推进原始卵泡发育的研究需要从单个卵巢中高效分离卵泡的方法。本文介绍了一种利用组织切片机和匀浆器从牛卵巢中分离卵泡的简化机械法。该方法可从单个卵巢中收集大量具有活性的原始卵泡。
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本文内容
摘要
摘要
了解哺乳动物卵泡发生全过程对于提高家畜、人类以及濒危物种的辅助生殖技术至关重要。由于难以分离较小的前窦卵泡，尤其是大型哺乳动物（如牛）中的前窦卵泡，相关研究大多局限于窦状卵泡和较大的前窦卵泡。本研究提出一种高效方法，可从单个牛卵巢中获取大量小型前窦卵泡。将单个牛卵巢皮质使用组织切片器切成500 µm的立方体，随后用10 mm探头在9,000–11,000 rpm条件下匀浆处理6分钟。先用纱布去除匀浆液中的大块碎片，再依次通过300 µm和40 µm细胞筛进行连续过滤。将截留在40 µm筛网上的物质冲洗至搜索皿中，在显微镜下识别并将其卵泡收集至液滴培养基中。对所收集卵泡的活力进行检测 通过 台盼蓝染色。该方法可在约90分钟内从单个牛卵巢中分离出大量有活力的小型前腔卵泡。重要的是，该方法完全采用机械方式，避免使用可能损伤卵泡的酶来解离组织。通过本方案获得的卵泡可用于后续应用，如提取RNA用于RT-qPCR、特定蛋白质的免疫定位等。 体外 培养
引言
卵巢卵泡是卵巢的功能单位，负责配子（卵母细胞）的产生以及对生殖功能和整体健康至关重要的激素分泌。原始卵泡在胎儿发育期或出生后早期（取决于物种）于卵巢中形成1，并构成了女性的卵巢储备。卵泡生长始于原始卵泡的激活，这些卵泡离开静止池并进入生长期。卵泡发生中的前窦状卵泡阶段（即窦状卵泡形成之前的所有卵泡阶段）是一个高度动态的过程，需要卵母细胞及其周围颗粒细胞在形态和代谢上的同步变化，这一过程由这两类细胞之间的紧密通讯所驱动2,3。前窦状卵泡在任一时间点均占卵巢中卵泡单位的大多数4。据估计，卵泡发生过程中前窦状阶段的发育时间比窦状卵泡阶段长约数周5,6，这段时期对于卵母细胞和体细胞获得足够的成熟度以进入最终发育阶段（即窦状卵泡阶段），并为排卵、受精及胚胎发育做好准备至关重要7,8,9。
目前关于卵巢前腔卵泡发生的大部分知识来源于小鼠模型1....
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方案
牛（Bos taurus）卵巢取自当地屠宰场，并在采集后6小时内运送到实验室。由于该设施处理的动物数量众多，动物的年龄、品种以及动情周期阶段均不明确。由于本实验未使用活体动物，无需经过批准的动物护理与使用方案。
1. 仪器与试剂的准备
- 在实验台上用实验台纸覆盖约60厘米宽的区域。
- 准备以下器材：手术刀柄、无菌手术刀片、止血钳、解剖镊子一副、20 mL鲁尔锁型注射器、18号针头、200 mL烧杯两个、500 mL锥形瓶、直径104 mm的塑料漏斗、塑料切板、每处理一个卵巢需准备一层22 cm2的纱布（纱布可在使用前通过高压灭菌进行消毒）、300 µm细胞筛和40 µm细胞筛（参见材料表）。
- 将所有器材放置于实验台纸上。
- 使用止血钳将手术刀片安装到手术刀柄上。将刀片的斜面底部对准刀柄上的斜面标记，然后将刀片滑入刀柄的凹槽中。
- 将漏斗放入锥形瓶中，并用纱布覆盖漏斗开口。
- 每处理一个卵巢，准备一个50 mL离心管，并将其置于设定为38.5 °C的水浴或金属珠浴中。
- 每处理一个卵巢，准备一个100 mm × 15 mm的方形培养皿，并将其置于设定为38.5 °C的载玻片加热器上。
- 向1 L的1×磷酸盐缓冲液（PBS）中....
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结果
概述与关键步骤
通过本方案，可从单个牛卵巢中稳定地分离出实验所需数量的小型前腔卵泡。在总共30次重复实验中，每次平均获得41个卵泡，范围为11至135个卵泡（图4A）。在14次重复中，根据先前描述的方法26，在体视显微镜下使用1 µm显微测微尺测量卵泡直径，对卵泡的发育阶段进行分类。采用该方法，共对476个卵泡进行了分类，分别为初级卵泡（直径40–79 µm）、早期次级卵泡（80–119 µm）或次级卵泡（≥120 µm）（图4B）。由于采用了40 µm的过滤步骤，原始卵泡被排除在外。卵泡活力采用台盼蓝排斥法进行评估，方法如前所述30。分离后的卵泡在含0.2% PVP的PBS中，短暂孵育于0.05%（v/v）台盼蓝溶液1分钟，随后用PBS + PVP洗涤三次，并在体视显微镜下观察。根据所述操作，所有重复实验中分离得到的卵泡活力均为100%。总体而言，从卵巢采集到开始在培养皿中搜寻卵泡.......
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讨论
本方案详细描述了一种可重复的方法，用于从牛卵巢中分离早期前腔卵泡，特别是初级和早期次级阶段的卵泡。该方案在既往研究20,25,30,34,35,36的基础上进行了优化，能够从单个卵巢中分离出数量可观的卵泡。采用此方法分离得到的前腔卵泡具有活性，可用于后续实验，如蛋白质免疫定位分析以及RNA提取以进行基因表达研究。本研究未尝试对分离的卵泡进行培养。然而，目前正在进行相关研究，旨在实现小牛前腔卵泡的长期体外培养。这一后续应用将有助于深入理解卵巢卵泡发生过程、开展毒理学检测，并探索卵泡操控以实现生育力保存的有效策略。
这些实验的数据表明，6分钟的匀浆对于卵巢皮质组织的充分分散和卵泡释放至关重要（<.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本项目部分由美国农业部多州项目 W4112 和加州大学戴维斯分校 Jastro Shields 奖学金资助，授予 SM。
作者谨向 Central Valley Meat, Inc. 致以诚挚谢意，感谢其提供本研究所用实验中的牛卵巢。作者同时感谢 Olivia Silvera 在卵巢处理及卵泡分离过程中提供的协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 5-3/4" 一次性苏打石灰玻璃巴斯德吸管 | Duran Wheaton Kimble | 63A54 | 在培养皿中搜寻时，可用于将卵泡从碎片中分离的巴斯德吸管 |
| 16% 多聚甲醛 | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 稀释至4%；用于卵泡免疫染色前的固定 |
| 20 mL 鲁尔锁注射器 | Fisher Scientific | Z116882-100EA | 与18 G针头配合使用，用于从40 μm 细胞筛中分离卵泡 |
| #21 无菌手术刀片 | Fisher Scientific | 50-365-023 | 用于切割卵巢并去除髓质 |
| 40 μm 细胞筛 | Fisher Scientific | 22-363-547 | 用于过滤来自300 μm 细胞筛的滤液 |
| 104 mm 塑料漏斗 | Fisher Scientific | 10-348C | 尺寸可变，但需确保纱布裁剪合适，且卵巢匀浆液不会溢出 |
| 300 μm 细胞筛 | pluriSelect | 43-50300-03 | 用于过滤来自纱布的滤液 |
| 500 mL 锥形瓶 | Fisher Scientific | FB500500 | 漏斗和锥形瓶用于承接来自纱布的滤液 |
| Air-Tite 18 G 无菌针头 | Thermo Fisher Scientific | 14-817-151 | 18 G 针头可提供足够压力，将卵泡从40 μm 细胞筛中分离 |
| Air-Tite 27 G 13 mm 无菌针头 | Fisher Scientific | 14-817-171 | 可用于处理困住卵泡的碎片 |
| BD Hoechst 33342 溶液 | Fisher Scientific | BDB561908 | 荧光DNA染料 |
| 牛血清白蛋白 (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030-100G | 卵泡洗涤培养基的组分 |
| 纱布 | Electron Microscopy Sciences | 71748-00 | 卵巢匀浆液的初步过滤步骤，用于去除大块组织碎片 |
| 经典双刃安全剃须刀片 | Wilkinson Sword | N/A | 适用于McIlwain组织切片机且不易快速变钝的刀片 |
| 驴抗兔二抗，Alexa Fluor 488 标记 | Fisher Scientific | A-21206 | 免疫染色用二抗 |
| Eisco 乳胶吸头 | Fisher Scientific | S29388 | 与巴斯德吸管配合使用的橡胶吸头 |
| HEPES 缓冲液 | Sigma-Aldrich | H3375 | 卵泡洗涤培养基的组分 |
| 匀浆器 | VWR | 10032-336 | 用于匀浆卵巢组织以释放卵泡 |
| ImageJ/Fiji | NIH | v2.3.1 | 用于荧光免疫定位分析的软件 |
| McIlwain 组织切片机 | Ted Pella | 10184 | 用于将卵巢组织切成适合匀浆的小块 |
| 显微镜 - 体视镜 | Olympus | SZX2-ILLT | 用于在滤液中搜寻和采集卵泡的解剖显微镜 |
| 显微镜 - 倒置显微镜 | Nikon | Diaphot 300 | 用于高倍明场观察分离的卵泡 |
| 显微镜 - 倒置显微镜 | ECHO | Revolve R4 | 用于高倍明场和落射荧光观察分离的卵泡 |
| 矿物油 | Sigma-Aldrich | M8410-1L | 覆盖卵泡洗涤液滴以防止在搜寻过程中蒸发 |
| 非必需氨基酸 (NEAA) | Gibco | 11140-050 | 卵泡洗涤培养基的组分 |
| 正常驴血清 | Jackson ImmunoResearch | 017-000-001 | 免疫染色封闭缓冲液的试剂 |
| Nunc 4孔培养皿（用于体外受精） | Thermo Fisher Scientific | 144444 | 用于卵泡分离和洗涤的4孔培养皿 |
| 青霉素-链霉素溶液（100倍浓缩） | Gibco | 15-140-122 | 卵泡洗涤培养基的组分 |
| 培养皿（外径60 mm × 高13.7 mm） | Ted Pella | 10184-04 | 最适合放入McIlwain组织切片机的培养皿 |
| 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) | Fisher Scientific | BP665-1 | 卵巢和卵泡的洗涤缓冲液 |
| 塑料切板 | Fisher Scientific | 09-002-24A | 尺寸足够、可安全切割卵巢的切板 |
| 聚乙烯吡咯烷酮 (PVP) | Fisher Scientific | BP431-100 | 向PBS中添加PVP（0.1% w/v）可防止卵泡粘附于培养皿或彼此粘连 |
| ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂 | Thermo Fisher Scientific | P36930 | 荧光标记细胞或组织的封片介质 |
| Qiagen RNeasy 微量试剂盒 | Qiagen | 74004 | RNA柱纯化试剂盒 |
| R | The R Foundation | v4.1.2 | 统计分析软件 |
| 兔抗人Cx37/GJA4多克隆抗体 | Abcam | ab181701 | 用于免疫染色的Cx37一抗 |
| RevertAid RT反转录试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | K1691 | cDNA合成试剂盒 |
| Rstudio | RStudio, PBC | v2021.09.2 | 统计分析软件 |
| 氢氧化钠溶液 (1N/认证) | Fisher Scientific | SS266-1 | 用于将培养基pH调至7.6–7.8 |
| 丙酮酸钠 (NaPyr) | Gibco | 11360-070 | 卵泡洗涤培养基的组分 |
| 方形培养皿 100 mm × 15 mm | Thermo Fisher Scientific | 60872-310 | 带网格的培养皿有助于更高效地识别卵泡 |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 1725271 | PCR反应用预混液 |
| Steritop 螺口瓶顶滤器 | Sigma-Aldrich | S2GPT02RE | 用于卵泡洗涤培养基的灭菌 |
| SYBR-safe DNA凝胶染料 | Thermo Fisher Scientific | S33102 | 用于在琼脂糖凝胶上显色PCR产物 |
| 含Hank’s盐的TCM199培养基 | Gibco | 12-350-039 | 卵泡洗涤培养基的组分 |
| 吐温X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | 免疫染色通透缓冲液用去垢剂 |
| Trizol试剂 | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | RNA提取试剂 |
| 台盼蓝溶液，0.4% | Gibco | 15-250-061 | 用于检测分离卵泡的活力 |
| 吐温20 | 免疫染色洗涤缓冲液用去垢剂 | ||
| 通用加热板 | WTA | 20931 | 加热板，用于在显微镜下搜寻时保持卵泡温度为38.5 °C |
| Wiretrol II 校准微量移液管 | Drummond | 50002-005 | 用于操作卵泡的玻璃微量移液管 |
参考文献
- Fortune, J. E., Yang, M. Y., Allen, J. J., Herrick, S. L. Triennial reproduction symposium: The ovarian follicular reserve in cattle: What regulates its formation and size. Journal of Animal Science. 91 (7), 3041-3050 (2013).
- Fair, T., Hulshof, S. C., Hyttel, P., Greve, T., Boland, M.
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