一种高效透明化方案用于研究番茄（Solanum lycopersicum L.）种子发育

摘要

番茄种子是研究植物繁殖过程中遗传学和发育生物学的重要模式材料。本方案适用于清除不同发育阶段的番茄种子，以观察更精细的胚胎结构。

摘要

番茄（Solanum lycopersicum L.）是全球主要的经济作物之一。番茄种子是研究植物繁殖过程中遗传学和发育生物学的重要模式材料。由于种皮黏液、多细胞层的珠被以及厚壁的胚乳等结构的存在，对番茄种子内部精细胚胎结构的观察常常受到阻碍，传统上需要通过繁琐的包埋切片技术来解决。一种更简便的替代方法是采用组织透明技术，利用化学试剂使种子几乎变得透明。尽管传统的透明化方法能够深入观察种皮较薄的小型种子，但番茄种子的透明化在技术上仍具挑战性，尤其是在发育后期阶段。

本文介绍了一种快速且省力的透明化方法，可用于观察番茄开花后3至23天的种子发育过程，此时胚胎形态已基本完成。该方法结合了在Arabidopsis中广泛使用的水合氯醛透明液，并进行了多项优化，包括省去福尔马林-乙酸-酒精（FAA）固定步骤、增加次氯酸钠处理种子、去除软化的种皮黏液层，以及清洗和真空处理。该方法适用于不同发育阶段番茄种子的高效透明化，有助于以良好的空间分辨率全面监测突变体种子的发育过程。此透明化方案也可应用于茄科其他具有重要经济价值物种的深层成像研究。

引言

番茄（S. lycopersicum L.）是全球最重要的蔬菜作物之一，2020年种植面积达510万公顷，产量达1.868亿吨的肉质果实¹。它属于包含约2716个物种的大型茄科（Solanaceae）家族²，其中包括茄子、辣椒、马铃薯和烟草等多种具有重要经济价值的作物。栽培番茄为二倍体物种（2n = 2x = 24），基因组大小约为900 Mb³。长期以来，人们通过从野生茄属（Solanum spp.）植物中筛选优良性状，持续开展番茄的驯化与育种工作。番茄遗传资源中心列出了超过5000份番茄种质资源，全球保存的番茄种质材料超过8万份⁴。番茄在温室中为多年生植物，通过种子繁殖。成熟的番茄种子主要包括三个部分：发育完全的胚、残留的细胞型胚乳以及坚硬的种皮^5,6（图1A）。在双受精之后，细胞型胚乳的发育早于合子的发育。大约在开花后5–6天（DAF），当胚乳含有6至8个细胞核时，首次可观察到两细胞原胚⁷。在醋栗番茄（Solanum pimpinellifolium）中，胚在开....

方案

1. 溶液的配制

1. 在50 mL离心管中加入2.5 mL 37%甲醛、2.5 mL冰醋酸和45 mL 70%乙醇，配制FAA固定液。涡旋混匀后于4 °C保存。使用前新鲜配制FAA固定液。
   警告：37%甲醛具有腐蚀性，若接触或吸入可能具有致癌性。固定操作必须在通风橱中进行，并佩戴适当的个人防护装备。
2. 在100 mL用锡箔纸包裹的玻璃瓶中加入5 mL 100%甘油、40 g水合氯醛和10 mL蒸馏水，配制透明溶液。室温下使用磁力搅拌器搅拌过夜至溶解。配制好的溶液可在4 °C保存最多6个月。
   警告：水合氯醛具有致癌性且有强烈刺激性气味。实验应在通风橱中进行，并佩戴适当的个人防护装备。水合氯醛在空气中易潮解，不应大量储存。透明溶液遇光易分解，应避光保存。
3. 在50 mL离心管中加入10 mL 6%次氯酸钠、40 mL蒸馏水和50 µL Tween-20，配制消毒液。涡旋混匀后于室温保存。使用前新鲜配制消毒液。
   注意： 长期放置的次氯酸钠有效氯含量可能降低，可根据实际情况适当增加6%次氯酸钠的用量。 

2. 种子采集

1. 在8 cm × 8 cm × 8 cm的方形育苗盆中播种番茄种子（S. lycopersicum L. cv. Micro-To....

结果

当番茄种子使用传统方法进行透明处理时 拟南芥，致密的胚乳细胞阻碍了对授粉后3天和6天早期番茄胚胎的观察（图3A,B）。随着胚胎总体积的增加，在授粉后9天（9 DAF）几乎难以分辨出球形胚胎。图3C）。然而，随着种子尺寸的持续增大，其通透性降低，导致在授粉后12天（12 DAF）时出现模糊的心形胚。图3D）。从13 DAF开始，种子黏液和种皮逐渐变得致密，阻碍了透明剂的渗透。即使将处理时间延长至7天，14-19 DAF种子内部胚的轮廓仍然极为模糊。图3E-G）。在22天后授粉（DAF）的种子中，种子内部结构完全不可见（图 3H).

因此，对传统的基于水合氯醛的透明方法进行.......

讨论

与机械切片相比，透明化技术在三维成像方面更具优势，因其能够保持植物组织或器官的完整性¹⁶传统的透明化处理方案通常仅限于小样本，因为化学溶液更容易渗透。番茄种子是组织透明化处理中较难处理的样本，因其体积约为 拟南芥 种子大小不一，且具有更多的通透性屏障。 拟南芥 种皮由四到五层活细胞构成，这些细胞来源于外珠被和内珠被²⁴。然而，与 拟南芥，番茄种皮在球形胚阶段有22-27层薄壁细胞⁶番茄种皮的最内层由栓皮质组成，被称为半透层，已被证实可阻碍水溶性化合物的移动³⁸此外，富含多糖的种子黏液具有高黏度和显著较低的通透性，阻碍了透明溶液的渗透。番茄种子种皮中富含色素，也会降低成像质量。^35,36,37历史上，色素的去除通.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1,000 µL 移液器	GILSON	FA10006M
1,000 µL 移液器吸头	Corning	T-1000-B
2 ml 离心管	Axygen	MCT-200-C
37% 甲醛	DAMAO	685-2013
5,000 µL 移液器	Eppendorf	3120000275
5,000 µL 移液器吸头	biosharp	BS-5000-TL
50 ml 离心管	Corning	430829
无水乙醇	BOYUAN	678-2002
玻璃瓶	Fisher	FB800-100
水合氯醛	Meryer	M13315-100G
盖玻片	Leica	384200
DIC 显微镜	Zeiss	Axio Imager A1	10x、20x 和 40x 放大倍数
消毒剂	QIKELONGAN	17-9185
解剖针	Bioroyee	17-9140
花卉营养土	FANGJIE
镊子	HAIOU	4-94
冰醋酸	BOYUAN	676-2007
甘油	Solarbio	G8190
磁力搅拌器	IKA	RET basic
Micro-Tom	Tomato Genetics Resource Center	LA3911
旋转摇床	QILINBEIER	QB-206
播种基质	PINDSTRUP	LV713/018-LV252	筛分：0–10 mm
单凹载玻片	HUABODEYI	HBDY1895
载玻片	Leica	3800381
体视显微镜	Leica	S8 APO	1x 至 4x 放大倍数
锡箔纸	ZAOWUFANG	613
Tween 20	Sigma	P1379
真空泵	SHIDING	SHB-III
涡旋振荡器	Silogex	MX-S