获得无菌状态对于气管组织移植至关重要。本文介绍了一种使用低剂量γ射线辐照的灭菌方案，该方法可被器官完全耐受。
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摘要
摘要
确保移植顺利进行的关键因素之一是介质的无菌性。脱细胞气管移植涉及植入原本与外界环境接触的器官，因此从一开始便不具备无菌状态。尽管脱细胞化方案（通过去污剂处理［2% 十二烷基硫酸钠］、持续搅拌和渗透冲击）是在无菌操作条件下进行的，但该过程并不能实现灭菌。因此，主要挑战之一是在移植前确保无菌性 体内 植入。尽管无机材料已有成熟的伽马辐射灭菌方案，但目前尚无适用于有机材料的类似措施。此外，现有的无机材料灭菌方案无法直接应用于有机材料，因为常规的辐射剂量（25 kGy）会彻底破坏移植物。本研究探讨了逐步提高辐射剂量对脱细胞兔气管的影响。我们保持剂量范围（kGy），测试递增的辐射剂量，直至确定实现灭菌的最低有效剂量。在确定该剂量后，我们从组织学和生物力学两方面评估其对器官的影响。结果表明，0.5 kGy 剂量未能实现灭菌，而 1 kGy 和 2 kGy 剂量均可实现完全灭菌，因此 1 kGy 为实现灭菌所需的最低剂量。显微观察显示，与未灭菌器官相比无显著结构变化。轴向生物力学特性未发生任何改变，仅观察到器官在径向所能耐受的单位长度受力有轻微下降。因此，我们可以得出结论：1 kGy 剂量可实现脱细胞兔气管的完全灭菌，且对器官的影响极小，甚至可忽略不计。
引言
植入物的灭菌是其可存活的基本前提；事实上，已证明成功的假体都是植入于无菌区域（如血管、心脏、骨骼等）的1。气管具有两个表面：一个与外部环境接触的表面，因此并非无菌；另一个朝向纵隔的表面，则是无菌的。因此，从气管被取出的那一刻起，它就不是一个无菌器官。尽管后续的脱细胞过程是在最大限度的无菌条件下进行的，但该过程并不属于灭菌步骤2。植入异物本身会因产生利于细菌生长的微环境而带来感染风险3，并且即使材料已经过灭菌处理，仍存在最高达0.014%的从供体向受体传播疾病的风险4。为了确保气管获得良好的血管化，在几乎所有实验性移植方案中，首先需将其异位植入（heterotopic implant）到一个无菌区域（如肌肉、筋膜、大网膜、皮下等）5,6,7 ；这是因为将非无菌物质植入此类环境会导致局部感染3。
获得无菌植入物有多种可能的策略。使用超临界CO2已实现终端灭菌8,9。其他方法，如紫外线辐射或使用过氧乙酸、乙醇、过氧化氢和电解水等物质处理，在灭菌方面取得了不同的成功率，几乎总是依赖于其剂量，但这些方法已被证明会影响植入物的生物力学特性。事实上，某些物质（如环氧乙烷）可能显著改变植入基质的结构，甚至引起不良的免疫原性效应。因此，许多此类策略无法应用于生物模型2,10,11,12,13。
目前研究最广泛且被普遍接受的灭菌策略是依据 ISO 11737-1:2006 标准规定的对人体植入医疗器械进行灭菌的方法，即采用 25 kGy 的伽马辐射剂量。然而，该规范仅针对惰性、非生物性材料的灭菌14,15。此外，用于癌症根治性治疗的放射治疗剂量比用于医疗器械灭菌的剂量低三个数量级1。基于此，我们可以得出结论：该剂量不仅会杀死微生物群，还会破坏并显著改变植入物的生物结构。此外，还可能存在一种风险，即材料在降解过程中产生残留脂质，这些残留物可能具有细胞毒性，并加速支架的酶促降解13,14,15,16,17，即使使用低至 1.9 kGy 的剂量时也会发生，且损伤程度与所接受的辐射剂量呈直接正比关系17。
因此，本文的目的是尝试确定一种辐射剂量，该剂量可在尽量减少辐照造成有害影响的前提下，获得无菌的植入物2,18,19采用的策略包括对脱细胞并经辐照的气管在千戈瑞范围内（0.5、1、2、3 kGy等）进行不同递增剂量的辐照，直至获得阴性培养结果。对于获得阴性培养的剂量，进一步开展额外检测以确认灭菌效果。在确定实现灭菌所需的最低剂量后，评估辐照对气管结构和生物力学性能的影响。所有指标均与对照组天然兔气管进行比较。随后对构建物的灭菌效果进行验证 体内 通过将气管植入新西兰白兔体内。
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方案
本研究遵循欧盟关于实验动物护理和使用的指令20170/63/EU，并已获得西班牙瓦伦西亚大学伦理委员会的批准（依据欧洲经济共同体法律86/609/EEC、1997年214号法令以及瓦伦西亚政府2018/VSC/PEA/0122第2类代码）。
1. 气管脱细胞化
注意：脱细胞化方法已在其他地方报道过20。
- 使用200 mg/mL的戊巴比妥钠溶液经耳缘静脉注射（剂量为133 mg/kg），处死体重为3.5–4.1 kg的雄性成年新西兰白兔（Oryctolagus cuniculus）。
- 在确保无菌条件下，行中央纵行颈部切口，分离颈肌并暴露气管。对气管进行环周及纵向解剖，最终在第一软骨环下方和隆突上方切断。
- 用手术刀将气管切成2 cm长的节段，再用剪刀去除周围结缔组织和内层黏膜6。
- 将组织样本浸入含12 mL磷酸盐缓冲液（PBS）的溶液中，该溶液包含2%十二烷基硫酸钠（SDS）、5%青霉素-链霉素和5%两性霉素B。
- 将气管置于室温下，用磁力搅拌器以400 rpm持续搅拌5周。每周更换一次脱细胞溶液，每次换液前先将气管浸入蒸馏水中进行2小时的渗透压冲击处理。
- 使用含80%胎牛血清（FBS）和20%二甲基亚砜（DMSO）的12 mL混合液，在-80 °C冷冻容器中对样本进行冷冻保存。
- 当气管即将使用时（保存13–15天后），在37 °C水浴中解冻，并在解冻完成后将其浸入PBS中清洗。
2. 灭菌
- 辐照
- 将四段气管组织（每段长2 cm）放入含20 mL PBS的T25培养瓶中，加入甲基丙烯酸酯至总体积达30 mL。注意避免气泡形成，以防在气液界面处引起能量扩散。
- 使用直线加速器进行辐照，采用标称能量为10 MV的无均整滤过器光子束。在等中心处设置剂量率为每分钟2,400监测单位，将气管置于源-表面距离为100 cm的位置进行辐照，照射野深度为2.5 cm，照射野大小为10 cm × 10 cm，以覆盖整个容器，相当于剂量率为24 Gy/min。
- 逐批递增剂量：每四段气管组织分别接受0.5 kGy、1 kGy、2 kGy等剂量，依此类推，直至达到灭菌剂量。
- 培养
- 将组织段转移至30 mL含10%灭活胎牛血清（FBS）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，不含抗生素和抗真菌剂。
- 在标准组织培养箱中于37 °C、5% CO2 条件下培养2周，每隔24小时观察一次。
注：污染的判断指标为培养基pH值的变化，以及相应的颜色和浑浊度改变。气管组织取自无菌兔形目动物，动物未患病，因此预期其气管内无厌氧菌存在。
3. 组织学分析
注意：使用苏木精和伊红21、马松三色染色法以及地衣红22对组织切片进行染色。
- DAPI 染色
- 使用DAPI（4′,6-二脒基-2-苯基吲哚）检测组织活力。这种蓝色荧光染料可强烈结合DNA序列中富含腺嘌呤和胸腺嘧啶的区域，从而实现对DNA的可视化观察 通过 荧光显微镜技术
- 将组织样本包埋于最佳切割温度（OCT）包埋剂中。
- 使用冷冻切片机切割样本。
- 用蒸馏水将待染色的样品洗涤三次，以去除OCT。然后将其置于含有30 nM DAPI溶液的封片剂中。
- 使用荧光显微镜观察荧光。
- DNA含量分析
- 使用手术刀切割长约3 mm的气管节段。
- 在蛋白酶K中孵育2小时（材料表).
- 使用DNA提取试剂盒，按照制造商说明书提取DNA。
- 采用分光光度法，使用分光光度计在260/280 nm处测定吸光度以确定DNA浓度。
- 使用生物分析仪通过毛细管色谱法测定提取的DNA样品的大小。
4. 生物力学研究
注意：通过轴向拉伸和径向压缩试验测量气管对纵向和横向力的阻力23。
- 气管测量
- 使用游标卡尺测量气管长度、管壁厚度和外径。
- 对每个变量随机测量三次，计算其平均值。
- 在径向压缩试验中，通过检测压板与样本接触的点来计算前后径。
- 所有测试均在室温下进行。
- 拉伸试验
- 在配备100 N载荷传感器（力分辨率为0.1 N，位移分辨率为0.001 mm，时间分辨率为0.1 s）的台式万能拉伸试验机（UTM）上，采用位移控制模式进行拉伸试验。该试验机配备有力和位移传感器，并连接至计算机，计算机中安装有制造商专门设计的软件23。
- 每0.4秒记录一次数据，并导出至电子表格。
- 使用纯单层、无毒水晶聚氯乙烯（PVC）空心管制作拉伸夹具，其外径为1 cm，壁厚为1.5 mm，尺寸适配兔气管的平均口径。
- 将导管切成3 cm长的节段。
- 在夹具边缘2 mm处钻制12个预制孔，用于端对端缝合，孔间距为2.5 mm，以避免缝线造成的偏差。
- 通过交替使用预制孔（每5 mm一个），在距气管边缘2 mm处，使用6-0单丝尼龙缝线连续缝合，将PVC玻璃管与兔气管以端对端吻合方式连接。
- 以5.0 mm/min的位移速率拉伸所有样品。
- 记录最大应力（σmax，单位为N/mm2）和应变（εmax，无量纲），以及单位气管体积储存的能量（W/Vol，单位为mJ/mm）和杨氏模量（E，单位为MPa）。
- 径向压缩试验
- 在配备15 N力传感器（力分辨率0.001 N，位移分辨率0.001 mm，时间分辨率0.1 s）的台式压缩万能试验机（UTM）上进行径向压缩试验，以获取力（N）、位移（mm）和时间（s）数据。每0.5秒记录一次数据，并导出至电子表格。
- 将气管放置于下压板上，使膜部朝下接触下板。下板以5 mm/min的恒定速度向上移动，逐渐接近上压板。
- 计算使气管完全闭塞所需的单位长度上的力（f，单位为N/mm）、刚度（R，单位为MPa·mm）以及单位表面积上的能量（W / S，单位为mJ/mm2）。
5. 手术技术
注意：该手术技术已在其他地方被广泛报道20。
- 放置一根无菌的管腔内PVC支架，规格为14 Fr（可自由滑动且不压迫管壁），两端各留出3-4 mm的边缘。
- 通过第一软骨的软骨间间隙，使用一根6-0单丝尼龙缝线固定支架。
- 继续对兔子进行麻醉。
- 对实验动物（3.65–4.05 kg 雄性新西兰白兔）进行术前给药，肌内注射镇痛剂（35 mg/kg 氯胺酮）以及镇静剂、肌松剂和镇痛剂（2.5 mg/kg 赛拉嗪）。
- 剃除手术区域内的切口部位，并清洁手术区以去除毛发。
- 给予镇痛药联合抗生素预防：0.05 mg/kg 肌内注射布托啡诺和 10 mg/kg 恩诺沙星。
- 在每只兔子的耳缘静脉中插入静脉导管。
- 以静脉注射10 mg/kg的丙泊酚推注诱导麻醉。
- 使用三导联心电图、脉搏血氧仪和无创血压测量仪监测动物的生命体征。每30分钟向眼睛滴加生理盐水，以防止麻醉期间角膜干燥。
- 使用脚趾夹捏法检测麻醉深度。
- 使用1.5%–2%最低肺泡浓度的吸入式异氟烷维持麻醉，确保不抑制兔子的自主呼吸，并通过加热垫提供保温支持。
- 用含碘消毒剂以环形方式多次消毒切口区域。始终在无菌条件下操作，使用无菌器械，沿胸骨中线做一长约3 cm的纵向切口，切取双侧带蒂皮瓣，皮瓣包含胸肌筋膜及肌肉成分。
- 用皮瓣包裹四只兔子的气管，每侧胸腔各一个（共八个气管）。
- 手术完成后，通过停止异氟烷给药来逆转麻醉。
- 术后时期
- 将动物留在手术室内，直至其完全从麻醉中恢复。待其完全恢复后，将其送回与其他兔子共同生活的环境。
- 每24小时为兔子注射一次抗生素（每千克体重0.5 mL的2.5%恩诺沙星）和镇痛剂（美洛昔康5 mg/mL；每千克体重0.05 mL美他卡），持续5天。
- 留下植入物 原位 所需时间。
- 安乐死前，先通过肌内注射给予兔子镇痛剂（35 mg/kg 氯胺酮）以及具有镇静、肌肉松弛和镇痛作用的药物（2.5 mg/kg 赛拉嗪）。随后通过耳缘静脉注射200 mg/mL的戊巴比妥钠（133 mg/kg）实施安乐死，并取下气管。
- 对气管进行生物力学和组织学检测。
6. 统计学分析
- 使用 R 软件 3.5.3 版（R Foundation for Statistical Computing, 2019）中的贝叶斯方法对所有模型进行调整。
- 对研究变量（除 f 和 R 外）采用多重线性回归模型进行分析。
- 对于 f 和 R 变量，应用混合线性回归模型。在这些模型中，除了与每根气管的处理和状态相关的感兴趣变量外，还需将阻塞百分比作为单调效应引入，并将每根气管的独立项作为随机因素。
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结果
脱细胞化
DAPI 染色显示无 DNA 存在，通过电泳检测所有气管中的 DNA 含量均未超过 50 ng，且所有片段均小于 200 bp20。
微生物培养
在接受0.5 kGy辐照的八块样品中，有两块在不到1周内出现了颜色变化。接受1 kGy和2 kGy辐照的样品均未出现任何颜色变化（图1）。
组织学分析
在所分析的所有样本中，均未检测到胶原纤维或弹性纤维分布模式的改变（图2）。
确定辐射剂量
根据上述结果，0.5 kGy 的辐照剂量无法确保样本的灭菌，而 1 kGy 和 2 kGy 的剂量则可以实现灭菌，因此我们将实现组织灭菌的最低可能辐照...
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讨论
目前存在多种灭菌策略。超临界CO2能够完全穿透组织，通过降低植入物压力即可实现简单清除，同时使培养基酸化并破坏细胞磷脂双分子层8,14,25。紫外线辐射也曾被使用，其在啮齿类动物气管中的灭菌效果已有文献报道，但相关研究报道较少10。其他方法包括使用过氧乙酸、乙醇、过氧化氢或电解水等物质，但这些方法结果不稳定，且已被证明会对组织产生显著影响11,12。与上述策略相比，γ射线辐照不仅被证实具有完全有效的灭菌能力，而且对其剂量及灭菌效应的研究也十分充分和广泛。事实上，相关研究已足够深入，国际标准化组织（ISO）已制定了γ射线用于灭菌的标准，其中规定用于人体植入的惰性材料的灭菌剂量为25 kGy13,
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披露
所有作者均无利益冲突。
致谢
本研究得到了2018年西班牙胸外科协会资助的全国多中心研究项目（编号180101，授予Ne）的支持。́stor J.Martínez-Hernández] 和 PI16-01315 [授予 Manuel Mata-Roig]，由西班牙卡洛斯三世健康研究所（Instituto de Salud Carlos III）资助。CIBERER 由西班牙第六个国家研发计划（VI National R&D&I 计划 2018-2011、Iniciativa Ingenio 2010、Consolider 计划、CIBER 行动以及卡洛斯三世健康研究所，获得欧洲区域发展基金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 6-0 尼龙单丝缝合线 | Monosoft. Covidien; 美国马萨诸塞州曼斯菲尔德 | SN-5698G | |
| 两性霉素 B 5% | Gibco 赛默飞世尔科技；美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 15290018 | |
| 生物分析仪 | Agilent，美国加利福尼亚州圣克拉拉 | G2939BA | |
| 丁丙诺啡 | Buprex. Reckitt Benckiser Healthcare；英国赫尔 | N02AE01 | |
| 压缩式台式万能试验机 | Microtest，西班牙马德里 | EM1/10/FR | |
| 冷冻切片机 | Leyca CM3059，Leica Biosystems，德国韦茨拉尔 | CM3059 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma-Aldrich；美国密苏里州 | D2650 | |
| DMEM | 赛默飞世尔科技；美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 11965084 | |
| DNA 提取试剂盒 | DNeasy 提取试剂盒 Qiagen，德国希尔登 | 4368814 | |
| 恩诺沙星，2.5% | Boehringer Ingelheim，德国英格尔海姆 | 0035-0002 | |
| 胎牛血清（FBS） | GE Healthcare Hyclone；西班牙马德里 | SH20898.03IR | |
| 荧光显微镜 | Leica DM2500（Leica，德国韦茨拉尔） | DM2500?? | |
| 冷冻容器 | Mr Frosty. 赛默飞世尔；西班牙马德里 | 5100-0001 | |
| 异氟烷 | Isoflo；Proyma Ganadera；西班牙雷阿尔城 | 8.43603E+12 | |
| 氯胺酮 | Imalgene. Merial；法国图卢兹 | BOE127823 | |
| 直线加速器 | "True Beam". Varian，美国加利福尼亚州帕洛阿尔托 | H191001 | |
| 磁力搅拌器 | Orbital Shaker PSU-10i. Biosan；拉脱维亚里加 | BS-010144-AAN | |
| 美洛昔康 5 mg/ml | Boehringer Ingelheim，德国英格尔海姆 | 6283-MV | |
| 青霉素-链霉素 5% | Gibco 赛默飞世尔科技；美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 15140122 | |
| 戊巴比妥钠 | Dolethal. Vetoquinol；西班牙马德里ñ | 3.60587E+12 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma-Aldrich；美国密苏里州 | P2272 | |
| 丙泊酚 | Propofol Lipuro. B. Braun Melsungen AG；德国梅尔松根 | G 151030 | |
| 蛋白酶 K | Gibco 赛默飞世尔科技；美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | S3020 | |
| PVC 空心管 | Cristallo Extra；FITT，意大利桑德里戈 | hhdddyyZ | |
| PVC 支架 | ArgyleTM Medtronic；土耳其伊斯坦布尔 | 019 5305 1 | |
| R 软件，版本 3.5.3 R Core | 统计计算 R 基金会 | R 3.5.3 | |
| 十二烷基硫酸钠（SDS） | Sigma-Aldrich；美国密苏里州 | 8,17,034 | |
| 分光光度计 | Nanodrop，Life Technologies；Isogen Life Science. 荷兰乌得勒支 | ND-ONEC-W | |
| 电子表格软件 | Microsoft Excel for Mac，版本 16.23，美国华盛顿州雷德蒙德 | 2864993241 | |
| 拉伸万能试验机 | Testing Machines，荷兰韦嫩达尔 | 84-01 | |
| UTM 软件 | TestWorks 4，MTS 系统公司，美国明尼苏达州伊甸草原 | 100-093-627 F | |
| VECTASHIELD 封片剂 | Vector Labs，美国加利福尼亚州伯林盖姆 | H-1000-10 | |
| 赛拉嗪 | Xilagesic. Calier；西班牙巴塞罗那ñ | 20102-003 |
参考文献
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