我们报道了一种用于直立式受激拉曼散射显微镜透射信号检测的台面式灵活环境培养室，可用于活细胞的延时成像。利用该系统，以3分钟的时间间隔，对经油酸处理长达24小时的SKOV3细胞中的脂滴进行了成像。
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本文内容
摘要
摘要
受激拉曼散射（SRS）显微镜是一种无标记的化学成像技术。SRS 已被用于多种生物和生物医学应用中的活细胞成像。然而，长期延时 SRS 活细胞成像尚未得到广泛应用。SRS 显微镜通常采用高数值孔径（NA）的水浸物镜和高 NA 的油浸聚光镜，以实现高分辨率成像。在这种情况下，物镜与聚光镜之间的间隙仅有几毫米。因此，大多数商用台面环境培养舱由于其带有刚性玻璃盖且厚度较大，无法用于 SRS 成像。本文介绍了一种柔性培养舱的设计与制作方法，该培养舱可用于直立式显微镜平台上基于透射 SRS 信号检测的延时活细胞成像。该培养舱的柔韧性通过使用一种柔软材料——薄天然橡胶膜来实现。这种新型封闭结构和培养舱设计可方便地集成到现有的 SRS 成像系统中。测试与初步结果表明，该柔性培养舱系统能够实现稳定、长期的延时 SRS 活细胞成像，未来可应用于多种生物成像研究。
引言
光学显微镜用于观察样品的微观结构。与其他技术相比，光学成像速度更快，侵入性更小，破坏性更低1。活细胞成像技术结合光学显微镜，可用于长期动态观察培养中的活细胞2。不同类型的光学对比方式可提供关于生物样品的独特信息。例如，光学相位显微镜能够显示样品内折射率的细微差异3。荧光显微镜则被广泛用于对特定生物分子或细胞器进行成像。然而，荧光的宽谱激发和发射光谱通常在多色成像时导致光谱重叠4。荧光分子对光敏感，在长期、周期性的光照下可能发生漂白。此外，荧光标记可能改变分子在细胞内的生物分布5。受激拉曼散射（SRS）显微镜是一种无需标记的化学成像技术6。SRS的对比度依赖于特定化学键的振动跃迁。化学键的振动频率通常具有较窄的光谱带宽，因此可在同一样品中实现多个拉曼波段的成像7。SRS显微镜是活细胞成像的独特工具，能够在无需标记的情况下提供多种化学对比信息8。
尽管无标记细胞的受激拉曼散射（SRS）成像已被用于多项研究，但活细胞的长期延时SRS成像尚未得到广泛应用。其中一个原因是商用开放式培养腔室因厚度较大，无法直接....
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方案
1. 构建显微镜环境封闭装置
注意：该大型显微镜环境封闭装置用于控制显微镜主体及成像环境的温度，使其稳定在 37 °C（图 1A）。
- 使用记号笔在光学平台上标记SRS显微镜框架和电动载物台支脚的位置。在显微镜的振镜扫描器前方安装两个虹膜光阑，并调节位置，使泵浦激光束和斯托克斯激光束穿过虹膜光阑的中心。
- 将显微镜框架和载物台从光学平台上移开。
- 将硅橡胶垫片（尺寸：31 × 29 英寸，厚度：1/8 英寸）平铺在光学平台上（图1B）。
- 使用刀具沿标记线切割硅橡胶，移除小块橡胶碎片，并将方形云母陶瓷片（尺寸：6 × 6 英寸，厚度：1/4 英寸）放入相同位置。
注：云母陶瓷是一种易于加工的材料15。其硬度与铝相当，但具有优异的热绝缘性能。使用云母陶瓷片可阻止金属显微镜框架和载物台向不锈钢光学平台传热。应在云母陶瓷片上钻若干通孔，以便使用¼-20螺钉固定框架和载物台的支脚。 - 将显微镜框架和载物台重新放回光学平台，仔细对齐支脚与标记线上的云母陶瓷片位置，并使用¼-20螺钉将框架和载物台固定在平台上。
- 重新校准SRS光路。调节镜片1和镜片2的镜架，使激光束穿过两个预装虹膜光阑的中心（
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结果
我们制备并组装了用于延时SRS成像的柔性培养室系统（图1 和 图2），随后评估了该系统的性能。显微镜环境封闭腔内的温度在1小时内达到预期的37 °C，且未显著影响室温（图3A）。柔性培养室内的温度在1.5小时内达到37 °C，并能稳定维持在37 °C至少24小时（图3B）。柔性培养室内的相对湿度在1小时内可达85%，之后可维持至少24小时（图3C）。实测的温度和湿度数据证实，该系统可为细胞的长期生长提供最佳环境。
利用受激拉曼散射（SRS）进行的活细胞成像已广泛应用于多种生物学与生物医学研究20,21,22
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讨论
时间延时活细胞SRS显微镜是一种无需标记即可进行分子追踪的替代成像技术。与荧光标记相比，SRS成像不受光漂白影响，因而能够实现对分子的长期监测。然而，截至目前，商用的正置SRS显微镜尚无配套的活细胞成像系统。本研究开发了一种配备稳定隔热显微镜封闭箱体和灵活的内部软腔室的活细胞成像系统，以实现透射式SRS时间延时成像。该系统中，大型封闭箱体可维持37 °C的温度稳定性，而内部软腔则提供加湿空气，以建立最佳的细胞培养环境。本工作中展示的柔性开放式腔室使活细胞长期SRS成像的操作流程更加简便。接种于玻璃底培养皿中的细胞可先在常规培养箱中进行制备和培养，随后转移至显微镜载物台上的柔性腔室中进行成像。另一种实现活细胞SRS成像的方案是使用封闭式流动池，包括微流控和流式细胞术平台27,28,29,30。设计厚度更小的流动池在技术上是可行的。然而，在灌注腔室中培养细胞可能面临技术上的挑战
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢宾汉姆顿大学2019届本科高年级设计团队（Suk Chul Yoon、Ian Foxton、Louis Mazza和James Walsh）在显微镜 enclosure 箱的设计、制造和测试方面所做的工作。我们感谢宾汉姆顿大学的Scott Hancock、Olga Petrova和Fabiola Moreno Olivas 提供的有益讨论。本研究由美国国立卫生研究院资助，资助编号为R15GM140444。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 自制SRS显微镜 | https://rdcu.be/cP6ve | ||
| HF2LI 50 MHz锁相放大器 | Zurich Instruments | HF2LI | |
| 虹膜光阑 | Thorlabs Inc | SM1D12 | |
| 运动学镜架 | Thorlabs Inc | KM100 | |
| 显微镜框架 | Nikon Inc | FN-1 | |
| 电动显微镜载物台 | Prior Scientific | Z-Deck | |
| 油浸式聚光镜（C-AA 复消色差/平场消色差，NA 1.4） | Nikon Inc | MBL71405 | |
| 水浸式物镜（CFI75 Apo 25XC W 1300） | Nikon Inc | MRD77225 | |
| 显微镜 enclosure 材料与部件（31'' × 29'' × 28'' 长×宽×高） | |||
| Airtherm加热模块 | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SAT-1W | |
| Airtherm加热控制器、CO2和湿度监测仪 | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SMT-1W | |
| 空气/CO2混合模块 | World Precision Instruments (WPI) | ECU-HOC-W | |
| 柔性风管软管（内径2-1/2''，外径2-3/4''） | McMaster-Carr | 56675K71 | |
| 耐高温玻璃云母陶瓷，易加工（6'' × 6''，厚度1/4''） | McMaster-Carr | 8489K62 | |
| 聚碳酸酯板材（厚度0.25''） | McMaster-Carr | 8574K286 | |
| 硅橡胶板材（36'' × 36''，厚度1/8''） | McMaster-Carr | 5827T43 | |
| 柔性腔室材料与部件 | |||
| 加热板 | McMaster-Carr | 31745K11 | |
| 高纯度在线过滤器，1/4 NPT | McMaster-Carr | 6645T18 | |
| 孔锯（切割直径1-7/8英寸） | McMaster-Carr | 4066A34 | |
| 孔锯（切割直径50 mm） | McMaster-Carr | 4556A19 | |
| 耐高温软质硅胶管（内径2 mm，外径5 mm） | McMaster-Carr | 5054K313 | |
| 在线过滤器（1/4 NPT，40 微米） | McMaster-Carr | 98385K843 | |
| 通用6061铝合金圆管（壁厚1/8''，外径4''） | McMaster-Carr | 9056K42 | |
| 通用6061铝合金圆管（壁厚3/4''，外径3-3/4''） | McMaster-Carr | 9056K47 | |
| 通用6061铝合金棒材（12'' × 12''，厚度1/4''） | McMaster-Carr | 8975K142 | |
| 通用6061铝合金棒材（8'' × 8''，厚度3/8''） | McMaster-Carr | 9246K21 | |
| 物镜转盘（单孔） | Nikon Inc | FN-MN-H | |
| 样品架（改装） | Prior Scientific | HZ202 | |
| 超薄天然橡胶膜（厚度0.01''） | McMaster-Carr | 8611K13 | |
| 可真空密封的玻璃罐 | McMaster-Carr | 3231T44 | |
| 软件 | |||
| MATLAB | MathWorks | ||
| ImageJ（Fiji） | imagej.net | ||
| ScanImage | Vidrio Technologies, LLC | SRS成像软件 | |
| 活细胞成像材料 | |||
| 盖玻片底无菌培养皿（直径×高，50 × 7 mm） | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70674-02 | |
| DMEM细胞培养基 | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| 胎牛血清（FBS） | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| LysoSensor荧光染料DND-189 | ThermoFisher Scientific | L7535 (Invitrogen) | |
| 油酸 | MilliporeSigma | 364525 | |
| SKOV3细胞系 | ATCC | HTB-77 |
参考文献
- Mertz, J. Introduction to Optical Microscopy. , Cambridge University Press. (2019).
- Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
- Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G.
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重印与许可
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