小鼠卵母细胞胞质微管组织中心的多光子激光消融

摘要

本文介绍了一种优化的实验方案，利用近红外飞秒激光在小鼠卵母细胞第一次减数分裂中期实现细胞质微管组织中心的去除。

摘要

卵母细胞减数分裂的保真性对于产生具有正常发育潜能的整倍体卵子至关重要。在哺乳动物中，卵母细胞在第一次减数分裂的前期I经历一个漫长的停滞期。青春期后，在减数分裂恢复时，核膜解体（核膜破裂），纺锤体主要在卵母细胞中心组装。初始的中心纺锤体定位对于防止异常的动粒-微管（MT）连接和非整倍性具有重要作用。位于中央的纺锤体会以时间依赖的方式向皮层迁移，这是排出微小极体所必需的过程。在有丝分裂细胞中，纺锤体定位依赖于中心体介导的星体微管与细胞皮层之间的相互作用。相反，小鼠卵母细胞缺乏典型的中心体，而是含有大量无中心粒的微管组织中心（MTOC）。在第一次减数分裂中期阶段，小鼠卵母细胞具有两组不同的MTOC：（1）聚集并排序以组装纺锤体极的MTOC（极性MTOC）；以及（2）停留在细胞质中、不直接参与纺锤体形成但对调控纺锤体定位和及时迁移起关键作用的中期细胞质MTOC（mcMTOC）。本文介绍了一种多光子激光消融方法，用于选择性清除从Cep192-eGfp报告基因小鼠中获取的卵母细胞内源性标记的mcMTOC。该方法有助于深入理解哺乳动物卵母细胞中纺锤体定位与迁移的分子机制。

引言

单倍体配子（精子和卵母细胞）通过减数分裂产生，该过程包括一轮DNA复制，随后进行两次连续的分裂，以在受精前实现染色体数目的减半。在哺乳动物中，卵母细胞在胚胎早期便进入第一次减数分裂前期双线期的长期停滞状态（直至青春期），这一阶段称为生发泡（GV）期。减数分裂恢复后，GV期卵母细胞发生核膜破裂（NEBD），纺锤体主要在卵母细胞中央组装^1,2,3。随后，在F-actin的驱动下，纺锤体适时地从卵母细胞中央迁移至皮层区域，以确保高度不对称的分裂，最终产生一个带有微小极体（PB）的成熟卵子^4,5,6。

在有丝分裂细胞中，中心体由一对中心粒及其周围的中心粒周围物质成分（PMC）组成，例如 pericentrin、γ-tubulin、Cep152 和 Cep192⁷。这些含有中心粒的中心体有助于双极纺锤体形成的保真性⁸。然而，在包括啮齿类动物在内的多种物种中，中心粒在卵子发生的早期即丢失⁹。因此，小鼠卵母细胞采用一种不依赖中心粒的纺锤体组装途径，利用大量无中心粒的微管组织中心（MTOC）^9,10。在减数分裂恢复时，核周的 MTOC 经历重凝聚、拉伸和碎裂为大量较小 MTOC 的三个不同步骤^11,12。碎裂后的 MTOC 随后被聚集并排序，以形成双极纺锤体^10,13,14。另一部分 MTOC 位于核膜破裂（NEBD）时期的细胞质中。其中一些细胞质 MTOC 迁移并形成纺锤体极（极性 MTOC，pMTOC）^10,11。最近发现细胞质中还存在另一类 MTOC，称为中期细胞质 MTOC（mcMTOC），其不参与纺锤体极的形成，而是在减数第一次分裂中期（Met I）保留在卵母细胞的细胞质中¹⁵。通过多光子激光消融去除 mcMTOC，或通过抑制自噬异常增加其数量，均会干扰纺锤体的定位与迁移，并提高减数第二次分裂中期卵母细胞非整倍体的发生率¹⁵。

有趣的是，mcMTOC 在多个方面不同于 pMTOC¹⁵例如，与主要起源于核周MTOC的pMTOC不同，mcMTOC起源于卵母细胞皮层。当纺锤体仍位于卵母细胞中心时，mcMTOC不对称地定位于纺锤体后续迁移以排出第一极体的相反一侧¹⁵. 星体样微管无法到达相对较大的卵母细胞的皮层。因此，这些mcMTOC成核微管以锚定纺锤体通过 星体样MTOC）定位至皮层。这些发现提示了一种模型，即由mcMTOC成核的微管产生的力可抵消由F-actin介导的、驱动纺锤体向皮层迁移的作用力。这两种相反作用力之间的平衡对于调控纺锤体的中心定位以及适时的纺锤体迁移至关重要¹⁵.

迄今为止，所有已研究的PMC蛋白（中心体周围蛋白、γ-微管蛋白、Cep192和Aurora激酶A）均定位于两种MTOC结构：mcMTOC和pMTOC¹⁵。因此，尚无化学或遗传方法可在不干扰pMTOC的情况下选择性破坏mcMTOC。这些局限性可通过使用激光消融技术选择性靶向mcMTOC来克服。在已开发的用于微消融的激光技术中，脉冲多光子飞秒激光因其作用精确局限于焦平面、近红外光具有较高的穿透深度，以及对细胞的光毒性与热损伤较小，展现出巨大潜力^16,17,18。本研究描述了一种利用与倒置显微镜耦合的多光子激光在小鼠卵母细胞中选择性消融mcMTOC的方法。

方案

本研究中所述所有方法均经密苏里大学动物护理质量保证委员会批准（参考编号 9695）。 Cep192-eGFP 本研究使用了6至8周龄的报告基因雌性小鼠。为生成 Cep192-eGFP 报告基因小鼠，通过CRISPR/Cas9介导的同源定向修复将EGFP报告基因整合至CF-1小鼠基因组中。EGFP报告基因与Cep192（MTOC的固有组分）的C末端融合¹⁵为维持小鼠品系，需进行纯合子繁殖 Cep192-eGfp 报告基因小鼠被使用。所有动物均饲养在笼子中（每笼最多四只），环境温度为21 °C，湿度为55%，光照周期为12小时光照/12小时黑暗， 随意摄取 食物和水的获取

1. 小鼠卵母细胞的收集

1. 准备培养基（Chatot、Ziomek 和 Bavister 的 CZB¹⁹，参见材料表），并在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育过夜。
   注：CZB 培养基可在 4 °C 保存 1 个月（培养基成分见补充文件 1）。
2. 在 CZB 培养基中添加谷氨酰胺（1 mM）和米力农（2.5 mM）（即 CZB + M）（参见材料表），并将其放入培养箱中。
   ​注：米力农是一种磷酸二酯酶抑制剂，可使卵母细胞停滞在第一次减数分裂前期，并阻止减数分裂的恢复²⁰。
3. 准备收集培养基（无碳酸氢盐的最低必需培养基 MEM），其中含 3 mg/mL 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、25 mM HEPES（pH 7.3）（补充文件 1）以及米力农（2.5 mM）（即 MEM/PVP + M，参见材料表）。
4. 准备收集和培养用培养皿，在 60 mm 培养皿中制备四个 100 µL 的收集培养基（MEM/PVP + M）微滴，在 35 mm 培养皿中制备两个 100 µL 的培养基（CZB + M）微滴，并用矿物油覆盖（参见材料表）。将收集用培养皿置于载物台加热器上，将培养用培养皿放入 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中。
5. 在卵母细胞收集前 44–48 小时，向性成熟（6–8 周龄）的Cep192-eGFP 报告基因雌性小鼠腹腔注射 5 IU 孕马血清促性腺激素（PMSG，参见材料表）。
6. 通过颈椎脱位法处死小鼠，识别并取出卵巢²¹，并将其转移至盛有预热至 37 °C 的收集培养基（MEM/PVP + M）的表面皿中。
7. 用 1 mL 注射器针头轻触表面皿底部固定卵巢，使用捆扎在一起的缝纫针反复穿刺卵巢数次（每侧卵巢约 40 次），以将卵母细胞释放到培养基中。
8. 使用塑料转移移液管，将步骤 1.7 中含有卵丘-卵母细胞复合体（COCs）的全部培养基转移至一个空的 100 mm 塑料培养皿中。
9. 在 体视显微镜下，使用巴斯德玻璃移液管收集 COCs，并将其转移至含有 MEM/PVP + M 的收集培养皿中。
10. 使用细口巴斯德玻璃移液管（直径约 100 µm），通过轻柔反复吹打机械去除卵母细胞的卵丘细胞，随后将其转移并洗涤于收集培养皿中的四个 100 µL 微滴 MEM/PVP + M 中，之后再转移至 CZB + M 培养培养皿中。
11. 将去卵丘的卵母细胞在 37 °C、含 5% CO₂ 的空气中孵育 1 小时。

2. 卵母细胞显微注射

1. 在100 mm塑料培养皿盖中加入250 µL MEM/PVP + M液滴，并用矿物油覆盖。
   注意：培养皿盖边缘较低，可为显微操作器的调节提供更大空间。
2. 开启显微注射系统（参见材料表）。
3. 将显微注射培养皿置于显微镜加热载物台上（37 °C）。
4. 使用微量进样吸头（参见材料表）将0.5 µL mCh-Cep192cRNA吸入注射针中，并将注射针固定于显微操作器上。
5. 将去透明带卵母细胞（步骤1.11）转移至250 µL微滴中（步骤2.1）。
6. 在20倍或40倍物镜下，根据卵母细胞的位置调整注射针和持卵针的位置与焦距（图1）。
7. 设置显微注射装置，调节注射压力（p_i）、补偿压力（p_c）和注射时间（t_i），以实现注入5–10 pl mCh-Cep192 cRNA（用于外源标记MTOC）。
8. 小心注射卵母细胞，避免触碰细胞核。
9. 完成所有卵母细胞注射后，将其在三滴CZB + M液滴中清洗，转移至培养皿（CZB + M）中，并在37 °C孵育3小时，以允许mCh-Cep192表达。

3. 卵母细胞成熟

1. 在37 °C、含5% CO₂的空气环境中，将CZB培养基预先平衡至少3小时，然后加入谷氨酰胺（1 mM），制备成熟培养液。
2. 在35 mm培养皿中制备两滴成熟培养液（每滴100 µL），并用矿物油覆盖（成熟培养皿）。
3. 将处于前期I停滞阶段的卵母细胞在100 µL不含米力农的CZB微滴中至少洗涤三次，以彻底去除米力农，促使减数分裂恢复。
4. 将卵母细胞转移至成熟培养皿中，在37 °C、含5% CO₂的湿润培养箱中孵育5小时（进入前期I中期阶段）。

4. 卵母细胞制备用于消融和成像

1. 将前期I的卵母细胞（步骤3.4）转移至含有100 µL成熟培养基（步骤3.1）并覆盖矿物油的玻璃底培养皿中。

5. 激光消融显微镜的准备工作

1. 消融前至少30分钟，打开载物台培养箱的温度控制器（参见材料表），并将其设定为37 °C。
2. 打开CO₂控制器，并将其设定为5% CO₂。
3. 选择40倍油浸消色差物镜，并滴加一小滴浸油。
4. 将含有卵母细胞的玻璃底培养皿安装到载物台培养箱上，并用气体盖板覆盖培养箱。
5. 在图像采集软件中（参见材料表），选择可保存多个载物台位置的选项（例如，"定义标记与定位实验"）。使用透射光明场照明，将单个卵母细胞居中，并保存其位置。
6. 在图像采集软件中，选择XYZ扫描模式，将图像格式设为256 × 256像素，变焦倍数设为2.5x - 3.0x，并选择扫描频率为600 Hz。这对应于约1.6 µs的像素驻留时间。
7. 将488 nm激发激光线设为激光功率的约10%（在样品水平上相当于4.0 µW）（参见材料表），并使用500–550 nm的光谱带宽观察MTOC中的GFP信号。为同时观察mCherry标记的Cep192的荧光信号，将585 nm激发激光线设为激光功率的约8%（在样品水平上相当于10.7 µW），并使用另一检测器设定在595–645 nm的光谱带宽。
   注：使用共聚焦显微镜的透射光检测器（TLD）可同时检测卵母细胞边界，有助于观察。
8. 使用活体扫描模式并手动控制z轴驱动，对卵母细胞中的MTOC进行扫描筛查。
9. 一旦检测到mcMTOC，围绕其绘制一个方形感兴趣区域（ROI）。

6. mcMTOCs 的消融

1. 将飞秒激光器设置为 740 nm 波长。
   注意：可根据显微镜和激光条件调整激光波长。
2. 使用多光子显微镜（见材料表）的电光调制器，将激光功率设置为 70%–80%，对应样品平面上的功率为 60–70 mW。
   注意：如果激光器配备飞秒脉冲补偿器，请使用其校正群延迟色散（GDD）。GDD 校正可降低实现高效 mcMTOC 消融所需的激光功率，并将对卵母细胞的光损伤降至最低。GDD 控制通常集成在商用多光子显微镜的图像采集软件中。
3. 采用与步骤 5.6 相同的图像格式、放大倍数和扫描频率。将线平均和帧平均参数设置为 1。
4. 在软件中点击扫描按钮，通过对选定 ROI 进行一次激光扫描来完成 mcMTOC 的消融。
5. 使用步骤 5.7 中的通道设置，通过比较多光子激光照射前后 GFP 标记结构的图像来评估消融效果。若消融成功，目标 mcMTOC 中 GFP 荧光强度将降低至背景水平。
6. 若仍有部分 GFP 标记结构残留，可在 mcMTOC 的不同 z 平面上重复步骤 6.4 一次或多次。
7. 使用步骤 5.7 中的通道设置，通过 mcMTOC 相关的 mCherry 信号（mCh-Cep192）完全消失来验证消融效率。
8. 重复步骤 5.8 至 6.7，直至卵母细胞中所有 MTOC（在不同焦平面）均被消融。
   注意：本方案采用mCh-Cep192显微注射作为策略，以确认多光子激光照射后 mcMTOC 的耗竭，并排除 GFP 荧光减弱由 GFP 光漂白所致的可能性。然而，该探针的显微注射为可选步骤，非消融操作所必需。

结果

多光子激光消融提供了一种高效选择性消融细胞内结构的方法。本研究采用多光子激光消融技术，选择性去除小鼠卵母细胞中的mcMTOC。激光消融能高效去除mcMTOC，表现为靶向mcMTOC内源性GFP荧光显著降低，降至与背景水平相当的程度。靶向mcMTOC中的外源性mCh-Cep192在激光消融后亦被完全消除。为确保卵母细胞内所有mcMTOC均被去除，应在卵母细胞内mcMTOC分布的不同焦平面（见图2）进行激光消融（见图3）。

图1：卵母细胞显微注射。对处于第一次减数分裂前期阻滞的小鼠卵母细胞显微注射mCh-Cep192 cRNA。比例尺：10 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：小鼠卵母细胞中 mcMTOC 的耗竭。 单一焦平面的代表性图像。白色方框标示了多光子激光消融前后 mcMTOC 的位置。比例尺：40 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3：小鼠卵母细胞不同焦平面处mcMTOC的耗竭。 经mcMTOC激光消融的小鼠卵母细胞的代表性最大投影图像。比例尺：20 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

补充文件1：Chatot、Ziomek和Bavister（CZB）培养基及无碳酸氢盐的最低必需培养基（MEM/PVP）的成分。 请点击此处下载该文件。

讨论

存在多种方法可用于干扰细胞内的细胞骨架相关结构^22,23,24,25。然而，要找到能够在不损害细胞活力的前提下选择性干扰靶向结构的有效技术仍具挑战性。本文介绍的多光子激光消融方法是一种高效策略，可在不影响卵母细胞活力的情况下，对卵母细胞内的mcMTOCs施加选择性机械扰动。

激光消融已被广泛用于研究有丝分裂和减数分裂过程中控制染色体分离的分子机制^22,23,26,27。由于哺乳动物卵母细胞的尺寸相对较大（直径>80 mm），与体细胞相比²⁸，对其细胞内结构进行消融构成了一项挑战。此外，减数分裂中期I卵母细胞中平均mcMTOC体积约为20 µm¹⁵，这进一步增加了操作难度。为了克服这些挑战，必须采用一种能够实现更深组织穿透的有效方法。使用多光子激光进行消融的主要优势在于其能够深入细胞内部，同时最大限度地减少脱靶效应²⁹。

为了验证激光消融法耗竭靶向结构的有效性和效率，建议使用荧光标记的蛋白来随时间识别靶向结构（消融前后）²³。需要注意的是，激光消融会整体耗竭mcMTOC这一结构；尽管较小的mcMTOC仅需一次激光照射即可耗竭，但较大的mcMTOC可能需要在不同焦平面上进行多次激光照射。还建议对一部分对照组和mcMTOC消融的卵母细胞进行固定并用MTOC标记物（如γ-微管蛋白、中心粒周围蛋白或Cep192）进行免疫标记，以进一步确认mcMTOC消融的效率。在对照组卵母细胞中，将对紧邻但不重叠mcMTOC的胞质区域进行激光照射。

该实验需要在卵母细胞内的不同焦平面之间移动时进行多次 mcMTOC 消融。因此，强烈建议在正式开展实验前多次练习此技术，以尽量缩短实验时间，从而提高卵母细胞的存活率。此外，应使用足以消除 mcMTOC 但又不影响卵母细胞存活率的最低激光功率。

该技术存在一些局限性。首先，多光子共聚焦显微镜的成本相对高于常规共聚焦显微镜。其次，对不同焦平面上的所有mcMTOC进行扰动比化学或遗传学扰动更为耗时。第三，本方案需要熟练的技术，以在尽可能短的时间内完成对所有mcMTOC的消融。然而，一旦掌握，多光子激光的使用为扰动小鼠卵母细胞中的多种细胞内结构（包括mcMTOC）提供了一种极佳的策略，有助于深入理解调控哺乳动物卵母细胞纺锤体定位及其适时迁移的分子机制。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4 英寸薄壁 GL 1.0 外径/0.75 内径	World precision instrument	TW100F-4	注射针
硼硅酸盐玻璃	Fisherbrand	货号# 13-678-20D
硼硅酸盐玻璃毛细管	World Precision Instrument	货号# TW100-6	持针器
牛血清白蛋白	MilliporeSigma	货号# A4503
Leica DMI6000 B 显微镜用培养箱	Life Imaging Services GmbH
氯化钙二水合物	MilliporeSigma	货号# C7902
CO2 控制器	Pecon	# 0506.000
CO2 高性能盖板	Pecon	# 0506.020
DL-乳酸	MilliporeSigma	货号# L7900
DMi8	Leica	N/A	显微镜
EDTA	MilliporeSigma	货号# E5134
Femtojet 4i	Eppendorf	N/A	显微注射仪
Femtotips 微载针	Fisher scientific	E5242956003
庆大霉素	MilliporeSigma	货号# G1272
庆大霉素	MilliporeSigma	货号# 1272
玻璃底培养皿	Mat Tek Corporation	货号# P35G-1.0-20-C
HEPES	MilliporeSigma	货号# H3784
HEPES 钠盐	MilliporeSigma	货号 # H3784
Hera Cell vios 160i	Thermo	N/A	CO2 培养箱
配备倒置支架 DMI6000 B 的 Leica TCP SP8 光谱激光扫描共聚焦显微镜	Leica Microsystems, Inc	N/A
L-谷氨酰胺	MilliporeSigma	货号#G8540
硫酸镁二水合物	MilliporeSigma	货号# M7774
MaiTai DeepSee 钛宝石飞秒激光器	Spectra-Physics	N/A
mCH-Cep192 cRNA		N/A
最低必需培养基 Eagle - MEM	MilliporeSigma	货号 #M0258
米力农	MilliporeSigma	货号# M4659
矿物油	MilliporeSigma	货号# M5310
最低必需培养基 Eagle (MEM)	MilliporeSigma	货号# M0268 - 1L
小鼠：Cep192-eGFP 报告基因 CF-1		N/A
培养皿 (100 mm)	Fisherbrand	货号# FB0875712
培养皿 (35 mm)	Corning	货号# 430165
培养皿 (60 mm)	Falcon	货号# 351007
酚红	MilliporeSigma	货号# P5530
聚乙烯吡咯烷酮	MilliporeSigma	货号# P2307
聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)	MilliporeSigma	货号# P2307
氯化钾	MilliporeSigma	货号# P5405
磷酸二氢钾	MilliporeSigma	货号# P5655
孕马血清促性腺激素´	Lee BioSolutions	货号# 493-10-10
丙酮酸	MilliporeSigma	货号# P4562
丙酮酸	MilliporeSigma	货号# P4562
缝纫针	D.M.C	N/A	N° 5 * 16 针
碳酸氢钠	MilliporeSigma	货号# S5761
氯化钠	MilliporeSigma	货号# S5886
台式加热插入件 P	Pecon	# 0426.300
Sterezoom S9i	Leica	N/A	体视显微镜
1 mL 注射器	BD company	货号# 309597
牛磺酸	MilliporeSigma	货号# T0625
温度控制器 Tempcontrol 37-2 数字式	Pecon	# 0503.000
用于培养箱的 Cube 温度控制器	Life Imaging Services GmbH