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方法文章

一种可扩展的基于细胞的功能性评估 Ube3a 变异体的方法

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DOI：

10.3791/64454

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2022年10月10日

 , 
1Department of Neuroscience, Washington University School of Medicine

本文内容

摘要

开发了一种简单且可扩展的方法，用于评估Ube3a基因中错义变异的功能意义，该基因的功能缺失和获得与安格曼综合征及自闭症谱系障碍均有关联。

摘要

测序技术在医学中的广泛应用已鉴定出人类基因组中数以百万计的编码区变异。其中许多变异位于与神经发育障碍相关的基因中，但绝大多数变异的功能意义仍不明确。本实验方案描述了对 Ube3a 基因变异的研究方法，该基因编码一种与自闭症和天使综合征均相关的 E3 泛素连接酶。Ube3a 的重复或三倍重复与自闭症密切相关，而其缺失则导致天使综合征。因此，理解 UBE3A 蛋白活性变化的效应方向对于临床结果至关重要。本文介绍了一种快速的基于细胞的方法，将 Ube3a 变异体与 Wnt 信号通路报告系统相结合。该检测方法简单、可扩展，可用于确定任意 Ube3a 变异体活性变化的方向和程度。此外，该方法操作便捷，可产生大量结构-功能信息，有助于深入解析 UBE3A 酶的催化机制。

引言

近年来的技术进步已使外显子组和基因组测序在临床环境中成为常规操作1,2。这导致发现了大量遗传变异，包括数百万个错义变异，这些变异通常会改变蛋白质中的一个氨基酸。理解这些变异的功能意义仍然是一个挑战，而已知错义变异中仅有很小一部分（约2%）具有临床解读意义1,3。

这一问题的一个典型例子是Ube3a基因，该基因编码一种E3泛素连接酶，可靶向底物蛋白并促使其降解4。Ube3a位于15号染色体q11-13区域，并仅从母源等位基因表达5,6,7。疾病遗传学的观察结果强烈表明，UBE3A酶活性不足或过度均会导致不同的神经发育障碍。母源15q11-13染色体缺失会导致天使综合征（Angelman syndrome, AS）8，该疾病表现为严重的智力障碍、运动功能受损、癫痫发作、频繁微笑的愉快表情以及面部畸形等特征8,9,10。相反，母源15q11-13染色体的重复或三倍重复则导致Dup15q综合征，这是一种异质性疾病，被认为是最常见的综合征型自闭症之一11,12,13。此外，在Ube3a基因中已发现数百个错义变异，其中大多数被归类为意义未明的变异（VUS），因其功能和临床意义尚不明确。因此，开发能够实证评估Ube3a变异是否参与神经发育疾病的方法具有重要意义。

UBE3A 酶属于 HECT（与 E6-AP C 末端同源）结构域家族的 E3 泛素连接酶，该家族均具有同源的 HECT 结构域，其中含有从 E2 酶接受活化泛素并将其转移至底物蛋白所需的生化机制14。传统上，E3 酶的表征依赖于重建的体外（in vitro）系统，该系统需要一组纯化的蛋白质4,15,16。此类方法缓慢且劳动密集，难以用于评估大量变异体的活性。在先前的研究中，发现 UBE3A 可通过调节蛋白酶体功能以减缓 β-连环蛋白（β-catenin）的降解，从而在 HEK293T 细胞中激活 Wnt 通路17。这一发现使得利用 Wnt 通路报告系统成为一种高效且快速的方法，可用于鉴定 Ube3a 的功能缺失型和功能获得型变异体18。以下方案详细描述了一种生成 Ube3a 变异体的方法，以及一种基于荧光素酶的报告系统，用于评估 Ube3a 变异体活性的变化。

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方案

1. 利用诱变克隆技术生成 Ube3a 变体

  1. 克隆全部 Ube3a 将变异体克隆至 pCIG2 质粒中（图1A)，一种双顺反子载体，包含鸡β-肌动蛋白启动子和用于EGFP表达的内部核糖体进入位点（IRES）19全长 Ube3a 构建体包含一个N端Myc标签序列，并利用5'端SacI位点和3'端XmaI位点克隆至pCIG2载体中。此外，构建体内天然存在的EcoRI、EcoRV和PstI位点 Ube3a 编码序列也常用于亚克隆片段。
    注意：去标识化的变异数据用于 Ube3a 可通过文献以及ClinVar数据库等公开可访问的存储库获得1. 未报告的其他变异可通过与医疗中心的个人沟通获取。
  2. 采用改进的两步法大引物介导的定点突变方法20 引入突变到 Ube3a 读码框。第一步，设计包含目标突变的诱变寡核苷酸（本方案所示示例为生成 UBE3A Q588E 变体），其两侧分别在突变位点的 5′ 和 3′ 方向至少含有 30 个碱基对（bp）的同源序列图1B 和 表1).
  3. 使用突变引物及一条互补引物进行第一轮PCR，扩增出含有突变位点、长度为200-400 bp的巨引物（megaprimer）图1C; 表 2 和 表3）。将整个50 μL PCR反应体系用于1%琼脂糖凝胶电泳，并随后进行凝胶纯化（材料表用30 μL去离子水洗脱PCR产物2O (diH2O），用于下文第二轮 PCR 步骤。
  4. 按照所示设置第二轮 PCR（图1C; 表2 和 表3）。此步骤将产生较长的DNA片段（通常长度约为1-1.5 kb），其中包含突变位点以及适用于亚克隆的末端限制性酶切位点（图1C).
  5. PCR反应完成后，使用PCR纯化试剂盒纯化所得产物（材料表）。用 30 μL 洗脱，消化全部纯化产物和 pCIG2 Ube3a 使用适当的限制性内切酶对野生型（WT）构建体进行酶切（示例中使用EcoRI和XmaI进行消化）。
  6. 37 °C 消化 2 小时后，通过琼脂糖凝胶电泳（1% 凝胶）分离消化产物，并对目标条带进行凝胶纯化。按照生产商说明书设置连接反应。材料表），将连接产物转化至DH10B感受态菌株中（材料表），然后用氨苄青霉素（100 μg/mL）选择性培养基铺板。
  7. 第二天，挑取2至4个菌落接种于含有LB培养基和100 μg/mL氨苄青霉素的3 mL培养液中。将培养物置于37 °C恒温振荡摇床中过夜培养（225 rpm）。
  8. 次日，取1-1.5 mL细菌培养物用于质粒DNA的小量提取材料表将剩余菌液置于 4 °C 保存。使用结合于目标突变位点约 200 bp 处的寡核苷酸，通过 Sanger 测序对质粒小提产物进行筛选。
  9. 使用保存在 4 °C 的细菌培养物重新接种 50 mL 培养液，以进行中量提取正确的质粒 (材料表）。对样本进行全序列测定 Ube3a 编码序列以验证DNA序列的正确性。
  10. 制备工作液 Ube3a 变异型质粒以及β-连环蛋白激活报告基因（BAR）21，TK-海肾 荧光素酶，连接酶失活 Ube3a （UBE3A C820A突变）和pCIG2空载体，浓度为100 ng/μL，使用无菌H2O用于后续转染步骤。

2. 人胚胎肾293T（HEK293T）细胞的准备与转染

  1. 在先前所述的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）中培养 HEK293T 细胞，该培养基预先添加了谷氨酰胺、10% 胎牛血清（FBS）和抗生素-抗真菌剂17。将细胞置于 37 °C、5% CO2 的无菌、湿润培养箱中培养。
  2. 在生物安全柜中，将悬浮的 HEK293T 细胞以每孔 100 μL 培养基中接种 2.2 × 104 个细胞的密度接种至经组织培养处理的 96 孔平底板中，过夜培养。
  3. 第二天，在生物安全柜中用三复孔方式转染萤火虫荧光素酶和Renilla荧光素酶报告质粒（表 4）以及Ube3a质粒。每孔总反应体积为 10 μL，质粒比例为 10:1:8（每孔分别为 50 ng BAR、5 ng TK-Renilla 和 40 ng Ube3a 质粒），转染试剂用量为 0.4 μL（表 4），操作方法同前文所述18。
    注意：每次实验中还需转染空载体（仅 GFP）和编码连接酶失活型Ube3a的质粒，作为阴性对照。
  4. 为每种变异体的转染反应在 1.5 mL 微离心管中配制总混合液（表 4），室温（RT）孵育 15 分钟。孵育结束后，轻弹管壁使转染混合物轻微振荡混匀，然后将 10 μL 转染混合物直接加入各孔原有的培养基中。
  5. 随后将细胞放回培养箱，继续表达质粒 48 小时。此期间无需更换培养基。
  6. 使用荧光显微镜通过 GFP 荧光监测转染效率。该方法可高效转染 HEK293T 细胞，48 小时后应有>80% 的细胞表达 GFP。

3. 荧光素酶活性的测定

注意：根据制造商提供的方案，使用一种市售试剂盒同时检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶活性（材料表）。

  1. 小心吸除转染的 HEK293T 细胞中的培养基，然后用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。吸除 PBS 后，加入 25 μL 非变性裂解缓冲液裂解细胞，并在冰上轻轻摇动孵育 15 分钟。
  2. 随后，取 20 μL 裂解液（无需离心）加入到一个新的 96 孔检测板中，该孔中已含有 100 μL 萤光素酶底物试剂。通过轻敲混匀反应板。
  3. 将反应板放入酶标仪中，使用顶部检测器测量发光信号，检测高度设为 1 mm，积分时间为 1 秒。
    注意：检测器的增益可能需要根据信号强度进行调整。
  4. 在检测萤光素酶发光信号后，立即向各孔中加入 100 µL 海肾萤光素酶底物。此步骤可同时淬灭萤光素酶活性并启动海肾萤光素酶活性的检测。通过轻轻振荡反应板混匀样品，再次测量发光信号以评估 Renilla 萤光素酶活性。
    注意：虽然也可使用其他类型的反应板，但采用黑色边框、白色孔壁的反应板可获得最灵敏的结果，因其可增强萤光素酶信号并最小化背景噪音。
  5. 以萤光素酶与 Renilla 萤光素酶的发光值之比（Firefly/Renilla）来量化报告基因响应，并对三复孔测量值取平均值。随后，将每个变异体的 Firefly/Renilla 值相对于野生型（WT）Ube3a 表达细胞的值进行归一化处理，以比较不同变异蛋白的相对活性。

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结果

大规模功能性筛选Ube3a错义突变，鉴定出广泛的功能丧失和功能获得性突变谱
此前对Ube3a突变体的研究表明，Wnt反应可作为细胞内UBE3A蛋白活性的报告系统。本研究进一步拓展了这些观察结果，并通过额外的验证实验，探究BAR检测是否适用于报告细胞内多种UBE3A活性水平。首先，将编码人源野生型Ube3a的质粒DNA以不同剂量转染至HEK293T细胞。该实验表明，BAR反应与转染至细胞中的Ube3a量呈线性关系（图2A）。其次，使用文献中已表征的与疾病相关的变异体编码质粒DNA对BAR检测进行测试22。这些变异体包括良性变异（R39H和A178T）、一种与自闭症相关的功能获得性变异（T458A），以及一组通过不同机制导致UBE3A功能丧失的、已确认与天使综合征相关的变异体15,22。BAR检测准确识别了...

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讨论

本文所述方案提供了一种高效且可扩展的方法，用于评估 Ube3a 变体的酶活性。在使用该检测方法时，有几个技术细节需要仔细考虑。其一是本实验所用 Wnt 报告基因质粒的选择。本文方案中特别使用了 β-连环蛋白激活报告基因（BAR）21，该报告基因包含由特定设计的连接序列分隔的 12 个 T 细胞因子（TCF）反应元件串联体，以最大限度减少重组和 TCF 结合位点的丢失。文献中还描述了其他基于荧光素酶的 Wnt 报告基因质粒23，尽管先前的研究表明其中一些可用于评估 UBE3A 活性，但 BAR 质粒在此用途上已得到最为充分的表征17,18。其次，Renilla 荧光素酶质粒的选择至关重要。在转染步骤中加入编码 Renilla 荧光素酶的质粒，用于校正转染效率。本方案所用质粒在胸苷激酶（TK）启动子（TK-Renilla）的控制下组成型表达 Renil...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究工作得到了西蒙斯基金会独立桥梁奖（SFARI 奖 #387972；J.J.Y.）、脑与行为研究基金会 NARSAD 青年研究者奖（J.J.Y.）、阿尔弗雷德·P·斯隆基金会研究奖学金（J.J.Y.）以及天使综合征基金会（J.J.Y.）、怀特霍尔基金会（J.J.Y.）和美国国家精神卫生研究所（R01MH122786；J.J.Y.）研究资助的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.05% 胰蛋白酶-EDTA (1x)，含酚红Gibco25300-054
1 Kb DNA MarkerLambda BiotechM108-S
100 bp DNA MarkerLambda BiotechM107
T4 DNA 连接酶用 10x 缓冲液（含 10 mM ATP）New England BioLabsB0202A
5x Phusion HF 反应缓冲液New England BioLabsB0518S
抗生素-抗真菌剂溶液Corning30004CI
黑色/白色 Isoplate-96 黑框白底孔板PerkinElmer6005030
羧苄青霉素二钠盐Midwest ScientificKCC46000-5
Countess 细胞计数板 载玻片Invitrogen by Thermo Fisher ScientificC10283
Countess II 全自动细胞计数仪 life technologies细胞计数仪
定制 DNA 寡核苷酸Integrated DNA Technologies (IDT)
脱氧核苷酸（dNTP）混合溶液New England BioLabsN0447S
DMEM，高糖，含 GlutaMAX 补充剂和丙酮酸钠Gibco10569044支持 HEK293T 细胞系生长的基础培养基
DPBS (1x)Gibco14190-136
双荧光素酶报告基因检测系统PromegaE1910
EcoRI-HF New England BioLabsR3101S限制性内切酶
胎牛血清，经鉴定合格，热灭活Gibco16140071胎牛血清
Fisherbrand 表面处理组织培养皿FisherbrandFB012924
FuGENE 6 转染试剂PromegaE2691
紫色凝胶上样缓冲液 (6x)New England BioLabsB7024A
HEK293T 细胞ATCCCRL-3216
高效 ig 10B 化学感受态细胞Intact Genomics1011-12E. coli DH10B 细胞
HiSpeed 质粒中量提取试剂盒Qiagen12643中提
pCIG2 质粒
pGL3 BAR 质粒
Phusion HF DNA 聚合酶New England BioLabsM0530LDNA 聚合酶
ProFlex 3 x 32 孔 PCR 系统Applied biosystems by life technologiesPCR 仪
pTK Renilla 质粒
QIAprep Spin 质粒小量提取试剂盒 (250)Qiagen27106小提
QIAquick 凝胶回收试剂盒 (250)Qiagen28706凝胶纯化
QIAquick PCR 纯化试剂盒 (250)Qiagen28106PCR 纯化
rCutSmart 缓冲液New England BioLabsB6004S
SacI-HFNew England BioLabsR3156S限制性内切酶
Synergy HTX 多功能微孔板检测仪BioTek 微孔板检测仪，运行 Gen5 软件 v3.08 (BioTek)
T4 DNA 连接酶New England BioLabsM0202L连接酶
TAE 缓冲液，Tris-乙酸-EDTA，50x 溶液，用于电泳Fisher ScientificBP13324
组织培养板，96 孔，平底FisherbrandFB012931
UltraPure 溴化乙锭溶液Invitrogen by Thermo Fisher Scientific15585011
XmaINew England BioLabsR0180S限制性内切酶

参考文献

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