方法文章

低剂量伽马辐射对脱细胞气管移植物的灭菌处理

DOI：

10.3791/64432

⸱

2023年4月14日

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1Thoracic Surgery Department, Hospital Universitari de la Ribera, 2Pathology Department, Universitat de Valencia Facultat de Medicina i Odontologia, 3Center for Biomaterials and Tissue Engineering, Universitat Politècnica de València, 4Radiation Oncology, Hospital Universitari de la Ribera, 5Thoracic Surgery Department, Hospitales Universitarios Virgen del Rocío, 6Department of Applied Statistics and Operations Research and Quality, Universitat Politècnica de València, 7Networking Research Center on Respiratory Diseases (CIBERER), 8INCLIVA Biomedical Research Institute

本文内容

摘要

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获得无菌状态对于气管组织移植至关重要。本文介绍了一种使用低剂量γ射线辐照的灭菌方案，该方法可被器官完全耐受。

摘要

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确保移植顺利进行的关键因素之一是介质的无菌性。脱细胞气管移植涉及植入原本与外界环境接触的器官，因此从一开始便不具备无菌状态。尽管脱细胞化方案（通过去污剂处理［2% 十二烷基硫酸钠］、持续搅拌和渗透冲击）是在无菌操作条件下进行的，但该过程并不能实现灭菌。因此，主要挑战之一是在移植前确保无菌性 体内 植入。尽管无机材料已有成熟的伽马辐射灭菌方案，但目前尚无适用于有机材料的类似措施。此外，现有的无机材料灭菌方案无法直接应用于有机材料，因为常规的辐射剂量（25 kGy）会彻底破坏移植物。本研究探讨了逐步提高辐射剂量对脱细胞兔气管的影响。我们保持剂量范围（kGy），测试递增的辐射剂量，直至确定实现灭菌的最低有效剂量。在确定该剂量后，我们从组织学和生物力学两方面评估其对器官的影响。结果表明，0.5 kGy 剂量未能实现灭菌，而 1 kGy 和 2 kGy 剂量均可实现完全灭菌，因此 1 kGy 为实现灭菌所需的最低剂量。显微观察显示，与未灭菌器官相比无显著结构变化。轴向生物力学特性未发生任何改变，仅观察到器官在径向所能耐受的单位长度受力有轻微下降。因此，我们可以得出结论：1 kGy 剂量可实现脱细胞兔气管的完全灭菌，且对器官的影响极小，甚至可忽略不计。

引言

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植入物的灭菌是其可存活的基本前提；事实上，已证明成功的假体都是植入于无菌区域（如血管、心脏、骨骼等）的1。气管具有两个表面：一个与外部环境接触的表面，因此并非无菌；另一个朝向纵隔的表面，则是无菌的。因此，从气管被取出的那一刻起，它就不是一个无菌器官。尽管后续的脱细胞过程是在最大限度的无菌条件下进行的，但该过程并不属于灭菌步骤2。植入异物本身会因产生利于细菌生长的微环境而带来感染风险3，并且即使材料已经过灭菌处理，仍存在最高达0.014%的从供体向受体传播疾病的风险4。为了确保气管获得良好的血管化，在几乎所有实验性移植方案中，首先需将其异位植入（heterotopic implant）到一个无菌区域（如肌肉、筋膜、大网膜、皮下等）5,6,7 ；这是因为将非无菌物质植入此类环境会导致局部感染3。

获得无菌植入物有多种可能的策略。使用超临界CO2已实现终端灭菌8,

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方案

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本研究遵循欧盟关于实验动物护理和使用的指令20170/63/EU，并已获得西班牙瓦伦西亚大学伦理委员会的批准（依据欧洲经济共同体法律86/609/EEC、1997年214号法令以及瓦伦西亚政府2018/VSC/PEA/0122第2类代码）。

1. 气管脱细胞化

注意：脱细胞化方法已在其他地方报道过20。

  1. 使用200 mg/mL的戊巴比妥钠溶液经耳缘静脉注射（剂量为133 mg/kg），处死体重为3.5–4.1 kg的雄性成年新西兰白兔（Oryctolagus cuniculus）。
  2. 在确保无菌条件下，行中央纵行颈部切口，分离颈肌并暴露气管。对气管进行环周及纵向解剖，最终在第一软骨环下方和隆突上方切断。
  3. 用手术刀将气管切成2 cm长的节段，再用剪刀去除周围结缔组织和内层黏膜6。
  4. 将组织样本浸入含12 mL磷酸盐缓冲液（PBS）的溶液中，该溶液包含2%十二烷基硫酸钠（SDS）、5%青霉素-链霉素和5%两性霉素B。
  5. 将气管置于室温下，用磁力搅拌器以400 rpm持续搅拌5周。每周更换一次脱细胞溶液，每次换液前先将气管浸入蒸馏水中进行2小时的渗透压冲击处理。
  6. 使....

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结果

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脱细胞化
DAPI 染色显示 DNA 缺失，通过电泳检测所有气管中均未发现高于 50 ng 的 DNA，且所有片段均小于 200 bp20。

微生物培养
在接受0.5 kGy辐照的八块样品中，有两块在不到1周内出现了颜色变化。接受1 kGy和2 kGy辐照的样品均未出现任何颜色变化（图1）。

组织学分析
在所分析的所有样本中，均未检测到胶原纤维或弹性纤维分布模式的改变（图2）。

确定辐射剂量
根据上述结果，0.5 kGy 的辐照剂量无法确保样本的灭菌，而 1 kGy 和 2 kGy 的剂量则可以实现灭菌，因此我们将实现组织灭菌的最低可能辐照剂.......

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讨论

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目前存在多种灭菌策略。超临界CO2能够完全穿透组织，通过降低植入物压力即可实现简单清除，同时使培养基酸化并破坏细胞磷脂双分子层8,14,25。紫外线辐射也曾被使用，其在啮齿类动物气管中的灭菌效果已有文献报道，但相关研究报道较少10。其他方法包括使用过氧乙酸、乙醇、过氧化氢或电解水等物质，但这些方法结果不稳定，且已被证明会对组织产生显著影响11,12。与上述策略相比，γ射线辐照不仅被证实具有完全有效的灭菌能力，而且对其剂量及灭菌效应的研究也十分充分和广泛。事实上，相关研究已足够深入，国际标准化组织（ISO）已制定了γ射线用于灭菌的标准，其中规定用于人体植入的惰性材料的灭菌剂量为25 kGy13,

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披露

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所有作者均无利益冲突。

致谢

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This paper was supported by the 2018 Spanish Society of Thoracic Surgery Grant to National Multicentric Study [Number 180101 awarded to Néstor J.Martínez-Hernández] and PI16-01315 [awarded to Manuel Mata-Roig] by the Instituto de Salud Carlos III. CIBERER is funded by the VI National R&D&I Plan 2018-2011, Iniciativa Ingenio 2010, Consolider Program, CIBER Actions, and the Instituto de Salud Carlos III, with assistance from the European Regional Development Fund.

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
6-0 尼龙单丝缝合线 Monosoft. Covidien; 美国马萨诸塞州曼斯菲尔德SN-5698G
两性霉素 B 5%Gibco 赛默飞世尔科技；美国马萨诸塞州沃尔瑟姆15290018
生物分析仪Agilent，美国加利福尼亚州圣克拉拉G2939BA
丁丙诺啡Buprex. Reckitt Benckiser Healthcare；英国赫尔N02AE01
压缩式台式万能试验机Microtest，西班牙马德里EM1/10/FR
冷冻切片机Leyca CM3059，Leica Biosystems，德国韦茨拉尔CM3059
二甲基亚砜（DMSO）Sigma-Aldrich；美国密苏里州D2650
DMEM 赛默飞世尔科技；美国马萨诸塞州沃尔瑟姆11965084
DNA 提取试剂盒DNeasy 提取试剂盒 Qiagen，德国希尔登4368814
恩诺沙星，2.5%Boehringer Ingelheim，德国英格尔海姆0035-0002
胎牛血清（FBS）GE Healthcare Hyclone；西班牙马德里SH20898.03IR
荧光显微镜Leica DM2500（Leica，德国韦茨拉尔）DM2500??
冷冻容器 Mr Frosty. 赛默飞世尔；西班牙马德里 5100-0001
异氟烷Isoflo；Proyma Ganadera；西班牙雷阿尔城 8.43603E+12
氯胺酮Imalgene. Merial；法国图卢兹BOE127823
直线加速器 "True Beam". Varian，美国加利福尼亚州帕洛阿尔托H191001
磁力搅拌器Orbital Shaker PSU-10i. Biosan；拉脱维亚里加BS-010144-AAN
美洛昔康 5 mg/mlBoehringer Ingelheim，德国英格尔海姆6283-MV
青霉素-链霉素 5%Gibco 赛默飞世尔科技；美国马萨诸塞州沃尔瑟姆15140122
戊巴比妥钠Dolethal. Vetoquinol；西班牙马德里ñ3.60587E+12
磷酸盐缓冲液（PBS）Sigma-Aldrich；美国密苏里州P2272
丙泊酚Propofol Lipuro. B. Braun Melsungen AG；德国梅尔松根G 151030
蛋白酶 KGibco 赛默飞世尔科技；美国马萨诸塞州沃尔瑟姆S3020
PVC 空心管Cristallo Extra；FITT，意大利桑德里戈hhdddyyZ
PVC 支架 ArgyleTM Medtronic；土耳其伊斯坦布尔019 5305 1
R 软件，版本 3.5.3 R Core统计计算 R 基金会R 3.5.3
十二烷基硫酸钠（SDS）Sigma-Aldrich；美国密苏里州8,17,034
分光光度计Nanodrop，Life Technologies；Isogen Life Science. 荷兰乌得勒支ND-ONEC-W
电子表格软件Microsoft Excel for Mac，版本 16.23，美国华盛顿州雷德蒙德2864993241
拉伸万能试验机 Testing Machines，荷兰韦嫩达尔84-01
UTM 软件TestWorks 4，MTS 系统公司，美国明尼苏达州伊甸草原 100-093-627 F
VECTASHIELD 封片剂 Vector Labs，美国加利福尼亚州伯林盖姆H-1000-10
赛拉嗪Xilagesic. Calier；西班牙巴塞罗那ñ20102-003

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ch'ng, S., et al. Reconstruction of the (Crico)trachea for malignancy in the virgin and irradiated neck. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 65 (12), 1645-1653 (2012).
  2. Johnson, C. M., Guo, D. H., Ryals, S., Postma, G. N., Weinberger, P. M.

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