一种基于可溶性四氮唑还原反应的检测方法，用于评估抗体的作用效果 Candida tropicalis 生物膜

摘要

本文描述了一种基于96孔微孔板的实验方案，利用2,3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基)-5-羧基苯胺-2H-四唑（XTT）还原法检测抗体对C. tropicalis形成生物膜的影响。体外实验方案可用于检测潜在新型抗真菌化合物对Candida物种生物膜中细胞代谢活性的作用。

摘要

Candida 属是引起全身性医院内感染的第四大常见病因。全身性或侵袭性念珠菌病常涉及在植入装置或导管上形成生物膜，这与毒力增强和死亡率升高相关。不同 Candida 物种产生的生物膜对多种抗真菌药物表现出更强的耐药性。因此，亟需开发针对 Candida 生物膜的有效免疫疗法或辅助治疗手段。尽管细胞免疫在抗 Candida 防御中的作用已得到充分证实，但体液免疫的作用研究相对较少。

已有假说认为，抑制生物膜的形成与成熟是保护性抗体的主要功能之一， 白色念珠菌 菌丝管抗体（CAGTA）已被证明具有抑制作用 体外 生长与生物膜形成 C. albicans 较早前。本文概述了一种详细方案，用于评估抗体在由以下病原体形成的生物膜中的作用 C. tropicalis 本方案的方法学包括 C. tropicalis 在96孔微量滴定板中形成生物膜，随后在存在或不存在抗原特异性抗体的条件下进行孵育，然后采用2,3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基)-5-羧基酰胺-2H-四唑氮盐（XTT）检测法测定生物膜中真菌细胞的代谢活性。

通过使用适当的血清对照（包括Sap2特异性抗体耗竭血清）验证了特异性。结果表明，免疫动物血清中存在的抗体能够抑制 假丝酵母 生物膜成熟 体外总之，本文为抗体在侵袭性念珠菌病期间针对生物膜开发新型免疫疗法以及协同或辅助治疗方面的潜力提供了重要的见解。 体外 该方案可用于检测潜在新型抗真菌化合物对真菌代谢活性的影响 假丝酵母 生物膜中的物种细胞。

引言

系统性念珠菌病是全球医院内感染的第四大主要原因，与较高的发病率和死亡率相关。全球范围内，系统性念珠菌病影响约700,000人¹. 假丝酵母 物种，即 C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata， 和 C. auris最常见的侵入性病因 假丝酵母 感染². 假丝酵母 物种是能够形成生物膜的机会性病原体³生物膜主要与 假丝酵母 毒力，以及 假丝酵母 可通过诱导生物膜形成来耐受氧化和渗透胁迫条件⁴生物膜进一步调控毒力因子和细胞壁组分的表达，并形成一种胞外多糖保护基质，有助于 假丝酵母 以适应不同的宿主生态位⁴生物膜促进酵母在宿主组织和医疗器械表面的黏附⁵因此，生物膜的形成使酵母菌获得优势，因为生物膜内的酵母细胞能够逃逸宿主的免疫应答。⁶生物膜的形成还能使致病性酵母菌免受抗真菌药物的作用。⁵. 感染易感性降低 C. albicans Pierce 等人已证实生物膜对两性霉素 B 的耐药性。^7,8此外，生物膜对氟康唑表现出抗真菌药物耐药性，这妨碍了系统性念珠菌病的有效治疗。^9,10.

微生物具有附着于各种生物性和非生物性表面的固有倾向，从而导致生物膜的形成。 白色念珠菌， 是一种双相型真菌，以酵母相和菌丝相形式存在， 及其生物膜形成的特性已在多种情况下被表征 体外 和 体内 模型系统¹¹生物膜形成的步骤包括黏附 假丝酵母 细胞对基质的黏附、菌丝形成、增殖及生物膜成熟¹¹最初，酵母形态的 白色念珠菌 黏附于基质（包括医疗器械和人体组织），随后发生菌丝形成和增殖 C. albicans 形成菌丝和假菌丝结构，最终成熟为包埋于胞外基质中的生物膜¹¹生物膜形成在很大程度上促进了 C. albicans 致病机制¹². 假丝酵母 物种形成耐药性生物膜，使其根除极具挑战性¹³一小部分 C. albicans 产生物膜的菌群被描述为对两性霉素B和氯己定等抗真菌药物具有高度耐药性¹⁴值得注意的是，与浮游阶段和增殖阶段的酵母细胞相比，生物膜中的酵母细胞对多种药物治疗具有高度耐药性。¹⁴有研究表明，存在于生物膜中的酵母细胞对抗真菌药物具有高度耐受性，这导致了 C. albicans 生物膜中的存活¹⁴据报道，这些现有细胞是表型变异体 C. albicans 而非突变体¹⁴此外，细胞的 假丝酵母 称为生物膜 "持留细胞" 对高剂量两性霉素B治疗具有耐受性，并有助于 假丝酵母 生存，从而导致反复全身性疾病的巨大负担 假丝酵母 高危人群中的感染¹⁵.

抗真菌药物耐药性增加的问题日益严重 白色念珠菌 菌株的出现 necessitates 寻找新的抗真菌药物和免疫疗法。从上述研究中可以明显看出， 假丝酵母 生物膜对抗真菌药物的敏感性降低，因此需要改进免疫疗法以控制 假丝酵母 生物膜形成。早期研究表明，CAGTA 能够对全身性感染提供有效保护 假丝酵母 通过抑制感染 C. albicans 生物膜形成 体外¹⁶另一项研究报道，用 C. albicans rAls3-N蛋白可诱导产生高滴度抗体，从而干扰 C. albicans 生物膜形成 体外¹⁷. 抗 Als3-N 抗体也对……产生了抑制作用 C. albicans 生物膜的扩散¹⁷基于NDV-3A的疫苗 C. albicans 目前正处于临床试验阶段，且已发现抗NDV-3A血清也可降低 C. auris 生物膜形成¹⁸最近一项研究发现，在系统性念珠菌病的小鼠模型中，Sap2 抗体通过抑制生物膜的形成发挥保护作用。¹⁹.

本文概述了一项详细的 体外 评估来自不同Sap2免疫小鼠组的多克隆血清中抗原特异性抗体对已形成结构影响的实验方案 Candida tropicalis 生物膜。为此，实验室优化并开发了一种基于XTT还原法的检测方法，可在有或无抗体存在的条件下，快速、灵敏且高通量地测定生物膜的活性。

XTT 法用于测定细胞代谢活性，以此作为细胞活力、细胞增殖和细胞毒性的指标²⁰。该比色法基于活细胞将黄色四唑盐——3´-[1-(苯基氨基甲酰基)-3,4-四唑基]-双(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸钠水合物（XTT）——还原为橙色甲臜染料的原理。由于只有活细胞才能还原 XTT，因此还原生成的 XTT 甲臜量与颜色强度及细胞活力成正比。所形成的甲臜染料可溶于水，可直接使用酶标仪进行定量。由于其水溶性特性，XTT 法可在不破坏生物膜结构的前提下，用于完整生物膜的研究以及生物膜药物敏感性的检测²¹。此外，该方法因其操作简便、快速、准确、通量高且重复性好，已被广泛应用于Candida真菌活力的评估^7,22。

除了XTT还原法外，目前已确定多种可用于生物膜定量的替代技术。这些方法包括MTT还原法、结晶紫染色法、DNA定量、定量PCR、蛋白质定量、干菌体重测定以及活菌落计数法。这些方法在所需时间和成本方面差异较大。Taff等人对七种不同的Candida生物膜定量方法进行了比较分析，发现XTT法在对C. albicans生物膜进行定量评估时，具有最高的可重复性、准确性和效率²³。染色技术如结晶紫染色法存在一定的局限性：该方法通过测定经结晶紫染色的生物膜基质和细胞的光密度，间接反映生物膜的量。尽管结晶紫法能较好地反映生物膜的生物量，但无法反映其活性，因为它同时对微生物细胞和胞外基质进行染色²⁴。Dhale等人进一步报道，与结晶紫法相比，XTT还原法在检测生物膜形成能力方面具有更高的灵敏度、可重复性、准确性、效率和特异性²⁵。文献报道显示，XTT法结果与CFU计数法中的CFU/mL参数具有良好的相关性。然而，与XTT法相比，CFU法耗时较长且劳动强度大²⁶。此外，脱落的活细胞比例可能无法代表初始生物膜中的种群构成²⁷。尽管XTT还原法似乎是目前可用于评估活性的最佳方法，但该技术仍存在一些局限性。XTT法在涉及单一真菌菌株的比较中较为有效，但在比较不同真菌菌株或物种时其应用可能受限。由于不同菌株对底物的代谢能力不同，在缺乏详细标准化的情况下，菌株间的比较可能较为困难²¹。

方案

BALB/c小鼠饲养于印度理工学院鲁尔基分校的小型动物实验中心。所有动物均在25 °C、12小时光照与12小时黑暗交替的环境中饲养，并可自由摄取颗粒饲料和饮水。ad libitum。所有动物实验均经印度理工学院鲁尔基分校机构动物伦理委员会（IAEC）批准。

1. 假热带念珠菌（C. tropicalis）的制备

注意：热带假丝酵母（Candida tropicalis）属于危险等级2类病原体，被归类为生物安全等级2级（BSL2）微生物。操作假丝酵母属（Candida）物种时，必须始终使用经认证的II级生物安全柜。在处理热带假丝酵母（C. tropicalis）时应遵循无菌操作技术，并按照推荐的生物安全程序对这种病原体进行妥善处置。

1. 将热带假丝酵母（C. tropicalis，菌株 ATCC 750）划线接种至沙保葡萄糖（SAB）琼脂平板上。
2. 从 SAB 琼脂平板上挑取单菌落，接种于含有 10 mL SAB 液体培养基的无菌 50 mL 锥形管中，制备过夜培养的热带假丝酵母（C. tropicalis）培养物。或者，取冻存的甘油菌种（C. tropicalis）100 µL，接种于含有 50 mL SAB 液体培养基的无菌 250 mL 锥形瓶中。
3. 将热带假丝酵母（C. tropicalis）培养物置于 30 °C 摇床中，以 180 rpm 振荡培养 24–48 小时。
4. 在 21 °C 条件下，以 2,150 × g 离心 15 分钟，收集处于对数生长期的真菌培养物细胞。
5. 弃去上清液，向沉淀中加入 50 mL 无菌 1× PBS 缓冲液，轻轻涡旋振荡以洗涤并重悬沉淀。
6. 再次在 21 °C 条件下，以 2,150 × g 离心 15 分钟，弃去上清液，将真菌沉淀重悬于 10 mL 无菌 1× PBS 缓冲液中。
7. 使用血细胞计数板对细胞浓度进行计数。
8. 将真菌细胞重悬于 RPMI 1640 吗啉丙磺酸（MOPS）培养基中，调整终浓度为 1.0 × 10⁶ 个细胞/mL。立即使用步骤 1.6 中制备的细胞悬液。
   ​注：若需制备一块 96 孔板，共需真菌悬液 10 mL（每孔 100 µL）。可根据需要按比例调整体积。

2. C. tropicalis 生物膜形成

1. 按照前述方法在96孔平底聚苯乙烯微量滴定板中制备Candida生物膜（图1）^28,29。
2. 使用多通道移液器将100 µL C. tropicalis菌液（来自上述制备的10⁶ cells/mL储备液）加入96孔微量滴定板中（图2A）。最后两列（第11和12列）作为阴性对照，分别为“无真菌加血清”和“无真菌无血清”，不添加真菌细胞。仅向第11和12列每孔加入100 µL RPMI 1640 MOPS培养基。
3. 用盖子和铝箔纸覆盖微量滴定板，在37 °C静置条件下孵育24小时。
4. 次日，使用多通道移液器小心吸除培养基（避免触碰或破坏生物膜）。将板倒置，轻轻在吸水纸上轻拍，以去除残留液体。
5. 使用多通道移液器每孔加入200 µL 1× PBS进行洗涤。沿孔壁缓慢加入PBS，避免冲击破坏生物膜。再用多通道移液器小心吸除PBS。重复PBS洗涤2次（共洗涤3次）。
6. 为去除多余PBS，将板置于生物安全柜内室温下（不加盖）晾干30分钟。

3. 用抗体处理生物膜

注意：现在可对生物膜进行处理，以评估抗体对生物膜成熟过程的抑制作用。多克隆抗体来源于小鼠血清。分别采集 Sap2 免疫组（Sap2-albicans、Sap2-tropicalis 和 Sap2-parapsilosis）及假免疫小鼠的不同组别，通过眶后取血并按先前所述方法分离血清¹⁹。采用 Sap2 特异性 ELISA 检测抗 Sap2 抗体的存在，方法如前所述¹⁹。

1. 使用前将血清（多克隆抗体来源）在 56 °C 下热灭活 30 分钟，以排除补体在抑制活性中的作用。在进行血清稀释前先完成热灭活。
   注意：使用假免疫小鼠、免疫前小鼠以及 Sap2 特异性抗体耗竭血清作为额外对照¹⁹。抗体耗竭血清的制备方法参照先前研究¹⁹。在本实验方案测试的系列稀释度（1:25、1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1,600、1:3,200、1:6,400 和 1:12,800）中，生物膜成熟抑制效应在 1:25、1:50 和 1:100 稀释度下被观察到；因此选择 1:50 稀释度，以在抑制效果与血清消耗之间取得平衡。
2. 用无菌 RPMI 1640 MOPS 培养基将热灭活后的血清样品进行系列稀释（1:50）。所有待测血清样品均采用相同的稀释比例（1:50），用于检测对生物膜成熟抑制的效果³⁰。
3. 向 96 孔微孔板的每孔中加入 100 µL 已选定的血清稀释液。每个样品设置两个复孔，加样布局参见附图（图 2B）。
   1. 第 10 列不加血清稀释液，仅加入 RPMI 1640 MOPS 培养基，作为仅真菌阳性对照。
      注意：第 10 列 G1–G8 和 H1–H8 行最初含有 RPMI-MOPS 中的真菌细胞。然而，在 24 小时后继续向第 10 列添加 RPMI-MOPS 时，G1–G8 行作为 PBS 对照，H1–H8 行作为无血清对照。
   2. 第 11 列所有孔中加入 1:50 稀释的血清，作为无真菌加血清阴性对照。
   3. 第 12 列各孔均不加血清稀释液，作为空白对照，即无真菌无血清阴性对照。
4. 用盖子和铝箔纸封板，于 37 °C 培养 24 小时。

4. 生物膜代谢活性的评估

1. 第二天，使用多通道移液器小心吸除血清（避免接触或破坏生物膜）。将培养板倒置，轻轻在吸水纸上轻拍，以去除残留的血清。
2. 使用多通道移液器，每孔加入 200 µL 1× PBS 进行洗涤，加液时沿孔壁加入，避免破坏生物膜。再用多通道移液器小心吸除 PBS，并重复 PBS 洗涤 2 次（共洗涤 3 次）。将培养板置于生物安全柜内室温下（不加盖）晾干 30 分钟，以去除残留的 PBS。
3. XTT/甲萘醌溶液的配制：
   1. 用无菌林格氏乳酸盐溶液配制 XTT，浓度为 0.5 g/L。将 25 mg XTT 溶解于 50 mL 经滤膜除菌的林格氏乳酸盐溶液中。分装为每管 10 mL，用铝箔包裹后，于 -80 °C 保存。
   2. 配制 10 mM 甲萘醌储备液。将 8.6 mg 甲萘醌溶解于 5 mL 丙酮中，分装为每管 50 µL，共 100 管。分装后于 -80 °C 保存。
   3. 使用前现配 XTT/甲萘醌工作液：取 10 mL XTT 溶液，加入 1 µL 甲萘醌，得到终浓度为 1 µM 的工作液。
4. 向 96 孔微量培养板的每孔中加入 100 µL XTT/甲萘醌溶液。盖上盖子后用铝箔包裹，于 37 °C 避光孵育 2 小时。
5. 将每孔中的 80 µL 有色上清液转移至新的 96 孔板中。在 490 nm 波长下读取吸光度值。
6. 计算第 10 列各孔（仅含真菌的阳性对照）吸光度值的平均值，作为参考值，用于根据公式 (1) 计算各血清样本的生物膜抑制率。
   生物膜抑制率 (%) = 100 - × 100    (1)

结果

Candida tropicalis 生物膜在96孔微孔板中培养，并使用倒置显微镜在40倍下进行成像（图1A）。生物膜进一步用结晶紫染色，并使用倒置显微镜在40倍镜下观察图1B）。扫描电子显微镜显示了一个代表性图像 C. tropicalis 生物膜图1C）。为进行生物膜抑制试验，10⁵ 细胞的 假丝酵母 在时间0，按照布局将样品加入96孔微孔板的各孔中图2A24小时后，洗涤平板，并将血清样本加入预先形成的生物膜中。根据预实验和既往发表的研究，选择1:50的常规血清稀释度，以比较来自Sap2免疫小鼠和假免疫小鼠不同组别所获得的血清样本。³⁰.

根据布局（图2B），将...

讨论

由 Candida 属真菌引起的感染在全球范围内与高发病率和高死亡率相关。侵袭性真菌感染日益增长的威胁，要求对这类危及生命的疾病进行早期管理。大多数 Candida 感染涉及生物膜的形成，这些生物膜可黏附于多种医疗器械表面，并导致医院环境中真菌感染的持续存在和反复发生³¹。生物膜由酵母相或菌丝相细胞组成，对大多数传统抗真菌药物表现出显著的耐药性³²。Candida 生物膜的抗真菌耐药性与多种机制有关，包括抗真菌药物渗透性降低、胞外基质的存在、药物外排泵的过表达、细胞膜甾醇成分的改变、生长缓慢和空间异质性、多种信号通路的激活，以及耐药持久性细胞的存在^33,34。抑制 Candida 的黏附及生物膜形成是预防 Candida 感染最重要的策略。

各种 体外 细...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 mL 圆锥形离心管	BD Falcon	546021
1× PBS	—	实验室配制	NaCl：4 g KCl：0.1 g Na2HPO4：0.72 g  KH2PO4：0.12 g 水 500 mL。调节 pH 至 7.4
50 mL 圆锥形离心管	BD Falcon	546041
96 孔微量滴定板	Nunc	442404
培养箱	通用
甲萘醌	Sigma	M5625
微量滴定板读数仪	通用
多通道移液器及吸头	通用
培养皿	Tarson	460090
乳酸林格液	—	实验室配制	氯化钠 0.6 g，乳酸钠 0.312 g，氯化钾 0.035 g，氯化钙 0.027 g，水 100 mL。调节 pH 至 7.0
RPMI 1640 MOPS	Himedia	AT180
沙氏葡萄糖琼脂	SRL	24613
沙氏葡萄糖肉汤	SRL	24835
XTT	Invitrogen	X6493