开发了一种简单且可扩展的方法，用于评估Ube3a基因中错义变异的功能意义，该基因的功能缺失和获得与安格曼综合征及自闭症谱系障碍均有关联。
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本文内容
摘要
摘要
测序技术在医学中的广泛应用已鉴定出人类基因组中数以百万计的编码区变异。其中许多变异位于与神经发育障碍相关的基因中，但绝大多数变异的功能意义仍不明确。本实验方案描述了对 Ube3a 基因变异的研究方法，该基因编码一种与自闭症和天使综合征均相关的 E3 泛素连接酶。Ube3a 的重复或三倍重复与自闭症密切相关，而其缺失则导致天使综合征。因此，理解 UBE3A 蛋白活性变化的效应方向对于临床结果至关重要。本文介绍了一种快速的基于细胞的方法，将 Ube3a 变异体与 Wnt 信号通路报告系统相结合。该检测方法简单、可扩展，可用于确定任意 Ube3a 变异体活性变化的方向和程度。此外，该方法操作便捷，可产生大量结构-功能信息，有助于深入解析 UBE3A 酶的催化机制。
引言
近年来的技术进步已使外显子组和基因组测序在临床环境中成为常规操作1,2。这导致发现了大量遗传变异，包括数百万个错义变异，这些变异通常会改变蛋白质中的一个氨基酸。理解这些变异的功能意义仍然是一个挑战，而已知错义变异中仅有很小一部分（约2%）具有临床解读意义1,3。
这一问题的一个典型例子是Ube3a基因，该基因编码一种E3泛素连接酶，可靶向底物蛋白并促使其降解4。Ube3a位于15号染色体q11-13区域，并仅从母源等位基因表达5,6,7。疾病遗传学的观察结果强烈表明，UBE3A酶活性不足或过度均会导致不同的神经发育障碍。母源15q11-13染色体缺失会导致天使综合征（Angelman syndrome, AS）8，该疾病表现为严重的智力障碍、运动功能受损、癫痫发作、频繁微笑的愉快表情以及面部畸形等特征
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方案
1. 利用诱变克隆技术生成 Ube3a 变体
- 克隆全部 Ube3a 将变异体克隆至 pCIG2 质粒中（图1A)，一种双顺反子载体，包含鸡β-肌动蛋白启动子和用于EGFP表达的内部核糖体进入位点（IRES）19全长 Ube3a 构建体包含一个N端Myc标签序列，并利用5'端SacI位点和3'端XmaI位点克隆至pCIG2载体中。此外，构建体内天然存在的EcoRI、EcoRV和PstI位点 Ube3a 编码序列也常用于亚克隆片段。
注意：去标识化的变异数据用于 Ube3a 可通过文献以及ClinVar数据库等公开可访问的存储库获得1. 未报告的其他变异可通过与医疗中心的个人沟通获取。 - 采用改进的两步法大引物介导的定点突变方法20 引入突变到 Ube3a 读码框。第一步，设计包含目标突变的诱变寡核苷酸（本方案所示示例为生成 UBE3A Q588E 变体），其两侧分别在突变位点的 5′ 和 3′ 方向至少含有 30 个碱基对（bp）的同源序列图1B 和 表1
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结果
大规模功能性筛选Ube3a错义突变，鉴定出广泛的功能丧失和功能获得性突变谱
此前对Ube3a突变体的研究表明，Wnt反应可作为细胞内UBE3A蛋白活性的报告系统。本研究进一步拓展了这些观察结果，并通过额外的验证实验，探究BAR检测是否适用于报告细胞内多种UBE3A活性水平。首先，将编码人源野生型Ube3a的质粒DNA以不同剂量转染至HEK293T细胞。该实验表明，BAR反应与转染至细胞中的Ube3a量呈线性关系（图2A）。其次，使用文献中已表征的与疾病相关的变异体编码质粒DNA对BAR检测进行测试22。这些变异体包括良性变异（R39H和A178T）、一种与自闭症相关的功能获得性变异（T458A），以及一组通过不同机制导致UBE3A功能丧失的、已确认与天使综合征相关的变异体15,22。BAR检测准确识别了.......
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讨论
本文所述方案提供了一种高效且可扩展的方法，用于评估 Ube3a 变体的酶活性。在使用该检测方法时，有几个技术细节需要仔细考虑。其一是本实验所用 Wnt 报告基因质粒的选择。本文方案中特别使用了 β-连环蛋白激活报告基因（BAR）21，该报告基因包含由特定设计的连接序列分隔的 12 个 T 细胞因子（TCF）反应元件串联体，以最大限度减少重组和 TCF 结合位点的丢失。文献中还描述了其他基于荧光素酶的 Wnt 报告基因质粒23，尽管先前的研究表明其中一些可用于评估 UBE3A 活性，但 BAR 质粒在此用途上已得到最为充分的表征17,18。其次，Renilla 荧光素酶质粒的选择至关重要。在转染步骤中加入编码 Renilla 荧光素酶的质粒，用于校正转染效率。本方案所用质粒在胸苷激酶（TK）启动子（TK-Renilla）的控制下组成型表达 Renil.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究工作得到了西蒙斯基金会独立桥梁奖（SFARI 奖 #387972；J.J.Y.）、脑与行为研究基金会 NARSAD 青年研究者奖（J.J.Y.）、阿尔弗雷德·P·斯隆基金会研究奖学金（J.J.Y.）以及天使综合征基金会（J.J.Y.）、怀特霍尔基金会（J.J.Y.）和美国国家精神卫生研究所（R01MH122786；J.J.Y.）研究资助的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.05% 胰蛋白酶-EDTA (1x)，含酚红 | Gibco | 25300-054 | |
| 1 Kb DNA Marker | Lambda Biotech | M108-S | |
| 100 bp DNA Marker | Lambda Biotech | M107 | |
| T4 DNA 连接酶用 10x 缓冲液（含 10 mM ATP） | New England BioLabs | B0202A | |
| 5x Phusion HF 反应缓冲液 | New England BioLabs | B0518S | |
| 抗生素-抗真菌剂溶液 | Corning | 30004CI | |
| 黑色/白色 Isoplate-96 黑框白底孔板 | PerkinElmer | 6005030 | |
| 羧苄青霉素二钠盐 | Midwest Scientific | KCC46000-5 | |
| Countess 细胞计数板 载玻片 | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C10283 | |
| Countess II 全自动细胞计数仪 | life technologies | 细胞计数仪 | |
| 定制 DNA 寡核苷酸 | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| 脱氧核苷酸（dNTP）混合溶液 | New England BioLabs | N0447S | |
| DMEM，高糖，含 GlutaMAX 补充剂和丙酮酸钠 | Gibco | 10569044 | 支持 HEK293T 细胞系生长的基础培养基 |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-136 | |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | E1910 | |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | 限制性内切酶 |
| 胎牛血清，经鉴定合格，热灭活 | Gibco | 16140071 | 胎牛血清 |
| Fisherbrand 表面处理组织培养皿 | Fisherbrand | FB012924 | |
| FuGENE 6 转染试剂 | Promega | E2691 | |
| 紫色凝胶上样缓冲液 (6x) | New England BioLabs | B7024A | |
| HEK293T 细胞 | ATCC | CRL-3216 | |
| 高效 ig 10B 化学感受态细胞 | Intact Genomics | 1011-12 | E. coli DH10B 细胞 |
| HiSpeed 质粒中量提取试剂盒 | Qiagen | 12643 | 中提 |
| pCIG2 质粒 | |||
| pGL3 BAR 质粒 | |||
| Phusion HF DNA 聚合酶 | New England BioLabs | M0530L | DNA 聚合酶 |
| ProFlex 3 x 32 孔 PCR 系统 | Applied biosystems by life technologies | PCR 仪 | |
| pTK Renilla 质粒 | |||
| QIAprep Spin 质粒小量提取试剂盒 (250) | Qiagen | 27106 | 小提 |
| QIAquick 凝胶回收试剂盒 (250) | Qiagen | 28706 | 凝胶纯化 |
| QIAquick PCR 纯化试剂盒 (250) | Qiagen | 28106 | PCR 纯化 |
| rCutSmart 缓冲液 | New England BioLabs | B6004S | |
| SacI-HF | New England BioLabs | R3156S | 限制性内切酶 |
| Synergy HTX 多功能微孔板检测仪 | BioTek | 微孔板检测仪，运行 Gen5 软件 v3.08 (BioTek) | |
| T4 DNA 连接酶 | New England BioLabs | M0202L | 连接酶 |
| TAE 缓冲液，Tris-乙酸-EDTA，50x 溶液，用于电泳 | Fisher Scientific | BP13324 | |
| 组织培养板，96 孔，平底 | Fisherbrand | FB012931 | |
| UltraPure 溴化乙锭溶液 | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
| XmaI | New England BioLabs | R0180S | 限制性内切酶 |
参考文献
- Landrum, M. J., et al. ClinVar: Public archive of relationships among sequence variation and human phenotype. Nucleic Acids Research. 42, 980-985 (2014).
- Lek, M., et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Natu....
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