基于AirID的邻近标记技术用于植物中蛋白质-蛋白质相互作用研究

摘要

本文以AT4G18020（APRR2）-AirID蛋白为模型，介绍了一步一步在黄瓜（Cucumis sativus L.）中进行邻近标记（PL）实验的操作方案。该方法包括载体构建、通过农杆菌浸润转化载体、生物素浸润、蛋白质提取，以及通过亲和纯化技术富集生物素标记的蛋白质。

摘要

在哺乳动物细胞和植物中，利用改良的抗坏血酸过氧化物酶（APEX）或生物素连接酶的邻近标记（PL）方法 大肠杆菌 生物素连接酶BirA（即BioID）已被成功用于鉴定蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）。APEX、BioID及其改进版本TurboID虽为有价值的技術，但仍存在一些限制。最新开发的AirID是一种用于蛋白质相互作用邻近标记的新型BioID工具，克服了上述限制。此前AirID已在动物模型中应用，而本研究首次展示了AirID在植物系统中的应用，并证实其在标记目标蛋白邻近蛋白方面，相较于BioID和TurboID等其他邻近标记酶，在植物体系中表现更优。本文以AT4G18020（APRR2）蛋白为模型，提供了一套鉴定蛋白质互作伙伴的逐步实验方案，包括载体构建、农杆菌浸润法转化、生物素处理、蛋白质提取，以及通过亲和纯化技术富集生物素标记蛋白等步骤。研究结果表明，AirID是分析植物中蛋白质相互作用的一种新型且理想的酶工具，该方法可推广应用于植物中其他蛋白质的研究。 关键词：AirID，BioID，TurboID，邻近依赖性生物素标记，蛋白质-蛋白质相互作用，植物互作组学，AT4G18020，APRR2，亲和纯化

引言

多种细胞蛋白在生物调控系统中发挥作用，蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）是该系统的一部分，也是许多细胞过程的基础。除了PPIs外，天然蛋白质的功能还通过翻译后修饰得到增强 通过 诸如复合物形成、泛素化和磷酸化等多种修饰。因此，研究蛋白质相互作用（PPIs）对于理解目标蛋白的潜在功能具有重要意义。目前已采用多种技术开展PPIs研究，例如免疫共沉淀后的质谱分析（IP-MS分析）¹酵母双杂交系统（Y2H）²，也称为无细胞阵列³这些方法在研究领域探索了多种重要发现。然而，这些方法也存在一些缺点；例如，酵母双杂交（Y2H）是一种耗时且昂贵的策略，需要构建目标物种的Y2H文库。

此外，酵母双杂交技术使用酵母这种异源单细胞真核生物，可能无法准确反映高等真核细胞的细胞状态。免疫共沉淀-质谱联用技术（IP-MS）不适用于高疏水性蛋白，且在捕获弱相互作用的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）时效率较低。植物中许多重要蛋白，如核苷酸结合结构域和富含亮氨酸重复序列的蛋白（NLR蛋白）以及类受体激酶（RLKs），表达水平较低，并且大多与其他蛋白发生瞬时相互作用；因此，使用这些方法不足以阐明这些蛋白调控机制的分子基础³。

一种名为邻近生物素化（p....

方案

1. 植物材料的准备

1. Cucumis sativus（黄瓜）用于实验分析。将种子放入水中，在50 °C下孵育20分钟，然后将种子置于培养皿中的滤纸上，放置12–16小时。
2. 随后，将种子转移至装有市售土壤的花盆中，在气候培养箱中于23 °C、16小时光照和8小时黑暗的光周期条件下培养。
3. 将植株在气候培养箱中维持3–4周，直至植株生长至3叶或4叶期，以确保农杆菌浸润实验成功。

2. 构建 AirID 载体

1. 以APRR2作为靶蛋白，在花椰菜花叶病毒35S启动子（p35S: APRR2-AirID）驱动下构建APRR2-AirID。将其引入Gateway兼容的双元载体pEarleyGate100⁶ （由堪萨斯州立大学Kathrin Schrick博士提供），并根据补充文件1中提供的序列直接合成PL酶。

3. 感受态细胞的制备

1. DH5α 感受态细胞的制备
   1. 用接种2毫升LB培养基（10 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母提取物，10 g/L NaCl；pH = 7.0....

结果

根据先前的研究，黄瓜基因 APRR2 是控制未成熟果实白色果皮颜色的候选基因⁸。本研究建立了一种利用 AirID 作为邻近标记酶的技术方案，用于鉴定黄瓜中 APRR2 基因相互作用的蛋白质。将构建好的载体转入黄瓜叶片中，侵染后 36 小时加入生物素。48 小时后取样进行蛋白质印迹（western blot）分析，以确认转化成功。蛋白质提取方法如上述方案中所述。 图 1 中的代表性数据表明，在侵染的黄瓜叶片中实现了目标蛋白的表达和生物素标记，该结果符合新改良技术的预期。结果显示，与对照相比，标记蛋白的表达水平更高，并出现额外条带。这证实 AirID 成功标记了目的基因（GOI）的靶蛋白。此外，使用抗 Flag 抗体和抗小鼠抗体进一步验证了实验结果，其中抗 Flag 抗体成功检测到目标条带（图 2）。在通过蛋白质印迹分析确认后，我们进一步按照上述方案进行了免疫共沉淀（Co-IP）实验，侵染叶片中的生物素化蛋白被成功富集，可用于质谱分析，结果.......

讨论

在本实验中，采用了AirID进行邻近标记，该技术由Kido等人通过祖先酶重建算法开发而成，该算法利用大规模基因组数据集和五种传统的BirA酶⁵。传统蛋白质定向进化中使用的随机突变虽可增强酶活性^9,10，但无法产生动态的序列变化。与其他邻近标记（PL）酶相比，AirID具有多项优势。此前，此类邻近标记方法仅适用于动物系统；而在本研究中，该方法被用于研究植物中的蛋白质-蛋白质相互作用。本实验方案详细阐述了在植物中建立基于AirID的邻近标记实验的各个步骤，包括制备叶片样品、去除游离生物素、定量提取的蛋白质以及富集生物素标记的蛋白质。

利用成熟的农杆菌介导的瞬时表达技术在黄瓜中进行实验，该方法可用于鉴定目标蛋白在黄瓜中的蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）。瞬时表达可能导致融合蛋白的过表达。还必须对AirID融合蛋白进行测试，以确保其不会干扰目标蛋白的功能，这是另一个关键考虑因素。然而，尽管邻近标记（PL）技术在检测短暂或弱相.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙酰丁香酮	北京索莱宝科技有限公司	S1519
丙烯酰胺/双丙烯酰胺 30% 溶液	生工生物工程（上海）股份有限公司	1510KA4528
琼脂	BioFroxx GmbH	D64683
琼脂糖	青科（上海）有限公司	TSJ001
碳酸氢铵	生工生物工程（上海）股份有限公司	G313BA0018
生物素	BBI生命科学	G908BA0012
CaCl2	BBI生命科学	E209BA0008
GV3101 感受态细胞	本实验制备
脱盐柱	Thermo Scientific	WC321753
脱氧胆酸	生工生物工程（上海）股份有限公司	G818BA0029
DH5α 感受态细胞	本实验制备		E.coli DH5α
β-D-麦芽糖苷	北京赛莱科科学与技术有限公司	S818
EDTA	生工生物工程（上海）股份有限公司	E104BA0029
甘氨酸	生工生物工程（上海）股份有限公司	161BA0031
HEPES	北京索莱宝科技有限公司	H8090
LiCl	生工生物工程（上海）股份有限公司	H209BA0003
MES	北京索莱宝科技有限公司	M8019
MiraCloth	EMD Milipore Corp/MERCK kgAa Darmstadt, Germenay	3429963	快速过滤材料滤膜
MgCl2	北京索莱宝科技有限公司	20200819
NaCl	生工生物工程（上海）股份有限公司	H324BA0003
NP40	生工生物工程（上海）股份有限公司	N8030
蛋白酶抑制剂混合物	北京赛莱科科学与技术有限公司	S3450
PVDF	BIO-RAD	5820172
SDS	北京赛莱科科学与技术有限公司	S1015
Silwet	生工生物工程（上海）股份有限公司	S9430
链霉亲和素-C1偶联磁珠	恩瑞吉生物科技	7E511E1	磁珠
TEMED	Servicebio	G2056
Triton X-100	生工生物工程（上海）股份有限公司	GB03BA007
Tris-HCl	生工生物工程（上海）股份有限公司	F828BA0020
胰蛋白胨	Thermo Scientific	LP0042