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方法文章

O形环主动脉缩窄术与传统横行主动脉缩窄术在建立压力超负荷诱导心肌肥厚模型中的比较

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DOI：

10.3791/64455

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2022年10月6日

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1Department of Internal Medicine III, German Centre for Cardiovascular Research, University Hospital Kiel, Partner Site Hamburg/Kiel/Lübeck, 2Internal Medicine III, German Centre for Cardiovascular Research, University Hospital Heidelberg, Partner Site Heidelberg/Mannheim

本文内容

摘要

本方案描述了一种在小鼠中诱导压力超负荷性心肌肥厚的新型主动脉缩窄技术。该方法采用内径固定的橡胶环进行缩窄。这一新技术有望在未来实验中提供更小的变异性和更可重复的数据。

摘要

小鼠主动脉缩窄术是研究心脏压力超负荷诱导的心肌肥厚及心力衰竭最常用的实验模型之一。既往使用的技术是在主动脉弓上绕线结扎，并以钝化的27 G针头作为支撑，以形成狭窄。该方法依赖术者手动收紧缝线，因此导致狭窄直径存在较大变异。Melleby 等人描述的一种新优化方法可显著降低变异并提高术后可重复性。这种新技术称为O型环主动脉缩窄术（ORAB），采用不滑脱的橡胶环替代传统的缝线，从而减少压力超负荷的变异性，并获得更一致的心肌肥厚表型。手术过程中，将O型环置于头臂干动脉与左颈总动脉之间。通过超声心动图确认缩窄是否成功。术后1天，O型环引起的狭窄可导致横主动脉血流速度增加。术后2周，可通过射血分数下降和心壁增厚证实心脏功能受损。重要的是，除了狭窄直径变异更小外，ORAB与横主动脉缩窄术（TAC）相比，术中及术后死亡率更低。因此，ORAB是一种优于常用TAC手术的方法，可获得更高可重复性的实验结果，并可能减少所需实验动物数量。

引言

生理性心脏肥大可出现在发育期、运动或妊娠期间，而病理性心脏肥大则是对动脉高血压、瓣膜性心脏病或基因突变等血流动力学应激状态的响应。最初，心脏经历一种以心肌细胞体积增大和心室壁增厚为特征的重构过程，以维持心脏功能1,2。然而，病理性心脏重构与心律失常、猝死风险增加以及高死亡率密切相关。最终，随着时间推移，会导致心室扩张、收缩功能显著下降，并逐步进展为心力衰竭（HF），后者具有高发病率、高死亡率以及巨大的社会经济负担3。因此，迫切需要深入了解其分子机制，以开发新的治疗策略4。

主动脉缩窄是一种模拟由压力超负荷引起的小鼠左心室（LV）肥厚和心力衰竭的模型5。利用该方法，可在体内研究压力超负荷诱导的心脏重构的病理机制in vivo。Rockman 等人首次报道了小鼠主动脉缩窄手术6。通过在主动脉（位于头臂干动脉与左颈总动脉之间）周围使用缝线结扎来诱导压力超负荷。为形成直径为 0.4 mm 的狭窄，将缝线环绕于 27 G 针头和主动脉周围。结扎后，取出针头6,7。

尽管针头直径是固定的，但缝线的松紧程度在很大程度上取决于手术操作者，因此会影响心脏肥厚表型的诱导效果。此外，在基于缝线的方法中，术后缩窄直径存在一定程度的变异，导致死亡率较高8,9。而且，该方法的学习难度较大，尤其是在掌握缝线收紧的合适程度和一致性方面。最后，在训练初期，常因主动脉破裂或其他组织损伤而导致较高的术中和术后死亡率，同时在存活动物中也存在缩窄程度的高度变异性。

最近，Melleby 等人描述了一种优化的主动脉缩窄手术方案10。他们提出了ORAB（O型环主动脉缩窄）方法，通过使用内径固定为0.71 mm、0.66 mm和0.61 mm的防滑橡胶O型环，实现了更小的狭窄程度变异和高度可重复的压力超负荷水平。简而言之，将O型环切开后套在升主动脉弓上，再用缝线将其重新闭合。其他使用此类O型环的研究人员也报告了诱导的心肌肥厚变异更小9，同时观察到术中和术后死亡率较低，并且诱导的肥厚表型具有更好的可重复性和更小的差异性9,11。本文详细描述了这一独特策略的操作步骤。本报告中分享的技术经验将有助于其他科研人员改进该领域的实验技术。

为了诱导在6周后导致心力衰竭的心肌肥厚，建议使用12周龄的C57BL/6N雄性小鼠进行手术。在主动脉缩窄术后2周对C57BL/6N和C57BL/6J两个小鼠亚系进行比较，结果显示C57BL/6N小鼠出现严重的心功能障碍以及相关死亡率升高。因此，该品系更适用于心力衰竭模型12。12周龄的雄性和雌性小鼠体型适中，便于暴露主动脉并使用特殊器械放置O型环。

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方案

动物实验遵循石勒苏益格-荷尔斯泰因州地区委员会（Ministerium für Energiewende, Landwirtschaft, Umwelt, Natur und Digitalisierung des Landes Schleswig-Holstein，许可编号：V242-21249/2020 [38-4/20]）的原则进行。本研究使用的小鼠购自商业来源（见 材料表）。动物在标准条件下饲养，光照周期为12小时光照、12小时黑暗；可自由获取水和食物 随意.

1. 动物护理

  1. 将小鼠饲养在专用笼具中，笼内应包含垫料、筑巢材料、藏身处，并提供充足的饮水和食物。
  2. 对动物实施持续的专门兽医监护和治疗。
    注意：对于从外部供应商订购的小鼠，在开始实验前请确保有 7 天的适应期。

2. O形圈的制备

注意：建议使用内径为 0.4 mm 的O形环，可在 2 周后诱导心脏肥厚。所诱导的心脏表型程度和严重性取决于O形环内径的大小。

  1. 首先，在显微镜下使用剪刀或手术刀对 O 形圈（见材料表）进行一次切割，以便将其套入主动脉（图 1A、B）。
  2. 用连接有 8-0 不可吸收缝线的针在每个环的两侧靠近切口处穿刺，并拉出缝线。在一侧剪留 2–3 cm，另一侧留 2 cm，用于最后一步将 O 形圈固定在主动脉周围（图 1C、D）。
  3. 手术前，取结扎辅助装置（物种专用器械，见材料表），将其中一侧缝线较长的一端穿过该装置的缩窄孔（图 1E、F）。将带有 O 形圈的结扎辅助装置放置一旁，待下一步（第 6 步）使用。
  4. 为对带缝线的 O 形圈进行消毒，将其置于酒精溶液中浸泡半小时。之后放在滤纸或纤维素材料上晾干。将干燥后的 O 形圈保存在密闭管或容器中，直至使用。手术过程中，在将缝线穿过结扎辅助装置后，应将 O 形圈置于洁净表面上，直至使用。

结扎手术操作示意图，包含步骤、剪刀、线穿过辅助孔、显微镜视野。
图 1：进行结扎用 O 形环的制备。（A）使用剪刀或手术刀从一侧剪开一个固定直径的 O 形环。（B）O 形环的图像。（C）用 8-0 Prolene 缝线分别穿刺 O 形环的两端。（D）已穿入两根缝线的 O 形环。（E）将 O 形环一端的缝线穿过结扎辅助装置的小孔。（F）放置前的最终状态：一端的缝线已穿过结扎辅助装置的小孔，另一端的缝线保持松散。 请点击此处查看该图的高清版本。

3. 小鼠的术前给药及手术区域的准备

  1. 为了在手术期间获得充分的镇痛效果，注射镇痛剂丁丙诺啡（0.1 mg/kg，参见 材料清单在进行手术前20分钟，通过腹腔注射给药。
    注意：本研究中使用的镇痛药物遵循实验动物科学学会（Gesellschaft für Versuchstierkunde/Society of Laboratory Animal Science，GV-SOLAS）的建议。
  2. 麻醉前给药后，将小鼠置于麻醉诱导舱中，使用2%-4%异氟烷与1.0 L/min的100% O₂混合气体进行麻醉2.
  3. 剃除镇静小鼠左侧胸壁的毛发。剃毛后，将小鼠放回充满异氟烷的麻醉舱，待麻醉充分后进行插管。
    注意：合适的镇静时间点表现为呼吸缓慢，但应避免急促呼吸。根据异氟烷气体的设定，通常需要 2-3 分钟达到适当的镇静水平。
  4. 手术前打开加热垫以维持动物体温（37 °C）。将加热垫连接至直肠探头（参见 材料清单以自动维持小鼠的体温。

4. 小鼠插管

  1. 准备所需的仪器（图 2A)。手术前将喉镜放入酒精中消毒约1-3分钟，随后过夜晾干。
  2. 用橡皮筋将加热垫上的小鼠固定，使其前齿卡在板上。将麻醉后的小鼠仰卧置于加热垫上。
  3. 将橡皮筋套在动物的前齿上，以在平板上拉伸其颈部。
  4. 将光源聚焦于咽喉部位，以清晰观察气管开口，便于进行气管插管图2B).
  5. 用一只手轻轻打开口腔，同时放置插管辅助工具（自制喉镜，参见） 材料清单) (图 2A[3]).
  6. 用另一只手和小镊子轻轻移动舌头，以暴露气管开口。
  7. 用同一只手将气管插管插入气管中。另一只手仍握住插管辅助工具。进行插管时，使用22 G套管针（参见 材料列表) (图2A[1]).
  8. 连接气管插管位置 通过 一个三通旋塞阀连接至呼吸机（参见 材料清单) 以确认小鼠气管插管位置正确（气管内）。
  9. 根据制造商的说明监测右侧肺通气（潮气量 200 µL 呼吸频率在每分钟100-150次之间）图2C).
  10. 通过脚趾夹捏反射检查确认麻醉深度是否足够（无反射反应）。
  11. 将麻醉设置调整为2%异氟烷与0.5–1.0 L/min的100% O₂混合气体2.
  12. 手术期间在眼睛上涂抹眼药膏以防止干燥。
  13. 使用棉签，用市售消毒液对手术区域消毒3次（参见 材料表).

小鼠插管过程，显示所用工具；用于生理学研究的实验设置。
图2：小鼠插管操作。（A）插管器械：（1）22 G 静脉留置针用作气管插管（去除针芯）；（2）镊子；（3）自制喉镜（将留置针头端压扁变形后，用木棍和胶带固定制成）。（B）在加热垫上进行插管操作。（C）已插管的小鼠连接至呼吸机。请点击此处查看该图的放大版本。

5. 手术及环位放置的准备

注意：使用无菌材料和仪器以避免感染。

  1. 使用剪刀在剑突与左侧腋窝连线的中点处做一长度为 0.5–1 cm 的皮肤切口。用镊子将肌层与下方肋骨分离，并将两个牵开器（5 mm 长，见材料表）置入切口，以暴露肋骨 cage。
  2. 开始左侧开胸时，使用显微弹簧剪刀在第二与第三肋骨之间的肋间肌处做一个小切口（约 1–2 mm）。打开胸腔，并用 45° 角度的镊子扩大切口。
  3. 将三个胸腔牵开器（1.0–2.5 mm 长）置入切口，以撑开胸腔，改善视野暴露。
  4. 为暴露主动脉弓，使用尖端精细的 45° 角度镊子轻轻上抬并分离覆盖在弓部的胸腺及脂肪组织。

6. 使用O型环结扎横行主动脉

  1. 暴露主动脉弓 45° 一手持持针器，另一手持结扎辅助装置的O形环，进行定位 通过 一侧的螺纹（步骤 2）。
  2. 从头臂干动脉与左颈总动脉之间的主动脉弓下方，由尾侧向头侧使用结扎辅助工具穿过线绳图3A).
  3. 用镊子小心地夹住结扎辅助装置和主动脉弓上的两根线头。牵拉并移除结扎辅助装置，通过向两侧拉动线头，将O型环轻柔地套入主动脉弓图3B).
  4. 成功定位后，用缝线和外科结固定O形圈。额外再打一个结，以防止两侧的结松开图3C).

手术程序示意图：三步法胸腺O形环置入，步骤标记为A、B、C。
图3：进行O形环植入。（A）使用1.0–2.5 mm的三个牵开器暴露主动脉弓。将O形环一侧的两根长线从主动脉下方穿过。（B）通过轻柔推动O形环并牵拉缝线将其放置到位。（C）O形环已置于正确位置，每侧将头端缝线与尾端缝线打结固定。请点击此处查看该图的放大版本。

7. 缝合与术后恢复

  1. 从切口处移除三个胸腔拉钩（2.5 mm 长度）。
  2. 如有需要，通过向胸腔内注入温热的 0.9% 等渗盐溶液，以排除残留空气。
  3. 为暴露胸腔切口以便缝合，再次使用两个拉钩（5 mm 长度）将皮肤两侧提起。
  4. 使用两到三根 6-0 不可吸收缝线（见材料表）关闭胸腔，并关闭呼吸机气流 2 秒，使肺重新膨胀。
  5. 移除两个拉钩，使用三到五根 4-0 可吸收缝线关闭皮肤。
  6. 关闭异氟烷和监测设备。当动物开始自主呼吸、胡须活动且足趾夹捏反射可被诱发时，拔除气管插管。将小鼠置于其护理单元的加热灯下，侧卧位放置，并持续观察直至完全清醒。
  7. 在动物未完全恢复意识前，不得无人看护。
    注意：接受手术的动物应单独安置于一个护理单元（笼具）中，以利于恢复。
  8. 术后如需镇痛，可通过饮水中添加曲马多（1 mg/mL）持续 7 天，并在术后 3 天内每日三次腹腔注射布托啡诺（0.1 mg/kg）。
    注意：术后镇痛应遵循当地动物伦理委员会的建议。
  9. 通过每日称量水瓶重量检查药物摄入情况，并观察动物行为。

8. 确认套环成功缩窄及位置正确

  1. 术后一天，通过超声测量狭窄处的最大血流速度，以确认狭窄情况。
  2. 测量时使用配备30 MHz频率换能器探头的超声系统进行超声心动图检查（参见材料表）。
  3. 如上所述，通过面罩维持1.5%–2%异氟烷与0.5–1.0 L/min的100% O2进行麻醉。
  4. 将麻醉后的动物仰卧位放置于加热垫上，通过直肠探头连接加热垫以维持体温在37 °C ± 1 °C，并使用四只小鼠足爪传感器连接心电图（ECG）监测心率（参见材料表）。
  5. 为获得更清晰的成像，可使用脱毛膏进行脱毛处理。
  6. 成功实施ORAB后，通过超声测量可见狭窄处血流速度增加（约2,400 mm/s）（图4C）。进行该测量时，将换能器探头置于右侧胸壁旁胸骨位置，通过二维（2D）成像（“B模式”）定位主动脉弓。
    1. 使用彩色多普勒显示主动脉内的血流，并利用脉冲波多普勒测量狭窄处的血流速度。
      注：假手术小鼠（未进行缩窄的对照手术）的血流速度约为600–900 mm/s。此外，成功的ORAB还会导致小鼠右侧颈动脉（~150 mm/s）（RC，图4A）与左侧颈动脉（~300 mm/s）（LC，图4B）之间的血流速度比升高。
  7. 通过二维（2D）成像（B模式）可视化左右颈内动脉。将换能器探头以45°角水平置于颈部左右两侧，并使用脉冲波多普勒测定血流速度。
    注：在假手术小鼠中，两侧动脉的血流速度相似。

动脉血流速度；多普勒超声图与主动脉示意图；心血管研究分析。
图 4：通过颈动脉脉搏波多普勒速度测量确认横主动脉结扎。 （A）右侧颈动脉的典型脉冲波多普勒速度信号。（B）狭窄导致右侧颈动脉的血流速度高于左侧。（C）由缩窄引起的狭窄导致降主动脉的血流速度超过 2,400 mm/s。假手术小鼠的血流速度为 600–900 mm/s。请点击此处查看该图的放大版本。

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结果

通常，主动脉缩窄术可模拟人类主动脉瓣狭窄，并在小鼠中诱导心肌肥厚。成功的手术以心肌组织重塑为特征，表现为心肌肥厚和心功能下降5,6。

术后第1天即可通过超声心动图体内评估横主动脉O型环缩窄的效果13。通过脉冲波多普勒超声测量主动脉狭窄处血流速度升高，可证实主动脉狭窄造模成功（图4C）。此外，如上所述，我们测定右侧与左侧颈内动脉之间的血流速度比值，作为ORAB的功能性指标（图4A、B）。

放置0.4 mm O形环两周后，可通过超声心动图确定心肌肥厚是否成功诱导。二维（2D）时间运动模式（M型）可显示心脏结构在心动周期中的变化情况。术后两周，可观察到舒张期左心室（LV）后壁（LVPW）和室间隔（IV...

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讨论

基于缝线/缝合的主动脉缩窄术多年来一直用于在小鼠中诱导压力超负荷性心肌肥厚。这是一种成熟的体内研究心脏重构及疾病进展病理机制的方法。in vivo。其局限性在于狭窄程度以及随之而来的心脏重构存在相对较大的变异性。Melleby 等人最近提出的 ORAB 技术10通过使用橡胶O型环对传统方法进行了优化。

该技术最重要的优势在于O形环具有固定的直径，这使得狭窄程度的变异性更小，从而在术后产生更可重复的心肌肥厚表型。另一优点是该方法学习更快、操作更简便。在基于缝线/缝合的手术过程中，通常需要花费时间和经验来找到围绕主动脉结扎的合适程度。相比之下，由于O形环具有固定直径，采用O形环法时无需在这方面进行类似的调整。

开胸手术是ORAB技术中的关键步骤，虽然对动物具有疼痛性，但对于O型环结扎是必要的。为了实现更好的恢复并避免肺不张的发生，重要的是要防止肺损伤，并通过呼吸机监测通气情况。对于基于缝线的方法，存在采用微创技术的可能性。在此操作中，仅需使用一对镊子撑开组织，以便将...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由德国联邦教育与研究部（BMBF）资助，受助人为 L.L.、N.F. 和 O.J.M.（IVOLADMT-HF；项目编号 FKZ 01KC2006A）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 个长固定器，6 厘米 18200-01
2 个钝性拉钩，5 毫米宽 18200-11
2 个短固定器，3 厘米 18200-02
2 把精细尖端 45° 弯角镊子 FST (fine sience tools)11160-10
3 个钝性拉钩，2.5 毫米宽 18200-10
3 根拉钩用金属丝 18200-05
4-0 可吸收缝线（Vicryl）ETHICONSABBKLT0用于皮肤缝合
6-0 缝线（Prolene），针长：13 毫米ETHICONJDP879用于胸肌缝合
8-0 缝线（Prolene），针长：6.5 毫米ETHICONRHBECH用于固定环状结扎器 
小型麻醉箱Havard apparatus 50-0108
C57BL/6N 小鼠Charles River
Fluosorber 活性炭过滤罐Havard apparatus 34-0415用于诱导和维持麻醉
自制喉镜 辅助插管
Harvard Apparatus 麻醉蒸发器Havard apparatus 用于诱导和维持麻醉
加热垫 + 直肠探头（LSI Letica Scientific Instruments：温度控制单元 HB 101/2）Panlab/ Havard apparatus 用于控制和维持体温 
静脉套管针，蓝色，22 号（Vasofix Braunüle 0.9 x 25 mm）B/Braunsharing Expertise 4268091B用于插管 
异氟烷Baxter麻醉剂
Kodan（聚维酮碘溶液）Schülke20003960-A消毒 
结扎辅助工具FST (fine sience tools)18062-12用于使用 O 形环进行结扎 
显微镜照明系统：Schott VisiLED 集成套件 MC1500/S80-55（含控制器）SCHOTT照明
显微镜 摄像头 （Leica IC80 HD）Leica用于术区可视化 
小型啮齿类动物专用 MiniVac 全套麻醉系统 Havard apparatus 75-0233用于诱导和维持麻醉
小鼠呼吸机 MiniVent 型号 845Havard Apparatus 73-0044用于手术期间通气 
持针器 FST (fine sience tools) TE-10804
O 形环，防滑橡胶材质（0.0018 毫米 x 0.020 毫米）Apple Rubber Products 用于主动脉弓结扎
剪刀FST (fine sience tools)14040-09用于剪开皮肤和缝线 
小型动物牵开系统（适用于体重不超过 200 克的动物）FST (fine sience tools)18200-20
小型底板，20 x 30 厘米  18200-03
集成加热垫 + 直肠探头 + 心电图及 换能器三脚架的手术台FujiFilm Visual Sonics Imaging System用于超声心动图检查 
镇痛药 Temgesic（丁丙诺啡）Indivior UK Limited997.00.00术前镇痛用药 
三通旋塞阀（蓝色）
镇痛药 Tramal（曲马多）Grünental术后镇痛用药 
换能器探头 MS400（Visual Sonics） FujiFilm Visual Sonics Imaging System用于超声心动图检查 
配备心血管分析软件包的超声系统 FujiFilm Visual Sonics Imaging System用于超声心动图检查 
Vannas 弹簧剪刀 - 2.5 毫米刃口FST (fine sience tools)15000-08用于剪断肋间胸肌 
兽用眼膏 Bepanten用于防止眼睛干涩

参考文献

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  13. deAlmeida, A. C., van Oort, R. J., Wehrens, X. H. Transverse aortic constriction in mice. Journal of Visualized Experiments. (38), e1729(2010).

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