技术的研究工作包括完整 体外 原始卵泡发育至有腔卵泡阶段，随后 体外 卵母细胞的体外成熟（IVM） 体外 体外受精（IVF）以及胚胎的制备与移植17迄今为止，这一完整过程仅在小鼠中实现18在牛中，卵泡生长的进展 体外 仅限于少数研究报告，这些研究在培养开始时卵泡阶段不一，且不同方案之间的培养时间长短也存在差异17,19.

文献中描述的从牛卵巢中采集前腔卵泡的方法，主要采用机械法和酶解法，可单独使用或联合使用2,14,17,20。首个关于牛前腔卵泡分离的实验方案报道使用组织匀浆器结合连续过滤法处理整个卵巢20。随后的研究则报道了结合机械法与使用胶原酶的酶解法的联合操作流程14。在利用胶原酶消化卵巢组织时，一个反复出现的问题是可能损伤卵泡基底膜，从而影响卵泡的存活能力14,21,22,23。因此，研究人员已尝试采用不同的机械方法组合，例如使用组织切片器结合反复吹打，或组织切片器与匀浆法联合使用20,24,25,26。另一种已报道的机械法是利用针头直接从卵巢组织中解剖前腔卵泡，该方法特别适用于分离较大的（>200 µm）次级卵泡。然而，该过程耗时较长，对分离较小的前腔卵泡效率较低，且在牛卵巢中操作时对技术人员的操作技能要求较高19,27,28。

借鉴文献中描述的不同技术，本实验方案旨在以一种简单、稳定且高效的方法优化从单个牛卵巢中分离原始卵泡，避免使用酶溶液进行孵育。改进原始卵泡的分离方法将有助于深入理解卵泡发生这一阶段的生物学特性，并推动有效培养体系的建立，以实现原始卵泡向腔前卵泡阶段的发育。本文详述的从牛等大型哺乳动物中分离原始卵泡的具体操作步骤，对于致力于研究非啮齿类动物早期卵泡发生、且研究成果可转化为人类应用的科研人员而言至关重要。

方案

牛（Bos taurus）卵巢取自当地屠宰场，并在采集后6小时内运送到实验室。由于该设施处理的动物数量众多，动物的年龄、品种以及动情周期阶段均不明确。由于本实验未使用活体动物，无需经过批准的动物护理与使用方案。

1. 仪器与试剂的准备

  1. 在实验台上用实验台纸覆盖约60厘米宽的区域。
  2. 准备以下器材：手术刀柄、无菌手术刀片、止血钳、解剖镊子一副、20 mL鲁尔锁型注射器、18号针头、200 mL烧杯两个、500 mL锥形瓶、直径104 mm的塑料漏斗、塑料切板、每处理一个卵巢需准备一层22 cm2的纱布（纱布可在使用前通过高压灭菌进行消毒）、300 µm细胞筛和40 µm细胞筛（参见材料表）。
  3. 将所有器材放置于实验台纸上。
  4. 使用止血钳将手术刀片安装到手术刀柄上。将刀片的斜面底部对准刀柄上的斜面标记，然后将刀片滑入刀柄的凹槽中。
  5. 将漏斗放入锥形瓶中，并用纱布覆盖漏斗开口。
  6. 每处理一个卵巢，准备一个50 mL离心管，并将其置于设定为38.5 °C的水浴或金属珠浴中。
  7. 每处理一个卵巢，准备一个100 mm × 15 mm的方形培养皿，并将其置于设定为38.5 °C的载玻片加热器上。
  8. 向1 L的1×磷酸盐缓冲液（PBS）中加入10 mL青霉素-链霉素溶液（PenStrep；含青霉素10,000 U/mL和链霉素10,000 µg/mL）。在卵巢处理前至少2小时，将PBS + PenStrep置于设定为38.5 °C的水浴或金属珠浴中预热。
    ​注意：当分离的卵泡需要进行培养时，使用PBS + PenStrep溶液清洗卵巢至关重要；此外，为减少微生物污染，也建议在任何后续实验中使用该溶液。
  9. 为收集处理后的卵巢滤液，使用卵泡洗涤液（FWM），其成分为含Hank's盐的TCM199培养基（参见材料表），并添加3 mg/mL牛血清白蛋白（BSA）、25 mM HEPES缓冲液、100 IU青霉素/100 µg/mL链霉素、1 mM丙酮酸钠（NaPyr）和100 nM非必需氨基酸（NEAA）。
    1. 将无菌TCM199培养基、一个250 mL试剂瓶和一个100 mL量筒转移至生物安全柜（BSC）中。将194 mL TCM199转移至试剂瓶中。
    2. 将装有TCM199的烧杯从生物安全柜中取出，置于搅拌器上。向瓶中加入600 mg BSA、1.19 g HEPES缓冲液和一根已灭菌的搅拌子，持续搅拌至完全溶解。
    3. 待BSA和HEPES缓冲液完全溶解后，逐滴加入1 N氢氧化钠（NaOH）调节培养基pH值至7.6–7.8（使用pH计测定）。
    4. 在将试剂瓶、真空过滤装置、四个50 mL离心管以及PenStrep、NaPyr和NEAA试剂瓶转移至生物安全柜前，先用70%乙醇擦拭其表面。
    5. 向含有3 mg/mL BSA和25 mM HEPES的TCM199培养基中加入PenStrep（青霉素10,000 U/mL和链霉素10,000 µg/mL）、100 mM NaPyr和100× NEAA各2 mL。将最终培养基通过无菌过滤，并分装至50 mL离心管中。分装后的培养基可在4 °C保存最多2周。
    6. 在卵巢处理前至少1小时，将每两个卵巢所需的一管50 mL培养基置于设定为38.5 °C的金属珠浴中预热。

2. 组织切片机设置

  1. 确保组织切片机（见材料表）已接通电源并开启。
  2. 根据制造商的说明，将切片厚度设置为 500 µm，刀片力度控制旋钮设置为 20°，速度控制旋钮设置为 90°。
  3. 将一个 60 mm 塑料培养皿插入载板架中，并将载板架安装到工作台上。
  4. 顺时针旋转手动操作旋钮，将切片臂升至最高位置。
  5. 使用镊子，将双刃剃须刀片（见材料表）放置在切片臂上的螺钉上。将刀片夹扣在刀片上，并用垫圈和螺母固定，螺母留出四分之一圈的松动。
  6. 旋转手动操作旋钮，使切片臂将刀片压平至培养皿上。然后使用螺母扳手将螺母完全拧紧。
  7. 使用手动操作旋钮将切片臂升至最高位置。将台面释放旋钮完全向左移动，直至其卡入到位。

3. 卵巢制备

  1. 将卵巢转移至实验室中预热（38.5 °C）的无菌 PBS + PenStrep 溶液中。
    注意：建议在从动物体内取出卵巢后尽快进行卵泡分离处理。本方案中，卵巢在收获后6小时内完成处理。卵巢从屠宰场运送至实验室时，应置于保温瓶中，内含约38.5 °C的无菌0.9%生理盐水。
  2. 尽可能选择体积较小（≤ 4 cm × 3 cm × 3 cm）、含有小腔卵泡（3–5 mm）、无大腔卵泡（≥8 mm）且无明显黄体的卵巢（图1）。推荐采用这些标准，以确保最终获得的分离卵泡样本中所含非卵泡成分（如基质细胞和细胞外基质）尽可能少。
    注意：腔卵泡可识别为卵巢表面球形、充满液体的囊状结构；黄体则可识别为从卵巢表面突出的红色、橙色或黄色坚硬结构。
  3. 使用剪刀去除卵巢上多余的结缔组织和脂肪。
  4. 在烧杯中用70%乙醇清洗卵巢30秒。
  5. 用烧杯中的温PBS + PenStrep（38.5 °C）清洗卵巢3次，每次2分钟，每次使用新鲜的PBS + PenStrep溶液。
  6. 将卵巢保存在温PBS + PenStrep（38.5 °C）中，待处理时取出。
    注意：实验室与卵巢来源地之间的距离可能不同，因此及时完成操作流程至关重要，以确保卵泡活力的维持。

静力平衡示意图，展示凝胶切片中的力与矢量，说明平衡概念。
图1：牛卵巢的解剖结构。 牛卵巢由上皮层包裹，包含两个主要区域。皮质位于虚线左侧，包含从原始卵泡到有腔卵泡各个发育阶段的卵巢卵泡。原始前卵泡体积过小，肉眼不可见；有腔卵泡以星号标出。髓质位于虚线右侧，包含血管、淋巴管和神经。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 切碎步骤

注意：每次仅处理一个卵巢。应快速处理卵巢，避免温度降低，否则可能影响卵泡的存活率。

  1. 将一个卵巢转移至实验台纸上的切板上（图2A），并准备组织切片机（图2B）。
  2. 使用镊子和手术刀将卵巢纵向切成两半，并从每一半中去除髓质，仅保留厚度约为1 mm的皮质，如 图2C 所示。
    1. 沿一侧韧带附着点至对侧附着点方向，将卵巢纵向切开成两半。
    2. 将其中一半卵巢保留在切板上待处理，将另一半放回温热（38.5 °C）的 PBS + PenStrep 溶液中。
    3. 使暴露的髓质朝上，沿卵巢曲率在距离卵巢表面约2 mm处进行切割，但不切穿皮质。
    4. 以上述沿卵巢曲率的切口为引导，继续沿卵巢曲率加深切口，以分离皮质与髓质。
    5. 沿黄体边界切开，解剖并弃去卵巢中的黄体组织。
    6. 将卵巢半片翻转，使上皮面朝上，用手术刀完成髓质与皮质的分离。修剪掉卵巢组织边缘残留的、与韧带相连的白色结缔组织。
    7. 当大部分髓质已被去除后，使用手术刀将皮质修整至约1 mm厚度。通过微小的前后移动操作手术刀，刮除剩余的髓质组织。
      注意：髓质是卵巢的内层部分，含有较大的血管；皮质是卵巢的外层部分，位于最外层表面上皮下方。牛卵巢皮质厚度约为1 mm，因此将卵巢切割至1 mm厚度即可去除髓质。
  3. 将皮质切成不超过2.5 cm × 2.5 cm 的小块。在准备切碎前，将皮质块保持在温热（38.5 °C）的 PBS + PenStrep 溶液中。
  4. 用至少50 mL温热（38.5 °C）的 PBS + PenStrep 溶液填充烧杯，并准备一支塑料移液管。
  5. 将一块皮质转移至组织切片机上的培养皿中，并用三到四滴温热（38.5 °C）的 PBS + PenStrep 溶液润湿组织。
  6. 用一对镊子固定组织块，按下复位按钮一次以启动组织切片机。一只手稳定培养皿，同时继续用镊子固定组织。根据需要将镊子向左移动，避免刀片接触镊子。所得条状组织长度约为500 µm。
  7. 当整块皮质均被切割成条状后，使用刀片架旋钮将刀片抬离培养皿，并用镊子清除刀片上的残留组织。
  8. 将载物台旋转90°。
  9. 按下复位按钮一次。一只手稳定培养皿，同时用镊子将组织条推入刀片路径中。
  10. 使刀片完全穿过组织条。使用刀片架旋钮将刀片抬离培养皿，并用镊子清除刀片上的残留组织。
  11. 使用移液管和温热（38.5 °C）的 PBS + PenStrep 溶液，将切碎后的组织（最终组织尺寸：500 µm × 500 µm × 1 mm 的立方体）冲洗至预温（38.5 °C）的50 mL锥形管中。将锥形管放回水浴或珠浴中，以维持切碎组织的温度（38.5 °C）。
  12. 使用扳手从切削臂上卸下螺母，并取下垫圈和刀片夹。用镊子将刀片从切削臂上取下，翻转使其未使用的刃边朝向培养皿，再放回切削臂上。重新安装刀片夹、垫圈和螺母，并按照步骤2.5–2.7所述重置台面释放旋钮。
  13. 对卵巢剩余的所有皮质块重复步骤4.5–4.12，每次使用完一个刃口后更换新刀片。
  14. 将所有使用过的刀片弃置于硬质塑料锐器盒中。

5. 匀浆步骤

  1. 确保匀浆机装置（参见 材料表）已接通电源，且转速已设置为第二档（9,000–11,000 rpm）。根据制造商的说明，将10 mm发生器探头插入装置中。
  2. 设置计时器为1分钟，将探头插入含有一个卵巢切碎皮质组织（步骤4.11）的50 mL锥形管中，并加入足量PBS + PenStrep使液体达到25 mL刻度线。探头插入的深度应为从腔室底部测量的液面高度的三分之一。将探头略微偏离中心位置，以尽量减少涡流产生。
  3. 启动计时器并打开匀浆机。确保探头底部不接触管底，并在匀浆机运行时保持管子静止不动。
  4. 匀浆1分钟后，将探头从管中取出。使用镊子清除排气孔以及转子刀片与转子管之间空隙中的任何结缔组织堵塞物。若皮质组织碎片卡在探头中，用镊子将其取出并放回管中。
  5. 重复步骤5.2–5.4，再进行5次，共计完成6分钟匀浆。
  6. 将含有匀浆后组织的管子放入水浴或珠浴中以保持组织温度（38.5 °C）。处理完最后一个卵巢后，立即根据制造商的说明拆卸、清洗并干燥发生器探头。

6. 过滤步骤

  1. 将分散的组织倒入置于锥形瓶上的纱布漏斗中。用温热的（38.5 °C）PBS + PenStrep冲洗管内残留物至漏斗中，直至管内无组织碎片残留。
  2. 通过将纱布包裹住组织碎片并扭转挤压，迫使组织碎片穿过纱布孔隙，直至纱布上无多余液体和组织残留。
  3. 将纱布重新铺展于漏斗上，使用移液管以PBS + PenStrep冲洗纱布，并再次挤压使任何残留的组织碎片穿过纱布。
  4. 用止血钳夹持300 µm细胞滤筛置于一个200 mL烧杯上方。将锥形瓶中的滤液倒入细胞滤筛中。用温热的（38.5 °C）PBS + PenStrep冲洗锥形瓶内的残留物进入细胞滤筛，直至无组织碎片残留。
    1. 若细胞滤筛被组织堵塞，可轻轻敲击滤筛使液体完全滤入烧杯；随后将滤筛倒置，轻敲使大块组织残渣落入实验台用纸中。将滤筛重新置于烧杯上方，继续过滤剩余滤液。必要时重复此操作，直至锥形瓶中所有滤液均完成过滤。
  5. 用止血钳夹持40 µm细胞滤筛置于第二个200 mL烧杯上方。将第一个200 mL烧杯中的滤液倒入该细胞滤筛中。用温热的（38.5 °C）PBS + PenStrep冲洗烧杯内容物进入细胞滤筛，直至无组织碎片残留。请勿丢弃40 µm细胞滤筛中的残留物。
  6. 将18 G针头安装至20 mL注射器上。用FWM充满注射器。将40 µm细胞滤筛倒置在方形培养皿上方，用注射器冲洗滤筛内容物至培养皿中。重复填充注射器并按需冲洗滤筛，直至无组织碎片残留。
    注意：通常25 mL的FWM足以完全冲洗出40 µm细胞滤筛中的全部内容物。

组织处理装置；切片机和匀浆器；用于分析的组织制备流程图。
图 2：卵巢处理的工作区设置及实验流程示意图。（A）在切碎前切割卵巢所用的实验台设置，以及用于过滤卵巢匀浆物的装置。（B）组织切碎机与匀浆器的装置配置，其中使用泡沫塑料支撑以减少匀浆器平台的振动。（C）示意图展示了处理一个完整卵巢的操作流程。卵巢去除多余的结缔组织后，沿中线切为两半，并去除髓质部分，保留约 1 mm 厚的皮质组织。将皮质切成 2.5 cm × 2.5 cm 的小块，使用组织切碎机以 500 µm 的切片间隔进行切碎。随后将组织块进行匀浆处理，匀浆液先经纱布过滤，再依次通过 300 µm 和 40 µm 的细胞筛网过滤。收集 40 µm 细胞筛网中的残留物，并用缓冲液冲洗至方形培养皿中，在体视显微镜下寻找卵泡。图示使用 BioRender.com 制作。请点击此处查看该图的放大版本。

7. 卵泡的搜索与收集

  1. 将方形培养皿（步骤 6.6）转移至载物台预热至 38.5 °C 的体视显微镜下。体视显微镜的放大倍数应根据操作者的偏好设置在 1.25x 至 3.2x 之间。
  2. 用移液器吸取 10 µL FWM 液滴至 60 mm 培养皿中，并在液滴上覆盖矿物油以防止干燥。将含有培养基液滴的培养皿置于设定为 38.5 °C 的加热板上。
    注意：可使用 4 孔板收集卵泡。向一个或两个孔中加入 500 µL 清洗培养基，并将其置于设定为 38.5 °C 的加热板上。
  3. 准备微量移液器的推杆和吸头。
    注意：推荐使用玻璃制 1–5 µL 微量移液器（见材料表），因为卵泡在转移过程中不易黏附于玻璃移液器而丢失。此外，该仪器尺寸较小，便于对卵泡进行更轻松且精确的显微操作。
  4. 在方形培养皿中识别卵泡，并使用微量移液器将其转移至培养基（FWM）液滴中。许多卵泡可能嵌在组织碎片中，可采用以下两种方法之一进行回收。
    注意：卵泡呈椭圆形而非完美的球形，通常在卵泡中央可见一个卵母细胞，在较暗背景下表现为实心白色圆点（图 3A-C）。注意避免将卵泡与裸露的卵母细胞混淆。卵母细胞通常为完美的球形，周围包绕一层较厚且透明的膜（透明带）。可使用放大倍数为 10x（或更高）的倒置显微镜对卵泡进行更细致的观察（图 3D）。
    1. 使用微量移液器吸头或细针（27 G）小心地将卵泡与碎片分离。
    2. 或者，使用带橡胶球的玻璃巴斯德移液器多次吸取并吹打培养皿中的碎片，以使卵泡从碎片中脱离。
  5. 操作应迅速，搜索培养皿的时间不得超过 30 分钟，以有助于维持卵泡的活性。
  6. 每个 10 µL 液滴中最多放置五个卵泡，密度过高会增加卵泡相互黏附的可能性。

8. 台盼蓝排斥法细胞活力检测

注意：在进行以下所有步骤时，使用培养皿的皿盖或4孔板，因为卵泡黏附在皿盖的塑料表面较少，而更容易黏附在培养皿本体的塑料表面。

  1. 通过将 100 mg 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）溶解于 50 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中，制备含 0.2% PVP 的 PBS 溶液。
    注意：此处使用 PVP 是为了降低卵泡黏附于培养皿的可能性。
  2. 使用微量移液器将所有卵泡（平均约 40 个）从培养液液滴转移至 50 µL 含 0.2% PVP 的 PBS 液滴中。
  3. 通过将卵泡依次转移至新鲜的 50 µL 含 0.2% PVP 的 PBS 液滴中，清洗卵泡两次。
  4. 将卵泡转移至 285 µL 含 0.2% PVP 的 PBS 液滴中。
  5. 向 285 µL 含 0.2% PVP 的 PBS 液滴中加入 15 µL 台盼蓝，使用设定为 100 µL 的 200 µL 移液枪头轻轻混匀。
    注意：若使用 4 孔板进行台盼蓝活力检测，则向其中一个孔中加入 475 µL 含 0.2% PVP 的 PBS 和 25 µL 台盼蓝。
  6. 将卵泡在台盼蓝液滴中孵育 1 分钟，然后将其转移至 50 µL（或 500 µL 孔）含 0.2% PVP 的 PBS 液滴（或孔）中。
  7. 按照步骤 8.3 的方法，使用新鲜的 50 µL（或每孔 500 µL）含 0.2% PVP 的 PBS 液滴（或孔）清洗卵泡三次。
  8. 弃去在经过三次含 0.2% PVP 的 PBS 清洗后仍呈蓝色的卵泡，因其已无活力。三次清洗后未保留蓝色染色的卵泡为有活力的，可用于免疫荧光染色、培养或其他实验操作（图 3E）。如需长期保存，可将卵泡在液氮中速冻后于 -80 °C 保存备用。
  9. 按照步骤 9 和 10 所述方法对卵泡进行 RT-qPCR 分析和免疫荧光染色。

微藻物种的显微图像，显示细胞结构和尺寸，用于分类学研究。
图3分离卵泡及台盼蓝排斥试验 (A-C通过体视显微镜在不同放大倍数下对分离的卵泡进行成像。A初始搜索皿中夹杂于碎片间的孤立卵泡。红色圆圈标出单个卵泡。比例尺 = 2,000 µm. (B) 矿物油覆盖的卵泡冲洗液液滴中的孤立卵泡及碎片。比例尺 = 1,000 µm. (C高倍镜下无碎片的分离卵泡。比例尺 = 1,000 µm. (D使用倒置明场显微镜观察分离的卵泡。比例尺 = 100 µm. (E使用倒置明场显微镜和20倍物镜拍摄的存活（未染色）和非存活（蓝色染色）卵泡的代表性图像。比例尺 = 100 µm. 请点击此处以查看此图的放大版本。

9. RT-qPCR 分析

  1. 从有活力的卵泡（步骤8.8）中使用RNA提取试剂分离RNA（参见 材料清单）。使用 commercially available 纯化试剂盒纯化 RNA，并用 DNase 处理（参见 材料表按照制造商说明书操作。
  2. 用洗脱RNA 14 µL 加入无RNase水并使用分光光度计进行定量。RNA可在-80 °C 直至cDNA合成。
  3. 从初级卵泡和早期次级卵泡中提取等量RNA，使用市售的cDNA合成试剂盒进行cDNA合成（参见 材料表）按照制造商说明书操作。将反应混合物在5 min内孵育 25 °C 随后在60分钟内 42 °C，然后通过加热终止反应 70 °C 5 分钟。
  4. 使用合成的cDNA（每反应5 ng）和引物进行RT-qPCR表1) 使用市售的反应混合液（参见 材料表）。使用以下热循环条件：95 °C 30 s 95 °C 用于聚合酶激活，随后进行40个扩增循环，每个循环包括15秒95°C变性 95 °C 变性30秒，95℃ 60 °C 用于退火/延伸。通过定量循环阈值（Ct）值和/或琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物来分析RT-qPCR结果。
    注意：颗粒细胞标志物的转录表达 FSHR 和生殖细胞标志物 DAZL 在本研究中进行了评估。参考基因 H2A 和 ACTB.
  5. 通过将温度从 65 °C 在 0.5 °C 每5秒递增一次，直至达到 95 °C.

10. 免疫荧光分析

  1. 将存活的卵泡（来自步骤 8.8）在室温下用 100 µL 含 4% (v/v) 多聚甲醛（PFA）的液滴固定 15 分钟，随后用含 0.1% BSA 和 0.1% Tween 20 的 PBS 液滴清洗 3 次，每次 100 µL。
  2. 在室温下用封闭液（含 1x PBS 和 5% (v/v) 正常驴血清（NDS））封闭卵泡 1 小时。封闭后，将卵泡在 4 °C 下过夜孵育，使用 100 µL 含 4 µg/mL 兔抗人 CX37 抗体或 4 µg/mL 兔同型 IgG（阴性对照）的封闭液进行稀释。
  3. 用含 0.1% BSA 和 0.1% Tween 20 的 PBS 液滴清洗卵泡 3 次，每次 100 µL，然后在避光条件下室温孵育 1 小时，使用 100 µL 含 2 µg/mL 驴抗兔 AlexaFluor 488 二抗的封闭液进行稀释。
  4. 在避光条件下室温孵育 5 分钟，使用 100 µL 含 1 µg/mL Hoechst 33342 的封闭液稀释液标记 DNA。
  5. 将卵泡转移至载玻片上的 5 µL 封片剂液滴中（见材料表），盖上盖玻片。将载玻片在室温下静置过夜使其固化，随后用指甲油封片。成像前储存在 4 °C。
  6. 在盖上盖玻片后 48 小时内对所有载玻片进行成像。使用倒置落射荧光显微镜（见材料表），在 DAPI（激发波长 380 nm，发射波长 450 nm）和 FITC（激发波长 470 nm，发射波长 525 nm）滤光片下进行成像。
  7. 为两个通道固定曝光时间。根据兔同型阴性对照调整 FITC（CX37）通道的曝光时间。使用 20x 物镜，并将 DAPI 通道的曝光时间设为 50 ms，以识别标记了兔同型抗体的卵泡。
  8. 在 FITC 通道下对这些卵泡进行成像，并逐步降低曝光时间，直至所有背景绿色信号完全消除。记录此曝光时间。
  9. 使用为同型对照 FITC 通道设定的曝光时间，以及 DAPI 通道 50 ms 的曝光时间，对所有 CX37 抗体标记的卵泡进行成像。
  10. 使用计算机图像处理程序29（见材料表）处理信号强度，该强度通过阈值化后的平均灰度值进行测量。
    1. 调整每个卵泡 DAPI 图像的 tiff 文件，使整个卵泡轮廓清晰。使用程序中的分析颗粒功能，将整个卵泡选为感兴趣区域（ROI）。
    2. 打开相应卵泡的 FITC 图像 tiff 文件，并将从 DAPI 图像生成的 ROI 叠加到 FITC 图像上。使用程序中的测量功能，量化 FITC 图像的平均灰度值，该值代表信号强度。

结果

概述与关键步骤
通过本方案，可从单个牛卵巢中稳定地分离出实验所需数量的小型前腔卵泡。在总共30次重复实验中，每次平均获得41个卵泡，范围为11至135个卵泡（图4A）。在14次重复中，根据先前描述的方法26，在体视显微镜下使用1 µm显微测微尺测量卵泡直径，对卵泡的发育阶段进行分类。采用该方法，共对476个卵泡进行了分类，分别为初级卵泡（直径40–79 µm）、早期次级卵泡（80–119 µm）或次级卵泡（≥120 µm）（图4B）。由于采用了40 µm的过滤步骤，原始卵泡被排除在外。卵泡活力采用台盼蓝排斥法进行评估，方法如前所述30。分离后的卵泡在含0.2% PVP的PBS中，短暂孵育于0.05%（v/v）台盼蓝溶液1分钟，随后用PBS + PVP洗涤三次，并在体视显微镜下观察。根据所述操作，所有重复实验中分离得到的卵泡活力均为100%。总体而言，从卵巢采集到开始在培养皿中搜寻卵泡之前的机械分离过程，大约需要30–45分钟。搜寻与鉴定卵泡所需时间不超过30分钟，因此每枚卵巢的总处理时间约为1–1.25小时。

本方案最关键的步骤是确保卵巢组织被充分匀浆。将匀浆时间从5分钟延长至6分钟，可显著提高分离得到的卵泡数量（P < 0.05）。在30次实验中，采用6分钟匀浆时间，平均每枚卵巢可分离出41个卵泡，相比22次实验中采用5分钟匀浆时间所获得的平均每枚卵巢13.8个卵泡，数量接近增至三倍（图5）。另一个重要步骤是匀浆速度，必须控制在9,000–11,000 rpm范围内。过高的转速会导致得率下降，推测是由于卵泡受到过度损伤和/或破裂所致。在过滤步骤之后，可通过多次使用带橡胶球的玻璃巴斯德移液管吹打搜寻皿中的内容物，进一步提高卵泡的分离效果。利用巴斯德移液管可使卵泡从碎片中解离出来，从而在培养皿中观察到更多的卵泡。

如果卵泡在分离后需要进行培养，则必须尽量减少微生物污染。可通过修剪完整卵巢上的多余结缔组织和脂肪，并随后进行一系列洗涤步骤来防止污染。修剪后的卵巢应先在70%乙醇中短暂清洗，以降低微生物载量，随后用温热（38.5 °C）的PBS + PenStrep溶液多次洗涤，以去除残留的70%乙醇并进一步清除潜在的微生物。这些洗涤步骤不会影响卵泡的活力。为进一步防止污染，可将整个分离操作在生物安全柜或洁净工作台内使用灭菌器械进行。

RNA 提取与 RT-qPCR
将相同发育阶段且来自不同分离批次的卵泡合并，共使用 46 个初级卵泡和 34 个早期次级卵泡用于 mRNA 表达分析。从合并的卵泡中提取 RNA（初级卵泡 = 总 RNA 259 ng，早期次级卵泡 = 总 RNA 91 ng），并用于 cDNA 合成。随后通过 RT-qPCR 检测卵泡中颗粒细胞标志物 FSHR19 和生殖细胞标志物 DAZL 的转录表达。结果如预期所示，初级卵泡和早期次级卵泡均表达 FSHR 和 DAZL 转录本，这与既往在人卵泡中的研究报道一致31，同时证实 FSHR 在牛卵泡发育的初级阶段即已表达32（图 6A、B）。

连接蛋白37的免疫荧光定位
卵泡整体中可进行蛋白质的免疫荧光定位。本文利用该技术对分离得到的初级和早期次级卵泡阶段的窦前卵泡中缝隙连接蛋白Connexin 37（CX37）进行定位。CX37在卵母细胞与卵泡颗粒细胞之间的细胞通讯中具有关键作用，在牛卵泡发育各阶段的组织学分析中，已在上述两种细胞类型中均检测到该蛋白的表达。33台盼蓝排斥试验后，将存活的卵泡用PFA固定，与兔抗人CX37抗体或兔同型IgG（阴性对照）孵育，随后与驴抗兔AlexaFluor 488二抗孵育。使用Hoechst 33342标记DNA。利用倒置落射荧光显微镜在DAPI和FITC滤光片下对卵泡进行成像，并对信号强度进行定量。CX37被发现定位于卵质中，但明显不分布于卵母细胞核内，同时定位于颗粒细胞的细胞膜上图7）。这些结果与CX37定位于卵母细胞及颗粒细胞膜的已知特性一致33细胞通讯和卵泡生长关键蛋白（如 CX37（如图所示）和 FSHR）的免疫定位32 是研究前腔卵泡发育、干预措施对卵泡生长、结构和质量的影响，以及通过比较评估培养效果的重要工具 体内-获得并 体外-培养的卵泡。

基因正向序列 (5'-3')反向序列 (5'-3')产物大小 (bp)
FSHRCCC AAC TCG ATG AGC TGA ATC TCAT AGC TAG GCA GGG AAC GG132
DAZLGCC CAC AAA AGA AAT CTG TGG AACT TAA GCA CTG CCC GAC TT156
H2AGAG GAG CTG AAC AAG CTG TTGTTG TGG TGG CTC TCA GTC TTC104
ACTBCTC TTC CAG CCT TCC TTC CTGGG CAG TGA TCT CTT TCT GC178

表1：用于RT-qPCR的引物列表。

卵泡分离，柱状图；重复研究，饼图；类别分析：初级、次级类型。
图 4：分离获得的前腔卵泡数量及其发育阶段。（A）采用6分钟组织匀浆法，每次重复实验所分离得到的前腔卵泡总数（n = 30次重复实验）。红色线条表示卵泡平均数量。（B）在14次重复实验中记录了分离卵泡的发育阶段。饼图显示了各发育阶段卵泡占总分离卵泡数的比例（n = 476）。请点击此处查看该图的放大版本。

不同匀浆时间下卵泡分离的箱线图，显示数据方差。
图5：5分钟与6分钟匀浆时间的比较。 卵巢皮质在相同转速下匀浆6分钟所获得的前窦卵泡数量显著多于匀浆5分钟（5分钟组n = 22次重复，6分钟组n = 30次重复；P < 0.01）。请点击此处查看该图的放大版本。

显示不同卵泡阶段中 DAZL、FSHR、H2A 和 ACTB 基因表达水平的 PCR 结果。
图 6：分离的前窦卵泡中转录本的反转录定量 PCR 分析。 初级和早期次级前窦卵泡表达了颗粒细胞标志物（FSHR）、生殖细胞标志物（DAZL）以及参考基因（H2A 和 ACTB）的 mRNA 转录本。(A) 各基因 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳图，显示相应的碱基对（bp）产物大小。(B) FSHR 和 DAZL 转录本的表达水平相对于参考基因 ACTB 进行定量。NTC = 无模板对照，CT = 循环阈值。请点击此处查看该图的放大版本。

CX37 荧光强度分析的荧光显微镜图像；初级与早期次级卵泡对比图。
图 7：分离的前窦卵泡中 CX37 的免疫荧光定位。 牛前窦卵泡中初级（A）和早期次级（B）阶段 CX37 免疫定位的代表性图像。（C）早期次级牛前窦卵泡中兔同型对照染色的代表性图像。左图：DNA 染色（DAPI）；中图：兔抗人 CX37 一抗染色（FITC）；右图：DAPI 与 FITC 叠加图像。比例尺 = 50 µm。（D）根据卵泡发育阶段测定的平均 CX37 信号强度（n = 21 个初级卵泡和 11 个早期次级卵泡，两个重复实验）。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本方案详细描述了一种可重复的方法，用于从牛卵巢中分离早期前腔卵泡，特别是初级和早期次级阶段的卵泡。该方案在既往研究20,25,30,34,35,36的基础上进行了优化，能够从单个卵巢中分离出数量可观的卵泡。采用此方法分离得到的前腔卵泡具有活性，可用于后续实验，如蛋白质免疫定位分析以及RNA提取以进行基因表达研究。本研究未尝试对分离的卵泡进行培养。然而，目前正在进行相关研究，旨在实现小牛前腔卵泡的长期体外培养。这一后续应用将有助于深入理解卵巢卵泡发生过程、开展毒理学检测，并探索卵泡操控以实现生育力保存的有效策略。

这些实验的数据表明，6分钟的匀浆对于卵巢皮质组织的充分分散和卵泡释放至关重要（图4）。有助于组织充分匀浆的其他步骤包括：将皮质与髓质初步分离，以确保皮质具有合适的厚度（约1 mm）；去除多余的结缔组织；以及将皮质切成小片段。这些操作可防止匀浆探头堵塞，并减少搜索皿中的不必要的碎片。细胞筛网的孔径大小对于排除碎片以及不符合目标大小和发育阶段的卵泡非常重要；在本实验方案中，最后一步是收集通过40 µm细胞筛网的组分，从而排除原始卵泡，因为在牛中原始卵泡的直径通常<40 µm26。最后，建议使用巴斯德移液管将卵泡从搜索皿中的碎片中分离，而不是尝试手动从碎片中解剖卵泡，因为后一种技术需要更高的操作技巧，且若操作不当可能损伤卵泡。

尽管本方案相较于现有方法有所改进，但仍存在必须考虑的局限性。首先，由于卵巢卵泡群体具有异质性15，且获取卵巢的动物来源史未知，因此在执行本方案后分离得到的卵泡数量差异较大。其中一个必须考虑的因素是动物年龄，因为已知卵巢储备会随年龄增长而下降37。

从牛卵巢中分离小的前腔卵泡为在单一样本水平上研究基础科学问题提供了机会，而这种方法在此前难以实现。例如，本研究评估的所有前腔卵泡阶段均表现出CX37的表达，该蛋白对于卵母细胞与颗粒细胞之间的通讯至关重要。同样，既往研究已证实促卵泡激素（FSH）受体在单独分离的前腔卵泡中存在表达。32. 颗粒细胞的其他特异性标志物，如类固醇生成酶 CYP17 和 CYP1938，将作为前腔卵泡基因/蛋白表达谱的相关补充内容，并成为未来研究项目的方向。对整个卵泡结构的可视化观察 通过 与组织学检查相比，常规或共聚焦显微镜观察更为全面，因为组织学检查一次只能分析毛囊的一个片段。这一优势在可能需要利用免疫染色的研究中尤为显著。 原位 杂交，适用于需要详细表达空间定位的情况。此外，还可利用敏感的试剂盒对分离的前腔卵泡进行RT-qPCR分析，以研究单个卵泡的基因表达30单独分析卵泡且不受卵巢环境影响的能力，是理解前腔卵泡发生复杂性的关键进步。

卵巢皮质组织的冷冻保存已成为保护雌性哺乳动物生育力的一种有前景的技术39，包括女性40利用原始卵泡进行生育力的保存与恢复，是一种颇具吸引力的辅助生殖技术，也是研究卵泡发生过程的一种很有前景的方法。41冻融后，该组织可采用本分离方案以获取有活力的原始卵泡。尽管本方案从先前冷冻保存的组织中回收卵泡的潜在能力尚未被专门评估，但已有其他研究证实其可行性，并成功利用从冻融组织中分离出的有活力的小原始卵泡进行后续实验 体外 培养42,43,44,45此外，新分离的窦前卵泡可进行单个冷冻保存 通过 玻璃化并保持结构完整性36.

目前文献中尚缺乏关于如何高效分离牛等大型哺乳动物原始卵泡的详细信息。此外，由于可重复性差一直是该领域的瓶颈，因此迫切需要一份直观且详尽的牛原始卵泡分离操作指南。最近，Bus 等人36描述了一种采用机械法分离牛原始卵泡的方法，平均每枚卵巢可获得 6.1 个初级卵泡。而本文所述的机械分离方法平均每枚卵巢可分离出 41 个原始卵泡，其中大多数处于初级阶段。因此，该技术特别适用于以初级卵泡生理学和发育过程为研究重点的研究。初级卵泡代表了生长卵泡池的初始阶段，在卵巢皮质中数量丰富。因此，本方法针对该发育阶段进行了优化，具有新颖性，有助于充分利用卵巢储备，同时避免对更难操作的始基卵泡进行处理。分离初级卵泡的另一优势在于，可将卵巢组织培养用于始基卵泡的初始激活，随后分离初级卵泡进行进一步培养。鉴于目前对数量更丰富的初级阶段卵泡体外培养的兴趣日益增加，本文所介绍的方法可激励研究人员探索此前因初级卵泡分离困难而回避的研究方向。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本项目部分由美国农业部多州项目 W4112 和加州大学戴维斯分校 Jastro Shields 奖学金资助，授予 SM。

作者谨向 Central Valley Meat, Inc. 致以诚挚谢意，感谢其提供本研究所用实验中的牛卵巢。作者同时感谢 Olivia Silvera 在卵巢处理及卵泡分离过程中提供的协助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
5-3/4" 一次性苏打石灰玻璃巴斯德吸管Duran Wheaton Kimble63A54在培养皿中搜寻时，可用于将卵泡从碎片中分离的巴斯德吸管
16% 多聚甲醛Electron Microscopy Sciences15710稀释至4%；用于卵泡免疫染色前的固定
20 mL 鲁尔锁注射器Fisher ScientificZ116882-100EA与18 G针头配合使用，用于从40 μm 细胞筛中分离卵泡
#21 无菌手术刀片Fisher Scientific50-365-023用于切割卵巢并去除髓质
40 μm 细胞筛Fisher Scientific 22-363-547用于过滤来自300 μm 细胞筛的滤液
104 mm 塑料漏斗Fisher Scientific10-348C尺寸可变，但需确保纱布裁剪合适，且卵巢匀浆液不会溢出
300 μm 细胞筛pluriSelect 43-50300-03用于过滤来自纱布的滤液 
500 mL 锥形瓶Fisher ScientificFB500500漏斗和锥形瓶用于承接来自纱布的滤液 
Air-Tite 18 G 无菌针头Thermo Fisher Scientific14-817-15118 G 针头可提供足够压力，将卵泡从40 μm 细胞筛中分离
Air-Tite 27 G 13 mm 无菌针头Fisher Scientific14-817-171可用于处理困住卵泡的碎片
BD Hoechst 33342 溶液Fisher ScientificBDB561908荧光DNA染料
牛血清白蛋白 (BSA)Sigma-AldrichA7030-100G 卵泡洗涤培养基的组分
纱布Electron Microscopy Sciences71748-00卵巢匀浆液的初步过滤步骤，用于去除大块组织碎片
经典双刃安全剃须刀片Wilkinson SwordN/A适用于McIlwain组织切片机且不易快速变钝的刀片
驴抗兔二抗，Alexa Fluor 488 标记Fisher ScientificA-21206免疫染色用二抗
Eisco 乳胶吸头Fisher ScientificS29388与巴斯德吸管配合使用的橡胶吸头
HEPES 缓冲液Sigma-AldrichH3375卵泡洗涤培养基的组分
匀浆器VWR10032-336用于匀浆卵巢组织以释放卵泡 
ImageJ/FijiNIHv2.3.1用于荧光免疫定位分析的软件
McIlwain 组织切片机Ted Pella10184用于将卵巢组织切成适合匀浆的小块
显微镜 - 体视镜OlympusSZX2-ILLT用于在滤液中搜寻和采集卵泡的解剖显微镜
显微镜 - 倒置显微镜NikonDiaphot 300用于高倍明场观察分离的卵泡
显微镜 - 倒置显微镜ECHORevolve R4用于高倍明场和落射荧光观察分离的卵泡
矿物油Sigma-AldrichM8410-1L覆盖卵泡洗涤液滴以防止在搜寻过程中蒸发
非必需氨基酸 (NEAA)Gibco11140-050卵泡洗涤培养基的组分
正常驴血清Jackson ImmunoResearch017-000-001免疫染色封闭缓冲液的试剂
Nunc 4孔培养皿（用于体外受精）Thermo Fisher Scientific144444用于卵泡分离和洗涤的4孔培养皿
青霉素-链霉素溶液（100倍浓缩）Gibco15-140-122卵泡洗涤培养基的组分
培养皿（外径60 mm × 高13.7 mm）Ted Pella10184-04最适合放入McIlwain组织切片机的培养皿
磷酸盐缓冲盐水 (PBS)Fisher ScientificBP665-1卵巢和卵泡的洗涤缓冲液
塑料切板Fisher Scientific09-002-24A尺寸足够、可安全切割卵巢的切板
聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)Fisher ScientificBP431-100向PBS中添加PVP（0.1% w/v）可防止卵泡粘附于培养皿或彼此粘连 
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂Thermo Fisher ScientificP36930荧光标记细胞或组织的封片介质
Qiagen RNeasy 微量试剂盒Qiagen74004RNA柱纯化试剂盒
RThe R Foundationv4.1.2统计分析软件
兔抗人Cx37/GJA4多克隆抗体Abcamab181701用于免疫染色的Cx37一抗
RevertAid RT反转录试剂盒Thermo Fisher ScientificK1691cDNA合成试剂盒
RstudioRStudio, PBCv2021.09.2统计分析软件
氢氧化钠溶液 (1N/认证)Fisher ScientificSS266-1用于将培养基pH调至7.6–7.8
丙酮酸钠 (NaPyr)Gibco11360-070卵泡洗涤培养基的组分
方形培养皿 100 mm × 15 mm Thermo Fisher Scientific60872-310带网格的培养皿有助于更高效地识别卵泡 
SsoAdvanced Universal SYBR Green SupermixBioRad1725271PCR反应用预混液
Steritop 螺口瓶顶滤器Sigma-AldrichS2GPT02RE用于卵泡洗涤培养基的灭菌
SYBR-safe DNA凝胶染料Thermo Fisher ScientificS33102用于在琼脂糖凝胶上显色PCR产物
含Hank’s盐的TCM199培养基Gibco12-350-039卵泡洗涤培养基的组分
吐温X-100Fisher ScientificBP151-100免疫染色通透缓冲液用去垢剂
Trizol试剂Thermo Fisher Scientific15596026RNA提取试剂
台盼蓝溶液，0.4%Gibco15-250-061用于检测分离卵泡的活力
吐温20免疫染色洗涤缓冲液用去垢剂
通用加热板WTA20931加热板，用于在显微镜下搜寻时保持卵泡温度为38.5 °C
Wiretrol II 校准微量移液管Drummond50002-005用于操作卵泡的玻璃微量移液管

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