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方法文章

O形环主动脉缩窄术与传统横行主动脉缩窄术在建立压力超负荷诱导心肌肥厚模型中的比较

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DOI:

10.3791/64455

2022年10月6日

本文内容

摘要

本方案描述了一种在小鼠中诱导压力超负荷性心肌肥厚的新型主动脉缩窄技术。该方法采用内径固定的橡胶环进行缩窄。这一新技术有望在未来实验中提供更小的变异性和更可重复的数据。

摘要

小鼠主动脉缩窄术是研究心脏压力超负荷诱导的心肌肥厚及心力衰竭最常用的实验模型之一。既往使用的技术是在主动脉弓上绕线结扎,并以钝化的27 G针头作为支撑,以形成狭窄。该方法依赖术者手动收紧缝线,因此导致狭窄直径存在较大变异。Melleby 等人描述的一种新优化方法可显著降低变异并提高术后可重复性。这种新技术称为O型环主动脉缩窄术(ORAB),采用不滑脱的橡胶环替代传统的缝线,从而减少压力超负荷的变异性,并获得更一致的心肌肥厚表型。手术过程中,将O型环置于头臂干动脉与左颈总动脉之间。通过超声心动图确认缩窄是否成功。术后1天,O型环引起的狭窄可导致横主动脉血流速度增加。术后2周,可通过射血分数下降和心壁增厚证实心脏功能受损。重要的是,除了狭窄直径变异更小外,ORAB与横主动脉缩窄术(TAC)相比,术中及术后死亡率更低。因此,ORAB是一种优于常用TAC手术的方法,可获得更高可重复性的实验结果,并可能减少所需实验动物数量。

引言

生理性心脏肥大可出现在发育期、运动或妊娠期间,而病理性心脏肥大则是对动脉高血压、瓣膜性心脏病或基因突变等血流动力学应激状态的响应。最初,心脏经历一种以心肌细胞体积增大和心室壁增厚为特征的重构过程,以维持心脏功能1,2。然而,病理性心脏重构与心律失常、猝死风险增加以及高死亡率密切相关。最终,随着时间推移,会导致心室扩张、收缩功能显著下降,并逐步进展为心力衰竭(HF),后者具有高发病率、高死亡率以及巨大的社会经济负担3。因此,迫切需要深入了解其分子机制,以开发新的治疗策略4

主动脉缩窄是一种模拟由压力超负荷引起的小鼠左心室(LV)肥厚和心力衰竭的模型5。利用该方法,可在体内研究压力超负荷诱导的心脏重构的病理机制in vivo。Rockman 等人首次报道了小鼠主动脉缩窄手术6。通过在主动脉(位于头臂干动脉与左颈总动脉之间)周围使用缝线结扎来诱导压力超负荷。为形成直径为 0.4 mm 的狭窄,将缝线环绕于 27 G 针头和主动脉周围。结扎后,取出针头6,....

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方案

动物实验遵循石勒苏益格-荷尔斯泰因州地区委员会(Ministerium für Energiewende, Landwirtschaft, Umwelt, Natur und Digitalisierung des Landes Schleswig-Holstein,许可编号:V242-21249/2020 [38-4/20])的原则进行。本研究使用的小鼠购自商业来源(见 材料表)。动物在标准条件下饲养,光照周期为12小时光照、12小时黑暗;可自由获取水和食物 随意.

1. 动物护理

  1. 将小鼠饲养在专用笼具中,笼内应包含垫料、筑巢材料、藏身处,并提供充足的饮水和食物。
  2. 对动物实施持续的专门兽医监护和治疗。
    注意:对于从外部供应商订购的小鼠,在开始实验前请确保有 7 天的适应期。

2. O形圈的制备

注意:建议使用内径为 0.4 mm 的O形环,可在 2 周后诱导心脏肥厚。所诱导的心脏表型程度和严重性取决于O形环内径的大小。

  1. 首先,在显微镜下使用剪刀或手术刀对 O 形圈(见材料表)进行一次切割,以便将其套入主动脉(

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结果

通常,主动脉缩窄术可模拟人类主动脉瓣狭窄,并在小鼠中诱导心肌肥厚。成功的手术以心肌组织重塑为特征,表现为心肌肥厚和心功能下降5,6

术后第1天即可通过超声心动图体内评估横主动脉O型环缩窄的效果13。通过脉冲波多普勒超声测量主动脉狭窄处血流速度升高,可证实主动脉狭窄造模成功(图4C)。此外,如上所述,我们测定右侧与左侧颈内动脉之间的血流速度比值,作为ORAB的功能性指标(图4AB)。

放置0.4 mm O形环两周后,可通过超声心动图确定心肌肥厚是否成功诱导。二维(2D)时间运动模式(M型)可显示心脏结构在心动周期中的变化情况。术后两周,可观察到舒张期左心室(LV)后壁(LVPW)和室间隔(IV.......

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讨论

基于缝线/缝合的主动脉缩窄术多年来一直用于在小鼠中诱导压力超负荷性心肌肥厚。这是一种成熟的体内研究心脏重构及疾病进展病理机制的方法。in vivo。其局限性在于狭窄程度以及随之而来的心脏重构存在相对较大的变异性。Melleby 等人最近提出的 ORAB 技术10通过使用橡胶O型环对传统方法进行了优化。

该技术最重要的优势在于O形环具有固定的直径,这使得狭窄程度的变异性更小,从而在术后产生更可重复的心肌肥厚表型。另一优点是该方法学习更快、操作更简便。在基于缝线/缝合的手术过程中,通常需要花费时间和经验来找到围绕主动脉结扎的合适程度。相比之下,由于O形环具有固定直径,采用O形环法时无需在这方面进行类似的调整。

开胸手术是ORAB技术中的关键步骤,虽然对动物具有疼痛性,但对于O型环结扎是必要的。为了实现更好的恢复并避免肺不张的发生,重要的是要防止肺损伤,并通过呼吸机监测通气情况。对于基于缝线的方法,存在采用微创技术的可能性。在此操作中,仅需使用一对镊子撑开组织,以便将.......

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由德国联邦教育与研究部(BMBF)资助,受助人为 L.L.、N.F. 和 O.J.M.(IVOLADMT-HF;项目编号 FKZ 01KC2006A)。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 个长固定器,6 厘米 18200-01
2 个钝性拉钩,5 毫米宽 18200-11
2 个短固定器,3 厘米 18200-02
2 把精细尖端 45° 弯角镊子 FST (fine sience tools)11160-10
3 个钝性拉钩,2.5 毫米宽 18200-10
3 根拉钩用金属丝 18200-05
4-0 可吸收缝线(Vicryl)ETHICONSABBKLT0用于皮肤缝合
6-0 缝线(Prolene),针长:13 毫米ETHICONJDP879用于胸肌缝合
8-0 缝线(Prolene),针长:6.5 毫米ETHICONRHBECH用于固定环状结扎器 
小型麻醉箱Havard apparatus 50-0108
C57BL/6N 小鼠Charles River
Fluosorber 活性炭过滤罐Havard apparatus 34-0415用于诱导和维持麻醉
自制喉镜 辅助插管
Harvard Apparatus 麻醉蒸发器Havard apparatus 用于诱导和维持麻醉
加热垫 + 直肠探头(LSI Letica Scientific Instruments:温度控制单元 HB 101/2)Panlab/ Havard apparatus 用于控制和维持体温 
静脉套管针,蓝色,22 号(Vasofix Braunüle 0.9 x 25 mm)B/Braunsharing Expertise 4268091B用于插管 
异氟烷Baxter麻醉剂
Kodan(聚维酮碘溶液)Schülke20003960-A消毒 
结扎辅助工具FST (fine sience tools)18062-12用于使用 O 形环进行结扎 
显微镜照明系统:Schott VisiLED 集成套件 MC1500/S80-55(含控制器)SCHOTT照明
显微镜 摄像头 (Leica IC80 HD)Leica用于术区可视化 
小型啮齿类动物专用 MiniVac 全套麻醉系统 Havard apparatus 75-0233用于诱导和维持麻醉
小鼠呼吸机 MiniVent 型号 845Havard Apparatus 73-0044用于手术期间通气 
持针器 FST (fine sience tools) TE-10804
O 形环,防滑橡胶材质(0.0018 毫米 x 0.020 毫米)Apple Rubber Products 用于主动脉弓结扎
剪刀FST (fine sience tools)14040-09用于剪开皮肤和缝线 
小型动物牵开系统(适用于体重不超过 200 克的动物)FST (fine sience tools)18200-20
小型底板,20 x 30 厘米  18200-03
集成加热垫 + 直肠探头 + 心电图及 换能器三脚架的手术台FujiFilm Visual Sonics Imaging System用于超声心动图检查 
镇痛药 Temgesic(丁丙诺啡)Indivior UK Limited997.00.00术前镇痛用药 
三通旋塞阀(蓝色)
镇痛药 Tramal(曲马多)Grünental术后镇痛用药 
换能器探头 MS400(Visual Sonics) FujiFilm Visual Sonics Imaging System用于超声心动图检查 
配备心血管分析软件包的超声系统 FujiFilm Visual Sonics Imaging System用于超声心动图检查 
Vannas 弹簧剪刀 - 2.5 毫米刃口FST (fine sience tools)15000-08用于剪断肋间胸肌 
兽用眼膏 Bepanten用于防止眼睛干涩

参考文献

  1. Frey, N., Olson, E. N. Cardiac hypertrophy: The good, the bad, and the ugly. Annual Review of Physiology. 65, 45-79 (2003).
  2. Bui, A. L., Horwich, T. B., Fonarow, G. C. Epidemiology and risk profile of heart failure. Nature Reviews Cardiology. 8 (1), 30-41 ....

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