基于AirID的邻近标记技术用于植物中蛋白质-蛋白质相互作用研究

摘要

本文以AT4G18020（APRR2）-AirID蛋白为模型，介绍了一步一步在黄瓜（Cucumis sativus L.）中进行邻近标记（PL）实验的操作方案。该方法包括载体构建、通过农杆菌浸润转化载体、生物素浸润、蛋白质提取，以及通过亲和纯化技术富集生物素标记的蛋白质。

摘要

在哺乳动物细胞和植物中，利用改良的抗坏血酸过氧化物酶（APEX）或生物素连接酶的邻近标记（PL）方法 大肠杆菌 生物素连接酶BirA（即BioID）已被成功用于鉴定蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）。APEX、BioID及其改进版本TurboID虽为有价值的技術，但仍存在一些限制。最新开发的AirID是一种用于蛋白质相互作用邻近标记的新型BioID工具，克服了上述限制。此前AirID已在动物模型中应用，而本研究首次展示了AirID在植物系统中的应用，并证实其在标记目标蛋白邻近蛋白方面，相较于BioID和TurboID等其他邻近标记酶，在植物体系中表现更优。本文以AT4G18020（APRR2）蛋白为模型，提供了一套鉴定蛋白质互作伙伴的逐步实验方案，包括载体构建、农杆菌浸润法转化、生物素处理、蛋白质提取，以及通过亲和纯化技术富集生物素标记蛋白等步骤。研究结果表明，AirID是分析植物中蛋白质相互作用的一种新型且理想的酶工具，该方法可推广应用于植物中其他蛋白质的研究。 关键词：AirID，BioID，TurboID，邻近依赖性生物素标记，蛋白质-蛋白质相互作用，植物互作组学，AT4G18020，APRR2，亲和纯化

引言

多种细胞蛋白在生物调控系统中发挥作用，蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）是该系统的一部分，也是许多细胞过程的基础。除了PPIs外，天然蛋白质的功能还通过翻译后修饰得到增强 通过 诸如复合物形成、泛素化和磷酸化等多种修饰。因此，研究蛋白质相互作用（PPIs）对于理解目标蛋白的潜在功能具有重要意义。目前已采用多种技术开展PPIs研究，例如免疫共沉淀后的质谱分析（IP-MS分析）¹酵母双杂交系统（Y2H）²，也称为无细胞阵列³这些方法在研究领域探索了多种重要发现。然而，这些方法也存在一些缺点；例如，酵母双杂交（Y2H）是一种耗时且昂贵的策略，需要构建目标物种的Y2H文库。

此外，酵母双杂交技术使用酵母这种异源单细胞真核生物，可能无法准确反映高等真核细胞的细胞状态。免疫共沉淀-质谱联用技术（IP-MS）不适用于高疏水性蛋白，且在捕获弱相互作用的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）时效率较低。植物中许多重要蛋白，如核苷酸结合结构域和富含亮氨酸重复序列的蛋白（NLR蛋白）以及类受体激酶（RLKs），表达水平较低，并且大多与其他蛋白发生瞬时相互作用；因此，使用这些方法不足以阐明这些蛋白调控机制的分子基础³。

一种名为邻近生物素化（proximity biotinylation, PB）的新技术有助于研究人员鉴定蛋白质相互作用（PPIs）。PB技术依赖于生物素连接酶（PL酶），该酶可连接到目标蛋白（POI）上，当相互作用的伙伴蛋白靠近POI时，PL酶便会将一个生物素化学标签连接到该伙伴蛋白上。随后可通过检测该标记蛋白，快速确定哪些伙伴蛋白与目标蛋白发生相互作用⁵。先前的研究表明，BioID和TurboID是研究PPIs的有效工具，尤其在植物中应用成功，但它们也存在一定的局限性⁴。BioID需要高浓度的生物素来标记伙伴蛋白，且标记过程需超过16小时。与BioID相比，TurboID更具优势，它可在10分钟内完成蛋白标记，并可在室温（RT）下对伙伴蛋白进行标记。然而，在某些条件下，TurboID对细胞具有毒性，并可能标记那些并未与目标蛋白发生相互作用的蛋白。

为克服这些问题，Kido 等人开发的 AirID 比其他标记酶更具效率，尽管 BioID 与 AirID 之间的序列相似性为 82%⁵为了验证AirID的效率，我们利用一个已知互作蛋白的POI进行了实验。该实验结果证实，AirID能够明确标记植物细胞中的互作蛋白。AirID是一种用于分析蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）的有价值工具酶。 体外 并在细胞中表现出更小的毒性。与TurboID相比，AirID在标记非互作蛋白时所需时间更短，错误率更低，从而减少了对细胞的杀伤。这表明AirID在邻近生物素标记中比其他标记酶更具竞争力。AirID具有更高的准确性、在耗时较长的实验过程中更具应用潜力，且毒性更低。 体外 以及在活细胞中。本方案描述了使用AirID作为邻近依赖性生物素标记酶（PL酶）鉴定APRR2相互作用蛋白的方法；此外，该方法还可应用于其他蛋白，以研究植物物种中的蛋白质相互作用（PPIs）。

方案

1. 植物材料的准备

1. Cucumis sativus（黄瓜）用于实验分析。将种子放入水中，在50 °C下孵育20分钟，然后将种子置于培养皿中的滤纸上，放置12–16小时。
2. 随后，将种子转移至装有市售土壤的花盆中，在气候培养箱中于23 °C、16小时光照和8小时黑暗的光周期条件下培养。
3. 将植株在气候培养箱中维持3–4周，直至植株生长至3叶或4叶期，以确保农杆菌浸润实验成功。

2. 构建 AirID 载体

1. 以APRR2作为靶蛋白，在花椰菜花叶病毒35S启动子（p35S: APRR2-AirID）驱动下构建APRR2-AirID。将其引入Gateway兼容的双元载体pEarleyGate100⁶ （由堪萨斯州立大学Kathrin Schrick博士提供），并根据补充文件1中提供的序列直接合成PL酶。

3. 感受态细胞的制备

1. DH5α 感受态细胞的制备
   1. 用接种2毫升LB培养基（10 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母提取物，10 g/L NaCl；pH = 7.0） 大肠杆菌 DH5α 细胞（直接取自冷冻保存菌种，无需解冻），在 37 °C 过夜培养（O/N）。
   2. 新鲜接种0.1%-0.5%的过夜培养物至100 mL LB培养基中，并将细胞培养至OD₆₀₀ 达到0.4–0.6，然后在4 °C下孵育培养物30分钟。
   3. 将培养物分装至两个50 mL离心管中，以2500 x g 4 °C下离心5分钟。
   4. 弃去上清液，将细胞重悬于10 mL预冷的0.1 M CaCl₂溶液中₂, 并在冰上放置15分钟。以2500 × g离心收集细胞 g 4 °C下离心5分钟。
   5. 将细胞重悬于 1 mL 冰冷的 0.1 M CaCl₂ 溶液中₂ 加入20%甘油，每管分装100 µL至1.5 mL离心管中，立即于-80 °C保存。
2. GV3101 感受态细胞的制备
   1. 接种单个GV3101菌落至2 mL LB液体培养基（含50 µg/mL庆大霉素和25 µg/mL利福平）中，28 °C、250 rpm振荡培养过夜。
   2. 接种1 mL过夜培养的饱和菌液至200 mL LB培养基中，在28 °C、250 rpm振荡培养至OD₆₀₀ 等于 0.5。
   3. 将培养物转移至四个预冷的无菌50 mL离心管中，置于冰上静置30分钟。
   4. 在2500 x g下离心收集细胞 g 4 °C下离心10分钟。弃去上清液，将沉淀置于冰上。
   5. 将细胞重悬于 10 mL 冰冷的 0.1 M CaCl 溶液中₂ 溶液。将细胞收集至一个预冷的50 mL Oakridge离心管中。
   6. 在1,000 x g下离心收集细胞 g 4 °C下离心5分钟。弃去上清液，将细胞重悬于10 mL预冷的CaCl₂溶液中。₂ 溶液，置于冰上30分钟。
   7. 在 1,000 x g 条件下离心收集细胞 g 4 °C下离心5分钟。弃去上清液，将细胞重悬于2 mL预冷的0.1 M CaCl溶液中。₂ 溶液
   8. 将细胞分装至预冷的无菌聚丙烯管中，每管50 µL。于-80 °C保存细胞。

4. 农杆菌浸润

1. 首先，将质粒转入农杆菌
   1. 取2.5 µL 第2.1步中构建的质粒，加入到根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101菌株的感受态细胞中，冰上孵育30分钟。
   2. 将含有质粒和感受态细胞的离心管置于液氮中处理3分钟。
   3. 在37 °C培养箱中热激5分钟，然后将离心管放回冰上冷却2分钟。
   4. 向农杆菌中加入1,000 µL LB培养基（含10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物和10 g/L NaCl；pH = 7.0），在30 °C、118 rpm条件下振荡培养1小时。
   5. 在4 °C下以3,000 × g离心2分钟。
   6. 弃去上清液800 µL，混匀剩余液体，然后涂布于LB固体培养基（如步骤4.1.4所述，添加琼脂，并加入50 µg/mL卡那霉素用于筛选质粒，以及50 µg/mL庆大霉素和25 µg/mL利福平用于GV3101感受态细胞筛选）平板上。将平板置于30 °C培养48小时。
      注：建议挑取部分菌落进行PCR鉴定，以确认目的基因的存在⁷。
2. 从平板上挑取若干细菌单菌落，接种至含适当抗生素的LB液体培养基中（参见步骤4.1.6）。在30 °C、218 rpm条件下振荡培养36–48小时。
3. 在4 °C下以3,000 × g离心2分钟收集菌体，用农杆菌浸润缓冲液（10 mM MgCl₂、10 mM MES、pH = 5.6、250 µM乙酰丁香酮）重悬菌体至OD₆₀₀ = 1.0。
4. 使用1 mL无针注射器将步骤4.3制备的菌液浸润至叶片的下表皮（abaxial epidermis）。
   注：建议尽可能浸润整片叶片，并设置重复实验。每4–5株植物使用一种构建体；每片叶子使用1.5 mL重悬的农杆菌菌液即可满足需求。
5. 将植物置于气候培养箱中培养36小时，培养条件为：16小时光照（约75 µmol·m^-2·s^-1）、8小时黑暗，温度保持在23 °C。
6. 在构建体浸润36小时后，向已浸润构建体的叶片中再次浸润1 mL 5 µM生物素溶液（溶于10 mM MgCl₂溶液中）。
7. 处理后继续培养植物4–12小时，再采集叶片组织。
   注：根据前期研究，目标蛋白表达高峰出现在36小时，因此推荐在36小时后进行生物素浸润^4,6。生物素孵育时间需根据具体研究目标调整，但本实验结果表明，8小时孵育时间更有利于蛋白质标记。

5. 样品采集

注意：样本采集所需的所有材料均应无菌，以避免角蛋白污染，且所有实验步骤均应在无污染环境中进行。

1. 剪取浸润的叶片，并迅速转移至液氮中，以避免蛋白质降解。
2. 通过免疫印迹分析对蛋白质进行预检测⁶；在进行共免疫沉淀（Co-IP）之前，强烈建议完成此步骤。

6. 从叶片中提取总蛋白

1. 使用研钵和研杵研磨叶片，迅速加入 2 mL 1× PBS-BSA（pH 7.4），然后缓慢研磨。
2. 取一个 15 mL 圆锥形离心管，在管口上方放置快速过滤材料滤膜，将样品混合物通过该滤膜转移至离心管中，并置于冰上保存。
3. 将样品转移至 2 mL 离心管中，并加入 1% 蛋白酶抑制剂混合液。
4. 通过上下翻转 7–8 次混匀管内物质，在 4 °C 条件下以 1,000 × g 离心 2 分钟。
5. 将样品的上清液转移至新的 2 mL 离心管中，加入 10% β-D-麦芽糖苷（β-D.M），冰上放置 5 分钟，随后在 4 °C 条件下以 20,000 × g 离心 10 分钟。

7. 平衡脱盐柱

1. 将柱子在 4 °C 下以 1,000 x g 离心 1 分钟。
   注意：在柱子的一侧做标记，并确保在所有离心过程中标记侧朝外。
2. 取下柱子的顶部和底部盖子，并在 4 °C 下以 1,000 x g 离心 2 分钟。
3. 弃去柱子收集管中的液体溶液，加入 5 mL 1x PBS 缓冲液进行洗涤。
4. 将柱子在 4 °C 下以 1,000 x g 离心 2 分钟。
5. 重复步骤 7.3 和 7.4 至少五次。

8. 磁珠洗涤

1. 取一个 1.5 mL 离心管，加入 50 µL 链霉亲和素-C1 偶联磁珠。
2. 加入 1 mL 1× PBS-BSA 溶液进行洗涤，充分混匀后置于磁力架上 3 分钟，弃去上清液。
3. 重复步骤 8.2 至少三次。
4. 每次洗涤后，将离心管放在磁力架上，使磁珠吸附于管壁一侧，以便去除洗涤缓冲液。

9. 生物素化蛋白的富集

1. 将2 mL样品加入柱中，在4 °C下以1,000 x g离心8分钟。
2. 将50 µL链霉亲和素-C1偶联磁珠加入1 mL脱盐后的蛋白质提取物中，进行平衡。
3. 将管子置于旋转仪上以正常速度旋转，使溶液充分混合，并在室温（RT）下孵育30分钟。
4. 将磁珠置于磁力架上，在室温下静置3分钟，或直至磁珠聚集于管子一侧，轻柔地去除上清液。
5. 加入1 mL洗涤缓冲液I（水中含2% SDS），在旋转仪上室温旋转2分钟，然后重复步骤9.4。
6. 加入1 mL洗涤缓冲液II（50 mM HEPES：pH = 7.5，500 mM NaCl，1 mM EDTA，0.1% 脱氧胆酸钠 [w/v]，1% Triton X-100），将管子置于旋转仪上室温旋转2分钟，然后重复步骤9.4。
7. 加入1 mL洗涤缓冲液III（10 mM Tris-HCl：pH = 7.4，250 mM LiCl，1 mM EDTA，0.1% 脱氧胆酸钠 [w/v]，1% NP40 [v/v]），在摇床上室温振荡2分钟，然后重复步骤9.4。
8. 为去除去垢剂，加入1.7 mL 50 mM Tris-HCl（pH = 7.5），重复步骤9.4，再重复此步骤一次。
9. 用1 mL 50 mM碳酸氢铵缓冲液在室温下洗涤磁珠，每次2分钟，共洗涤六次，并重复步骤9.4。
10. 向磁珠中加入50 µL含有50 mM Tris-HCl（pH 8.0）、12%（w/v）蔗糖（Suc）、2%（w/v）十二烷基硫酸锂和1.5%（w/v）二硫苏糖醇的蛋白质提取物，于100 °C孵育器中热激5分钟，然后执行步骤9.4。将上清液储存于-80 °C用于LC-MS/MS分析。

结果

根据先前的研究，黄瓜基因 APRR2 是控制未成熟果实白色果皮颜色的候选基因⁸。本研究建立了一种利用 AirID 作为邻近标记酶的技术方案，用于鉴定黄瓜中 APRR2 基因相互作用的蛋白质。将构建好的载体转入黄瓜叶片中，侵染后 36 小时加入生物素。48 小时后取样进行蛋白质印迹（western blot）分析，以确认转化成功。蛋白质提取方法如上述方案中所述。 图 1 中的代表性数据表明，在侵染的黄瓜叶片中实现了目标蛋白的表达和生物素标记，该结果符合新改良技术的预期。结果显示，与对照相比，标记蛋白的表达水平更高，并出现额外条带。这证实 AirID 成功标记了目的基因（GOI）的靶蛋白。此外，使用抗 Flag 抗体和抗小鼠抗体进一步验证了实验结果，其中抗 Flag 抗体成功检测到目标条带（图 2）。在通过蛋白质印迹分析确认后，我们进一步按照上述方案进行了免疫共沉淀（Co-IP）实验，侵染叶片中的生物素化蛋白被成功富集，可用于质谱分析，结果...

讨论

在本实验中，采用了AirID进行邻近标记，该技术由Kido等人通过祖先酶重建算法开发而成，该算法利用大规模基因组数据集和五种传统的BirA酶⁵。传统蛋白质定向进化中使用的随机突变虽可增强酶活性^9,10，但无法产生动态的序列变化。与其他邻近标记（PL）酶相比，AirID具有多项优势。此前，此类邻近标记方法仅适用于动物系统；而在本研究中，该方法被用于研究植物中的蛋白质-蛋白质相互作用。本实验方案详细阐述了在植物中建立基于AirID的邻近标记实验的各个步骤，包括制备叶片样品、去除游离生物素、定量提取的蛋白质以及富集生物素标记的蛋白质。

利用成熟的农杆菌介导的瞬时表达技术在黄瓜中进行实验，该方法可用于鉴定目标蛋白在黄瓜中的蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）。瞬时表达可能导致融合蛋白的过表达。还必须对AirID融合蛋白进行测试，以确保其不会干扰目标蛋白的功能，这是另一个关键考虑因素。然而，尽管邻近标记（PL）技术在检测短暂或弱相...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙酰丁香酮	北京索莱宝科技有限公司	S1519
丙烯酰胺/双丙烯酰胺 30% 溶液	生工生物工程（上海）股份有限公司	1510KA4528
琼脂	BioFroxx GmbH	D64683
琼脂糖	青科（上海）有限公司	TSJ001
碳酸氢铵	生工生物工程（上海）股份有限公司	G313BA0018
生物素	BBI生命科学	G908BA0012
CaCl2	BBI生命科学	E209BA0008
GV3101 感受态细胞	本实验制备
脱盐柱	Thermo Scientific	WC321753
脱氧胆酸	生工生物工程（上海）股份有限公司	G818BA0029
DH5α 感受态细胞	本实验制备		E.coli DH5α
β-D-麦芽糖苷	北京赛莱科科学与技术有限公司	S818
EDTA	生工生物工程（上海）股份有限公司	E104BA0029
甘氨酸	生工生物工程（上海）股份有限公司	161BA0031
HEPES	北京索莱宝科技有限公司	H8090
LiCl	生工生物工程（上海）股份有限公司	H209BA0003
MES	北京索莱宝科技有限公司	M8019
MiraCloth	EMD Milipore Corp/MERCK kgAa Darmstadt, Germenay	3429963	快速过滤材料滤膜
MgCl2	北京索莱宝科技有限公司	20200819
NaCl	生工生物工程（上海）股份有限公司	H324BA0003
NP40	生工生物工程（上海）股份有限公司	N8030
蛋白酶抑制剂混合物	北京赛莱科科学与技术有限公司	S3450
PVDF	BIO-RAD	5820172
SDS	北京赛莱科科学与技术有限公司	S1015
Silwet	生工生物工程（上海）股份有限公司	S9430
链霉亲和素-C1偶联磁珠	恩瑞吉生物科技	7E511E1	磁珠
TEMED	Servicebio	G2056
Triton X-100	生工生物工程（上海）股份有限公司	GB03BA007
Tris-HCl	生工生物工程（上海）股份有限公司	F828BA0020
胰蛋白胨	Thermo Scientific	LP0042