一种用于研究番茄种子发育的有效清除方案（Solanum lycopersicum L.）

Summary

番茄种子是研究植物繁殖过程中遗传学和发育生物学的重要模型。该协议可用于清除不同发育阶段的番茄种子以观察更精细的胚胎结构。

Abstract

番茄（Solanum lycopersicum L.）是全球主要的经济作物之一。番茄种子是研究植物繁殖过程中遗传学和发育生物学的重要模型。番茄种子内更精细的胚胎结构的可视化通常受到种皮粘液、多细胞分层外皮和厚壁胚乳的阻碍，这需要通过费力的包埋切片来解决。更简单的替代方案是采用组织清除技术，使用化学试剂使种子几乎透明。虽然传统的清除程序可以深入了解具有较薄种皮的较小种子，但清除番茄种子在技术上仍然具有挑战性，尤其是在发育后期阶段。

这里介绍的是一种快速且省力的清除方案，用于观察开花后 3 至 23 天胚胎形态接近完成时的番茄种子发育。该方法将广泛用于 拟南芥 的水合氯醛澄清溶液与其他修饰相结合，包括省略福尔马林 - 乙酰醇（FAA）固定，添加次氯酸钠处理种子，去除软化的种皮粘液以及洗涤和真空处理。该方法可用于不同发育阶段番茄种子的高效清除，有助于全面监测突变种子的发育过程，具有良好的空间分辨率。该清除协议也可以应用于茄科其他商业重要物种的深度成像。

Introduction

番茄（番茄 ）是世界上最重要的蔬菜作物之一，2020年产量为1.868亿吨肉质水果，面积达510万公顷^1。它属于大型茄科，约有2，716种²，包括许多具有重要商业意义的作物，如茄子，辣椒，马铃薯和烟草。栽培番茄是一种二倍体物种（2n = 2x = 24），基因组大小约为900 Mb³。长期以来，通过从野生茄属中选择理想的性状，在番 茄 驯化和育种方面做出了巨大努力。番茄遗传学资源中心列出了 5，000 多种番茄种质，全球储存了 80，000 多种番茄种质⁴.番茄植株在温室中多年生，通过种子繁殖。成熟的番茄种子由三个主要隔室组成:一个成熟的胚胎、残留的细胞型胚乳和一个坚硬的种皮^5，6 （图 1A）。双重受精后，细胞型胚乳的发育先于受精卵的发育。在开花后~5-6天（DAF），当胚乳由6至8个细胞核7组成时，首先观察到双细胞前^胚。在 茄子松中，胚胎在20 DAF后接近其最终大小，种子在32 DAF⁸后可以发芽。随着胚胎的发育，....

Protocol

1. 溶液的制备

1. 通过在 50 mL 离心管中加入 2.5 mL 37% 甲醛、2.5 mL 冰醋酸和 45 mL 70% 乙醇来制备 FAA 固定剂。涡旋并将其储存在4°C。 使用前新鲜制备FAA固定剂。
   注意:37%的甲醛具有腐蚀性，如果暴露或吸入，可能会致癌。固定剂必须在通风橱中进行，同时穿戴适当的个人防护设备。
2. 通过在用锡箔包裹的 100 mL 玻璃瓶中加入 5 mL 100% 甘油、40 g 水合氯醛和 10 mL 蒸馏水来制备透明溶液。使用磁力搅拌器在室温下溶解过夜。制备的溶液可以在4°C下储存长达6个月。
   注意:水合氯醛具有致癌性，有刺激性气味。在通风橱中进行实验并穿戴适当的个人防护设备。水合氯醛在空气中易潮解，不宜大量储存。清除溶液暴露在光线下会分解，应避光。
3. 通过在 50 mL 离心管中加入 10 mL 6% 次氯酸钠、40 mL 蒸馏水和 50 μL 吐温-20 来制备消毒剂溶液。涡旋并在室温下储存。使用前新鲜准备消毒液。
   注:放置时间较长的次氯酸钠有效氯含量可能会降低，可根据实际情况增加6%次氯酸钠的含量。

2. 种子采集

1. 播种番茄种子（S. lycopersicum L. cv. Micro-Tom，见 材料表）在8厘米×8厘....

Results

当使用拟南芥等常规方法清除番茄种子时，致密的胚乳细胞在3 DAF和6 DAF下阻止了早期番茄胚胎的可视化（图3A，B）。随着胚胎总体积的增加，球状胚胎在9 DAF处几乎无法区分（图3C）。然而，随着种子尺寸的不断增加，其渗透性降低，导致12 DAF处的心脏胚胎模糊（图3D）。从13 DAF开始，种子粘液和种皮逐渐致密，防止清除剂渗透。即使将治疗时间延长到7天，14-19个DAF种子内的胚胎轮廓也非常模糊（图3E-G）。在22个DAF种子中，种子的内部结构完全不可见（图3H）。

因此，对传统的基于水合氯醛的清除程序进行了优化，以实现番茄种子的高效清除。 表.......

Discussion

与机械切片相比，清除技术对于三维成像更有利，因为它保留了植物组织或器官的完整性¹⁶。由于化学溶液更容易渗透，传统的澄清方案通常仅限于小样品。番茄种子是组织清除的一个有问题的样品，因为它的大小比拟南芥种子大约 70 倍，并且具有更多的渗透屏障。拟南芥种皮由四到五个活细胞层组成，这些活细胞层来自外皮和内皮²⁴。然而，与拟南芥相比，番茄种皮中有22-27个实质细胞层（在球状胚胎阶段）^6。番茄种皮的最内层由木栓蛋白组成，被称为半透层，已被证明是水溶性化合物³⁸运动的屏障。此外，富多糖种子粘液表现出高粘度和显著低渗透性，阻碍了澄清液的渗透。番茄富含色素的种皮也会降低图像质量³⁵，^36，37。从历史上看，色素的去除是通过应.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,000 和微;L 移液器	GILSON	FA10006M
1,000 & 微量;L 移液器吸头	康宁	T-1000-B
2 ml 离心管	Axygen	MCT-200-C
37% 甲醛	DAMAO	685-2013
5,000 &微量;L 移液器	Eppendorf	3120000275
5,000 µL 移液器吸头	biosharp	BS-5000-TL
50 ml 离心管	康宁	430829
无水乙醇	博源	678-2002
瓶玻璃	Fisher	FB800-100
水合氯醛	Meryer	M13315-100G
盖玻片	Leica	384200
DIC 显微镜	蔡司	Axio Imager A1	10 倍、20 倍和 40 倍放大
消毒剂	奇科隆眼	17-9185
解剖针	Bioroyee	17-9140
花营养土	芳洁
镊	HAIOU	4-94
冰醋酸	博源	676-2007
甘油	Solarbio	G8190
磁力搅拌器	IKA	RET basic
Micro-Tom	番茄遗传学资源中心	LA3911
轨道摇床	QB-206
播种底物	PINDSTRUP	LV713/018-LV252	筛选：0-10 mm
单凹玻片	HUABODEYI
载玻片	徕卡	3800381
体视显微镜	徕卡	S8 APO	1x 至 4 倍放大倍率
锡箔	ZAOWUFANG	613
吐温 20	西格玛	P1379
真空泵	SHIDING	SHB-III
涡街仪	Silogex	MX-S