方法文章

一种高效透明化方案用于研究番茄（Solanum lycopersicum L.）种子发育

DOI：

10.3791/64445

⸱

2022年9月7日

 ,  , 
1Key Laboratory of Plant Molecular Physiology, Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, 2College of Life Science, University of Chinese Academy of Sciences, 3Innovative Academy of Seed Design, Chinese Academy of Sciences

本文内容

摘要

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番茄种子是研究植物繁殖过程中遗传学和发育生物学的重要模式材料。本方案适用于清除不同发育阶段的番茄种子，以观察更精细的胚胎结构。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

番茄（Solanum lycopersicum L.）是全球主要的经济作物之一。番茄种子是研究植物繁殖过程中遗传学和发育生物学的重要模式材料。由于种皮黏液、多细胞层的珠被以及厚壁的胚乳等结构的存在，对番茄种子内部精细胚胎结构的观察常常受到阻碍，传统上需要通过繁琐的包埋切片技术来解决。一种更简便的替代方法是采用组织透明技术，利用化学试剂使种子几乎变得透明。尽管传统的透明化方法能够深入观察种皮较薄的小型种子，但番茄种子的透明化在技术上仍具挑战性，尤其是在发育后期阶段。

本文介绍了一种快速且省力的透明化方法，可用于观察番茄开花后3至23天的种子发育过程，此时胚胎形态已基本完成。该方法结合了在Arabidopsis中广泛使用的水合氯醛透明液，并进行了多项优化，包括省去福尔马林-乙酸-酒精（FAA）固定步骤、增加次氯酸钠处理种子、去除软化的种皮黏液层，以及清洗和真空处理。该方法适用于不同发育阶段番茄种子的高效透明化，有助于以良好的空间分辨率全面监测突变体种子的发育过程。此透明化方案也可应用于茄科其他具有重要经济价值物种的深层成像研究。

引言

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番茄（S. lycopersicum L.）是全球最重要的蔬菜作物之一，2020年种植面积达510万公顷，产量达1.868亿吨的肉质果实1。它属于包含约2716个物种的大型茄科（Solanaceae）家族2，其中包括茄子、辣椒、马铃薯和烟草等多种具有重要经济价值的作物。栽培番茄为二倍体物种（2n = 2x = 24），基因组大小约为900 Mb3。长期以来，人们通过从野生茄属（Solanum spp.）植物中筛选优良性状，持续开展番茄的驯化与育种工作。番茄遗传资源中心列出了超过5000份番茄种质资源，全球保存的番茄种质材料超过8万份4。番茄在温室中为多年生植物，通过种子繁殖。成熟的番茄种子主要包括三个部分：发育完全的胚、残留的细胞型胚乳以及坚硬的种皮5,6（图1A）。在双受精之后，细胞型胚乳的发育早于合子的发育。大约在开花后5–6天（DAF），当胚乳含有6至8个细胞核时，首次可观察到两细胞原胚7。在醋栗番茄（Solanum pimpinellifolium）中，胚在开花后20天左右达到最终大小，种子在开花后32天具备萌发能力8。随着胚的发育，胚乳逐渐被吸收，仅在种子中残留少量胚乳。残留的胚乳包括包围胚根尖端的珠孔端胚乳，以及分布在种子其余部分的侧生胚乳9,10。外层种皮由珠被的外层表皮增厚并木质化形成，并与珠被残余的死亡组织层共同构成坚硬的外壳，以保护胚和胚乳5。

胚胎发育示意图；标注部分：子叶、胚根、下胚轴、茎尖分生组织。
图1：Solanum lycopersicum 和 Arabidopsis thaliana 成熟种子的示意图。（A）成熟番茄种子的纵剖解剖结构。（B）成熟拟南芥种子的纵剖解剖结构。成熟番茄种子的体积约为拟南芥种子的70倍。比例尺 = （A）400 µm，（B）100 µm。请点击此处查看此图的放大版本。

高质量番茄种子的产生依赖于胚胎、胚乳和母体种子组分之间的协调11。要解析种子发育过程中的关键基因和调控网络，需要对突变体种子进行深入且全程的表型记录。传统的包埋切片技术，如半薄切片和石蜡切片，已被广泛应用于番茄种子，以观察胚胎的局部精细结构12,13,14,15。然而，通过薄切片分析种子发育过程通常费时费力，且缺乏Z轴方向的空间分辨率。相比之下，组织透明化是一种快速高效的方法，可用于精确定位最可能发生胚胎发育缺陷的阶段16。透明化方法通过使用一种或多种生物化学试剂均一化组织的折射率，从而降低内部组织的不透光性16。整体组织透明化可在不破坏组织完整性的前提下实现对植物组织结构的观察，而透明化技术与三维成像的结合已成为获取植物器官形态和发育状态信息的理想方案17,18。多年来，种子透明化技术已应用于多种植物物种，包括Arabidopsis thaliana、Hordeum vulgare和Beta vulgaris19,20,21,22,23。其中，整体胚珠透明化技术因其体积小、种皮细胞为4-5层以及具有核型胚乳等特点，已成为研究Arabidopsis种子发育的有效方法24,25。随着不同透明化试剂组合的不断更新，例如Hoyer's溶液的出现26，尽管大麦胚珠的胚乳占据种子的大部分体积，其内部结构仍可被高度清晰地成像。甜菜的胚胎发育可通过透明化结合真空处理及盐酸软化的方法进行观察19。然而，与上述物种不同，目前尚未见有关利用透明化方案对番茄种子进行胚胎学观察的报道。这限制了对番茄胚胎及种子发育过程的深入研究。

水合氯醛常用作透明剂，可使浸入的组织和细胞在不同光学平面上清晰显示，并能显著保存细胞或组织成分27,28,29水合氯醛透明法已成功用于种子整体透明化处理，以观察胚胎和胚乳结构 拟南芥21,28. 然而，这种透明化溶液在清除番茄种子时效率较低，因为番茄种子的透性比 拟南芥 种子。物理屏障包括：（1）番茄珠被在授粉后3至15天具有近20层细胞30,31，（2）番茄的胚乳为细胞型，而非核型32，且（3）番茄种子的体积大约是其他种子的70倍33,34 （4）产生大量种皮黏液，阻碍透明试剂的渗透，影响胚胎细胞的观察。

因此，本报告提出了一种基于水合氯醛的优化透明化方法，适用于不同发育阶段番茄种子的整体透明化处理，可实现对胚胎发育过程的深层成像（图2）。

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方案

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1. 溶液的配制

  1. 在50 mL离心管中加入2.5 mL 37%甲醛、2.5 mL冰醋酸和45 mL 70%乙醇，配制FAA固定液。涡旋混匀后于4 °C保存。使用前新鲜配制FAA固定液。
    警告：37%甲醛具有腐蚀性，若接触或吸入可能具有致癌性。固定操作必须在通风橱中进行，并佩戴适当的个人防护装备。
  2. 在100 mL用锡箔纸包裹的玻璃瓶中加入5 mL 100%甘油、40 g水合氯醛和10 mL蒸馏水，配制透明溶液。室温下使用磁力搅拌器搅拌过夜至溶解。配制好的溶液可在4 °C保存最多6个月。
    警告：水合氯醛具有致癌性且有强烈刺激性气味。实验应在通风橱中进行，并佩戴适当的个人防护装备。水合氯醛在空气中易潮解，不应大量储存。透明溶液遇光易分解，应避光保存。
  3. 在50 mL离心管中加入10 mL 6%次氯酸钠、40 mL蒸馏水和50 µL Tween-20，配制消毒液。涡旋混匀后于室温保存。使用前新鲜配制消毒液。
    注意： 长期放置的次氯酸钠有效氯含量可能降低，可根据实际情况适当增加6%次氯酸钠的用量。 

2. 种子采集

  1. 在8 cm × 8 cm × 8 cm的方形育苗盆中播种番茄种子（S. lycopersicum L. cv. Micro-Tom，参见材料表），盆中填充体积比为1:1的花卉营养土与基质混合物（v/v）（参见材料表），于培养室中培养，培养条件为：光照/黑暗周期16/8 h，白天温度24 ± 2 °C，夜间温度18 ± 2 °C，相对湿度60%–70%，光照强度4,000 Lux。约6周后，植株进入开花期。
  2. 在花药散粉期（花瓣张开角度为90°）标记各单花的开花日期，并记录开花后天数（DAF）。
  3. 采集开花后3至23天（DAF）的番茄果实，并立即置于冰上。将开花后3至23天的果实（种子或胚）分为早期（3–10 DAF）、中期（11–16 DAF）和晚期（17–23 DAF）三类。
    注意：每次采集果实数量不宜过多，确保每个果实的种子在1小时内完成剥离，以便后续处理。
  4. 对于早期果实，切开果实后置于载玻片上，在体视显微镜（参见材料表）1×至4×放大倍数下，使用精密镊子小心收集新鲜种子；对于中期和晚期果实，切开果实后可直接使用精密镊子收集新鲜种子。

3. 基于水合氯醛的种子透明化

注意：本研究比较了常规35与优化后的方案在种子透明化效率方面的表现。

  1. 使用常规方案进行透明化处理
    1. 将新鲜种子（步骤 2.4 中获得）立即放入含有 1.5 mL FAA 固定液的 2 mL 离心管中，在摇床（5 rpm，参见材料表）上室温孵育 4 小时。
    2. 在摇床（5 rpm）上依次使用 70%、95% 和 100% 乙醇（v/v）进行脱水处理，每步 1 小时。
    3. 将种子置于载玻片上 3–5 滴透明化溶液（约 100 µL）中，轻轻加盖盖玻片。对于中期和晚期种子，更换为单凹载玻片（参见材料表）。
    4. 根据种子材料的发育阶段，将这些载玻片或单凹载玻片在室温下放置 30 分钟（授粉后 3 天，3 DAF）、2 小时（6 DAF）、1 天（9 DAF）、3 天（12 DAF）或 7 天（14 至 22 DAF）（材料越幼嫩，透明化速度越快）。
    5. 使用配备数码相机的微分干涉差显微镜（DIC 显微镜）（参见材料表），在 10×、20× 和 40× 放大倍数下观察样品。针对每个样品实时调节透射光亮度、DIC 滑块和聚光镜光圈，并采集图像。
  2. 使用优化方案进行透明化处理
    1. 将新鲜种子（步骤 2.4 中获得）直接放入含有 1.5 mL 消毒液（步骤 1.3）的 2 mL 离心管中。
      注：收集到 2 mL 离心管中的种子数量取决于种子的发育阶段。详细信息见表 1。
    2. 在摇床（30 rpm）上室温孵育 3 至 50 分钟，直至最内层种皮轮廓清晰可见。弃去消毒液。
      注：所需孵育时间取决于种子发育阶段（种子越成熟，所需孵育时间越长）。详细信息见表 1。
    3. 对于中期和晚期种子，在体视显微镜下（1× 至 4× 放大倍数）用镊子和解剖针将种子转移至载玻片上，并去除种子黏液层，然后用镊子将种子重新转移回原离心管中。
      注：此步骤对早期种子非必需。
    4. 用 1.5 mL 去离子水清洗种子 5 次，每次 10 秒。弃去去离子水。
    5. 加入体积为种子体积 2 倍的透明化溶液，随后使用真空泵（参见材料表）进行 0 至 50 分钟的真空处理（表 1）。采用间歇式真空处理，每次抽真空 10 分钟，间隔 10 分钟。
    6. 更换为新鲜的透明化溶液（体积为种子体积的 2 倍）。将含有种子的 2 mL 离心管置于室温、避光条件下孵育 30 分钟至 7 天，以促进透明化（表 1）。在孵育期间，对于晚期胚，需每日更换新鲜透明化溶液，并对种子进行 10 分钟真空处理。
    7. 将透明化完成的种子置于载玻片或单凹载玻片上，使用配备数码相机的 DIC 显微镜在 10×、20× 和 40× 放大倍数下观察。针对每个样品实时调节透射光亮度、DIC 滑块和聚光镜光圈，并采集图像。

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结果

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当番茄种子使用传统方法进行透明处理时 拟南芥，致密的胚乳细胞阻碍了对授粉后3天和6天早期番茄胚胎的观察（图3A,B）。随着胚胎总体积的增加，在授粉后9天（9 DAF）几乎难以分辨出球形胚胎。图3C）。然而，随着种子尺寸的持续增大，其通透性降低，导致在授粉后12天（12 DAF）时出现模糊的心形胚。图3D）。从13 DAF开始，种子黏液和种皮逐渐变得致密，阻碍了透明剂的渗透。即使将处理时间延长至7天，14-19 DAF种子内部胚的轮廓仍然极为模糊。图3E-G）。在22天后授粉（DAF）的种子中，种子内部结构完全不可见（图 3H).

因此，对传统的基于水合氯醛的透明方法进行...

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讨论

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与机械切片相比，透明化技术在三维成像方面更具优势，因其能够保持植物组织或器官的完整性16传统的透明化处理方案通常仅限于小样本，因为化学溶液更容易渗透。番茄种子是组织透明化处理中较难处理的样本，因其体积约为 拟南芥 种子大小不一，且具有更多的通透性屏障。 拟南芥 种皮由四到五层活细胞构成，这些细胞来源于外珠被和内珠被24。然而，与 拟南芥，番茄种皮在球形胚阶段有22-27层薄壁细胞6番茄种皮的最内层由栓皮质组成，被称为半透层，已被证实可阻碍水溶性化合物的移动38此外，富含多糖的种子黏液具有高黏度和显著较低的通透性，阻碍了透明溶液的渗透。番茄种子种皮中富含色素，也会降低成像质量。35,36,37历史上，色素的去除通...

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披露

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作者声明无利益冲突。

致谢

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作者感谢乐杰博士和宋秀芬博士分别在微分干涉相差显微镜和传统透明化方法方面提供的有益建议。本研究由国家自然科学基金（31870299）和中国科学院青年创新促进会资助。图 2 使用 BioRender.com 制作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1,000 µL 移液器GILSONFA10006M
1,000 µL 移液器吸头CorningT-1000-B
2 ml 离心管AxygenMCT-200-C
37% 甲醛DAMAO685-2013
5,000 µL 移液器Eppendorf3120000275
5,000 µL 移液器吸头biosharpBS-5000-TL
50 ml 离心管Corning430829
无水乙醇BOYUAN678-2002
玻璃瓶FisherFB800-100
水合氯醛MeryerM13315-100G
盖玻片Leica384200
DIC 显微镜ZeissAxio Imager A110x、20x 和 40x 放大倍数
消毒剂QIKELONGAN17-9185
解剖针Bioroyee17-9140
花卉营养土FANGJIE
镊子HAIOU4-94
冰醋酸BOYUAN676-2007
甘油SolarbioG8190
磁力搅拌器IKARET basic
Micro-TomTomato Genetics Resource CenterLA3911
旋转摇床QILINBEIERQB-206
播种基质PINDSTRUPLV713/018-LV252筛分：0–10 mm
单凹载玻片HUABODEYIHBDY1895
载玻片Leica3800381
体视显微镜LeicaS8 APO1x 至 4x 放大倍数
锡箔纸ZAOWUFANG613
Tween 20SigmaP1379
真空泵SHIDINGSHB-III
涡旋振荡器SilogexMX-S

参考文献

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