我们报道了一种用于直立式受激拉曼散射显微镜透射信号检测的台面式灵活环境培养室，可用于活细胞的延时成像。利用该系统，以3分钟的时间间隔，对经油酸处理长达24小时的SKOV3细胞中的脂滴进行了成像。
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本文内容
摘要
摘要
受激拉曼散射（SRS）显微镜是一种无标记的化学成像技术。SRS 已被用于多种生物和生物医学应用中的活细胞成像。然而，长期延时 SRS 活细胞成像尚未得到广泛应用。SRS 显微镜通常采用高数值孔径（NA）的水浸物镜和高 NA 的油浸聚光镜，以实现高分辨率成像。在这种情况下，物镜与聚光镜之间的间隙仅有几毫米。因此，大多数商用台面环境培养舱由于其带有刚性玻璃盖且厚度较大，无法用于 SRS 成像。本文介绍了一种柔性培养舱的设计与制作方法，该培养舱可用于直立式显微镜平台上基于透射 SRS 信号检测的延时活细胞成像。该培养舱的柔韧性通过使用一种柔软材料——薄天然橡胶膜来实现。这种新型封闭结构和培养舱设计可方便地集成到现有的 SRS 成像系统中。测试与初步结果表明，该柔性培养舱系统能够实现稳定、长期的延时 SRS 活细胞成像，未来可应用于多种生物成像研究。
引言
光学显微镜用于观察样品的微观结构。与其他技术相比，光学成像速度更快，侵入性更小，破坏性更低1。活细胞成像技术结合光学显微镜，可用于长期动态观察培养中的活细胞2。不同类型的光学对比方式可提供关于生物样品的独特信息。例如，光学相位显微镜能够显示样品内折射率的细微差异3。荧光显微镜则被广泛用于对特定生物分子或细胞器进行成像。然而，荧光的宽谱激发和发射光谱通常在多色成像时导致光谱重叠4。荧光分子对光敏感，在长期、周期性的光照下可能发生漂白。此外，荧光标记可能改变分子在细胞内的生物分布5。受激拉曼散射（SRS）显微镜是一种无需标记的化学成像技术6。SRS的对比度依赖于特定化学键的振动跃迁。化学键的振动频率通常具有较窄的光谱带宽，因此可在同一样品中实现多个拉曼波段的成像7。SRS显微镜是活细胞成像的独特工具，能够在无需标记的情况下提供多种化学对比信息8。
尽管无标记细胞的受激拉曼散射（SRS）成像已被用于多项研究，但活细胞的长期延时SRS成像尚未得到广泛应用。其中一个原因是商用开放式培养腔室因厚度较大，无法直接用于SRS成像9,10,11,12。这些带有玻璃盖的腔室主要针对使用单个高数值孔径（NA）物镜和背向检测方式的明场或荧光成像而设计。然而，SRS成像更倾向于采用透射式检测，需同时使用高NA物镜和高NA聚光镜，这导致物镜与聚光镜之间仅留有极短的间隙（通常为几毫米）。为解决这一问题，我们设计了一种采用柔性软材料的培养腔室，可在正置显微镜系统上实现活细胞的延时SRS成像。在此设计中，浸水物镜被封装于柔性腔室内，可在三维空间中自由移动，以实现聚焦和成像功能。
培养大多数哺乳动物细胞的最适温度为 37 °C，而室温通常比此温度低 10 °C。温度高于或低于 37 °C 均会显著影响细胞生长速率13因此，活细胞成像系统需要对细胞培养环境进行温度控制。已知温度不稳定会导致长时间成像过程中的失焦问题。14为了实现稳定的37 °C环境，我们构建了一个大型封闭培养室，覆盖整个显微镜框架，并在显微镜下方设有隔热层（图1）。在较大的温度控制室内部，小型柔性腔室有助于精确维持生理湿度和pH值 通过 补充5% CO的受控气流2 (图2）。通过测量培养室的温度和湿度，确认双室设计可为长期、周期性SRS成像下的细胞生长提供最佳的细胞培养条件。图3）。随后，我们展示了该系统在SKOV3癌细胞中进行脂滴（LDs）延时成像与追踪的应用。图4, 图5，以及 图6).
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方案
1. 构建显微镜环境封闭装置
注意：该大型显微镜环境封闭装置用于控制显微镜主体及成像环境的温度，使其稳定在 37 °C（图 1A）。
- 使用记号笔在光学平台上标记SRS显微镜框架和电动载物台支脚的位置。在显微镜的振镜扫描器前方安装两个虹膜光阑，并调节位置，使泵浦激光束和斯托克斯激光束穿过虹膜光阑的中心。
- 将显微镜框架和载物台从光学平台上移开。
- 将硅橡胶垫片（尺寸：31 × 29 英寸，厚度：1/8 英寸）平铺在光学平台上（图1B）。
- 使用刀具沿标记线切割硅橡胶，移除小块橡胶碎片，并将方形云母陶瓷片（尺寸：6 × 6 英寸，厚度：1/4 英寸）放入相同位置。
注：云母陶瓷是一种易于加工的材料15。其硬度与铝相当，但具有优异的热绝缘性能。使用云母陶瓷片可阻止金属显微镜框架和载物台向不锈钢光学平台传热。应在云母陶瓷片上钻若干通孔，以便使用¼-20螺钉固定框架和载物台的支脚。 - 将显微镜框架和载物台重新放回光学平台，仔细对齐支脚与标记线上的云母陶瓷片位置，并使用¼-20螺钉将框架和载物台固定在平台上。
- 重新校准SRS光路。调节镜片1和镜片2的镜架，使激光束穿过两个预装虹膜光阑的中心（图2）。
注：本研究中用于活细胞成像的自制SRS显微镜的技术细节已有先前报道16。泵浦光束和斯托克斯光束的脉宽约为3–4 ps（经玻璃棒色散补偿）。系统由ScanImage17软件控制。 - 在此热绝缘基座上，使用五块大尺寸聚碳酸酯板（尺寸：31 × 29 × 28 英寸，厚度：0.25 英寸）组装环境控制箱，覆盖整个显微镜框架。
注： enclosure箱体的尺寸根据显微镜框架和载物台的尺寸确定。在安装柔性培养腔和加载细胞培养皿时，需暂时移除显微镜enclosure箱体的前方面板。- 组装enclosure时，需对每块聚碳酸酯板的边缘进行简单的机械加工，包括切割、钻孔和攻丝。在enclosure的左右侧板上各切割一个直径为2.6英寸的圆孔，用于安装进气管和出气管；在背板上切割一个直径为5 mm的小孔，供激光束进入enclosure内部。
- 使用铝箔胶带密封箱体的边缘和接缝处。
- 将柔性风管连接至enclosure箱体的进气口和出气口，使加热模块泵送并控制的温热气流可在箱内循环。将加热模块的温度传感器置于细胞培养和成像所用的柔性培养腔内，并将目标温度设定为37 °C。
注：可使用扩散器以实现环境控制箱内更均匀的气流分布。
2. 组装柔性培养室
- 使用三个紧定螺钉将加工好的空心圆柱形铝件1（材料：6061铝合金）安装到物镜的转盘上（图2）。
- 使用四个¼-20螺钉将加工好的空心圆柱形铝件2安装到样品 holder 上（图2）。
注意：样品 holder 必须经过改装以适配50 mm盖玻片底细胞培养皿。使用1-7/8英寸的开孔锯在样品 holder 中心钻一个通孔，然后使用50 mm开孔锯对该孔进行沉孔加工，保持通孔深度约为1 mm。 - 将装有铝件2的样品 holder 安装到电动载物台上，并用螺钉固定。
- 将天然橡胶薄膜套筒（厚度：0.01英寸；使用氰基丙烯酸酯胶水粘接）置于两个加工铝件之间，并在两端使用橡胶圈固定。
- 使用合适的管路和连接件将压缩CO2气瓶连接至气体混合模块，将CO2输入压力设定为20–25 psi。利用内置的CO2传感器和控制器，确保气体混合模块可将5% CO2精确调节并混入气流中。使用在线过滤器净化气流。
- 使用合适的管路和连接件，将混合气体（含5% CO2）引导至放置在加热板上的预灭菌水瓶，再将加湿后的气体导入柔性培养室。将加热板温度设定为37 °C，使气流在温水中鼓泡，以提高气流的湿度。
3. 时间延时活细胞SRS成像实验的准备
- 用70%乙醇擦拭柔性培养室的所有部件，包括鼻托、浸水物镜和样品架。
- 将紫外灯置于培养室内，照射20至30分钟，对整个封闭系统进行去污染处理。
注意：出于安全考虑，紫外消毒过程中请勿停留在实验室房间内。 - 在常规培养箱中，于正常生理条件下将SKOV3细胞在50 mm玻璃底培养皿中培养12小时。
注意：SKOV3细胞培养18应在标准生物安全柜中开始。 - 通过拧下螺丝，将加工好的铝制部件2从样品架上拆下。
注意：这是打开柔性培养室以装载细胞培养皿的方法。 - 装载细胞培养皿。在放置培养皿前，切记在聚光镜顶部添加浸油。取下培养皿盖，并使用夹具固定培养皿。
注意：为避免污染，所有操作均应戴手套进行。 - 将物镜浸入细胞培养液中进行粗调焦。将铝制部件2放下，以封闭柔性培养室，并用螺丝将其固定在样品架上。
注意：铝制部件2底部附有2 mm厚的硅橡胶垫，用于紧密密封间隙。 - 设置气体供应，提供5% CO2和19% O2，气流速率为200 cc/min，以维持正常细胞培养。
注意：可使用较低的气流速率，具体取决于柔性培养室的密封程度。
4. 进行时间序列活细胞受激拉曼散射成像实验
- 将激光波长调节至 805 nm，以靶向 2854 cm⁻¹-1 拉曼位移，归因于CH的振动2 化学键。使用低激光功率以减少对细胞的光损伤。按照本方案，进行长期活细胞成像时，泵浦激光的平均功率约为15 mW，斯托克斯激光（固定在1,045 nm）的平均功率约为7.5 mW。
注意：较高的激光功率可获得更好的受激拉曼散射（SRS）成像质量，但过高的激光功率会导致活细胞光损伤。图像质量与光损伤之间存在权衡。 - 调节物镜并聚焦，以获得良好的SRS细胞成像 焦点 按钮 主要控制装置 软件面板。为执行快速聚焦，请设置 像素数量 是 512 × 512 像素 与一个 像素驻留时间 的 4.8 µs 在 配置 面板
- 设置 锁相 放大器输入范围 （通常 5 mV) 为最大信号电压的两倍。设置 低通滤波器 与像素驻留时间相同（4.8 µs).
注意：不同的实验室自制SRS系统可能采用不同的数据采集设置。 - 在获得良好聚焦后，设置 成像分辨率 是 2,048 × 2,048 像素 对于一个 175 µm2 视野 以获取高质量图像。检查 保存 功能在 主要控制装置 面板并检查 SRS 通道 在 频道 面板。设置 间隔时间 在两帧之间 180 s （3 分钟）在 主控通道. 设置 采集编号 到 480 用于持续24小时的延时成像。
注意：较低的成像 可根据实验目的使用不同的分辨率。 - 使用自动化成像系统开始图像采集 LOOP 功能 在 主要控制装置 面板
注意：检查成像开始的第一个小时内是否存在因温度不稳定导致的焦平面漂移。首小时内的成像可能不稳定。在延时成像过程中，每2-3小时检查一次聚焦情况。 - 使用 ImageJ 处理采集的图像19. 采用以下两种方法进行脂滴（LD）定量：（i）脂滴/细胞体面积比，（ii）总脂滴的受激拉曼散射（SRS）强度均值。通过在2,854 cm⁻¹的SRS图像中对非细胞像素进行阈值分割并置零，测量细胞体面积。-1通过在SRS图像中对脂滴区域进行阈值设定并使非脂滴像素归零，测量脂滴的面积和强度。
注意：有关SRS图像处理的更多细节此前已有报道16.
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结果
我们制备并组装了用于延时SRS成像的柔性培养室系统（图1 和 图2），随后评估了该系统的性能。显微镜环境封闭腔内的温度在1小时内达到预期的37 °C，且未显著影响室温（图3A）。柔性培养室内的温度在1.5小时内达到37 °C，并能稳定维持在37 °C至少24小时（图3B）。柔性培养室内的相对湿度在1小时内可达85%，之后可维持至少24小时（图3C）。实测的温度和湿度数据证实，该系统可为细胞的长期生长提供最佳环境。
利用受激拉曼散射（SRS）进行的活细胞成像已广泛应用于多种生物学与生物医学研究20,21,22
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讨论
时间延时活细胞SRS显微镜是一种无需标记即可进行分子追踪的替代成像技术。与荧光标记相比，SRS成像不受光漂白影响，因而能够实现对分子的长期监测。然而，截至目前，商用的正置SRS显微镜尚无配套的活细胞成像系统。本研究开发了一种配备稳定隔热显微镜封闭箱体和灵活的内部软腔室的活细胞成像系统，以实现透射式SRS时间延时成像。该系统中，大型封闭箱体可维持37 °C的温度稳定性，而内部软腔则提供加湿空气，以建立最佳的细胞培养环境。本工作中展示的柔性开放式腔室使活细胞长期SRS成像的操作流程更加简便。接种于玻璃底培养皿中的细胞可先在常规培养箱中进行制备和培养，随后转移至显微镜载物台上的柔性腔室中进行成像。另一种实现活细胞SRS成像的方案是使用封闭式流动池，包括微流控和流式细胞术平台27,28,29,30。设计厚度更小的流动池在技术上是可行的。然而，在灌注腔室中培养细胞可能面临技术上的挑战
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢宾汉姆顿大学2019届本科高年级设计团队（Suk Chul Yoon、Ian Foxton、Louis Mazza和James Walsh）在显微镜 enclosure 箱的设计、制造和测试方面所做的工作。我们感谢宾汉姆顿大学的Scott Hancock、Olga Petrova和Fabiola Moreno Olivas 提供的有益讨论。本研究由美国国立卫生研究院资助，资助编号为R15GM140444。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 自制SRS显微镜 | https://rdcu.be/cP6ve | ||
| HF2LI 50 MHz锁相放大器 | Zurich Instruments | HF2LI | |
| 虹膜光阑 | Thorlabs Inc | SM1D12 | |
| 运动学镜架 | Thorlabs Inc | KM100 | |
| 显微镜框架 | Nikon Inc | FN-1 | |
| 电动显微镜载物台 | Prior Scientific | Z-Deck | |
| 油浸式聚光镜（C-AA 复消色差/平场消色差，NA 1.4） | Nikon Inc | MBL71405 | |
| 水浸式物镜（CFI75 Apo 25XC W 1300） | Nikon Inc | MRD77225 | |
| 显微镜 enclosure 材料与部件（31'' × 29'' × 28'' 长×宽×高） | |||
| Airtherm加热模块 | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SAT-1W | |
| Airtherm加热控制器、CO2和湿度监测仪 | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SMT-1W | |
| 空气/CO2混合模块 | World Precision Instruments (WPI) | ECU-HOC-W | |
| 柔性风管软管（内径2-1/2''，外径2-3/4''） | McMaster-Carr | 56675K71 | |
| 耐高温玻璃云母陶瓷，易加工（6'' × 6''，厚度1/4''） | McMaster-Carr | 8489K62 | |
| 聚碳酸酯板材（厚度0.25''） | McMaster-Carr | 8574K286 | |
| 硅橡胶板材（36'' × 36''，厚度1/8''） | McMaster-Carr | 5827T43 | |
| 柔性腔室材料与部件 | |||
| 加热板 | McMaster-Carr | 31745K11 | |
| 高纯度在线过滤器，1/4 NPT | McMaster-Carr | 6645T18 | |
| 孔锯（切割直径1-7/8英寸） | McMaster-Carr | 4066A34 | |
| 孔锯（切割直径50 mm） | McMaster-Carr | 4556A19 | |
| 耐高温软质硅胶管（内径2 mm，外径5 mm） | McMaster-Carr | 5054K313 | |
| 在线过滤器（1/4 NPT，40 微米） | McMaster-Carr | 98385K843 | |
| 通用6061铝合金圆管（壁厚1/8''，外径4''） | McMaster-Carr | 9056K42 | |
| 通用6061铝合金圆管（壁厚3/4''，外径3-3/4''） | McMaster-Carr | 9056K47 | |
| 通用6061铝合金棒材（12'' × 12''，厚度1/4''） | McMaster-Carr | 8975K142 | |
| 通用6061铝合金棒材（8'' × 8''，厚度3/8''） | McMaster-Carr | 9246K21 | |
| 物镜转盘（单孔） | Nikon Inc | FN-MN-H | |
| 样品架（改装） | Prior Scientific | HZ202 | |
| 超薄天然橡胶膜（厚度0.01''） | McMaster-Carr | 8611K13 | |
| 可真空密封的玻璃罐 | McMaster-Carr | 3231T44 | |
| 软件 | |||
| MATLAB | MathWorks | ||
| ImageJ（Fiji） | imagej.net | ||
| ScanImage | Vidrio Technologies, LLC | SRS成像软件 | |
| 活细胞成像材料 | |||
| 盖玻片底无菌培养皿（直径×高，50 × 7 mm） | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70674-02 | |
| DMEM细胞培养基 | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| 胎牛血清（FBS） | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| LysoSensor荧光染料DND-189 | ThermoFisher Scientific | L7535 (Invitrogen) | |
| 油酸 | MilliporeSigma | 364525 | |
| SKOV3细胞系 | ATCC | HTB-77 |
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重印与许可
