本方案描述了从羊膜（AM）中提取lumican的方法，以及将羊膜提取物（AME）在-20 °C、4 °C和室温（RT）下分别保存6、12、20和32天的储存条件，以定量其蛋白质含量和lumican浓度。
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本文内容
摘要
摘要
Lumican 是人羊膜（AM）中的一种小型富含亮氨酸的蛋白聚糖，可促进角膜上皮化及胶原纤维的有序排列，从而维持角膜透明性。本研究提出一种从羊膜中提取 Lumican 蛋白的方法，并评估羊膜提取物（AME）在不同温度和储存时间下的 Lumican 稳定性。取 100 mg 羊膜样品解冻后进行机械法去上皮处理，将去上皮后的羊膜冷冻并研磨成细粉，加入 2.5 mL 含蛋白酶抑制剂的生理缓冲液溶解，离心后收集上清液用于蛋白提取。将上清液分别在 -20 °C、4 °C 和室温（RT）下储存 6、12、20 和 32 天，随后对各 AME 样品中的 Lumican 含量进行定量分析。该方法提供了一种简便且可重复的 Lumican 提取方案。Lumican 的浓度受储存时间和温度条件的影响。储存 12 天后，-20 °C 和 4 °C 条件下 AME 中的 Lumican 浓度显著高于其他组。该 Lumican 提取方法有望用于开发治疗手段和药物制剂。未来仍需进一步研究以明确 AME 中 Lumican 在再上皮化及伤口愈合过程中的具体应用价值。
引言
羊膜移植是治疗角膜疾病最常用的方法之一；然而近年来，出现了利用羊膜组织各种组分作为替代或辅助治疗手段的新方案。在羊膜（AM）的诸多组分中，研究最为广泛的是来源于羊膜提取物（AME）的成分1,2,3,4,5,6,7。羊膜含有多种可溶性因子，包括抗血管生成蛋白、白细胞介素（IL）、基质金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs）、由TSG-6介导的抗炎蛋白（可抑制中性粒细胞胞外诱捕网）、生长因子：表皮生长因子（EGF）、转化生长因子（TGF）（α和β）、角质形成细胞生长因子（KGF）、肝细胞生长因子（HGF）以及调节胶原原纤维生成从而维持角膜透明性的卢米坎（lumican）1,2,3,4,5,6,7,8,9。
Lumican 是一种小型富含亮氨酸的蛋白聚糖（SLRP），是角膜基质基质中主要的细胞外间质胶原酶成分之一，负责胶原纤维的有序排列并维持角膜透明性4,10,11。蛋白聚糖是存在于细胞外基质（ECM）中的分子，主要参与细胞信号传导及细胞内稳态的维持12。已有研究报道，ECM 蛋白可在伤口愈合过程中驱动细胞的增殖、分化和迁移等生物学过程11。
有证据表明，lumican可能参与角膜上皮再生过程。Saika等人在一项研究中发现，角膜损伤后，可在伤后最初8小时至损伤后3天内在角膜角质细胞中检测到lumican。该蛋白聚糖在第2天和第3天浓度达到最高，随后在第7天时无法检测到13。这些数据提示lumican参与了角膜上皮再生过程的激活。另一方面，另一项研究报道，lumican的缺失会延缓上皮再生；有趣的是，外源添加lumican可加速上皮再生过程4,11,13。同样，最近一项研究报道，lumican可调节角膜缘成纤维细胞的炎症功能14，这表明lumican在炎症反应、抗纤维化反应及上皮再生反应中具有调节作用。类似地，lumican可通过与Fas-FasL等信号分子相互作用来调节角膜的生物学反应。此外，在lumican基因敲除（Lum-/-）小鼠模型中，lumican的缺失被证实会阻碍角膜的正常修复15。
该方法主要旨在展示一种可行且易于操作的从羊膜中提取卢米坎（lumican）的方法。通过这种具有优势的卢米坎提取方法，可以获得相似浓度的蛋白质，缩短处理时间，相较于以往研究，为研究人员提供了更大的便利性16。此外，这种羊膜来源的卢米坎可作为角膜修复和再上皮化过程的辅助剂使用。
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方案
所有实验程序均经机构审查委员会批准（项目编号：CEI-2020/06/04）。羊膜（AM）取自中国台湾康德·瓦伦西亚眼科研究所羊膜库（来自匿名人类供体），其制备方法如 Chávez-García 等人所述17。
1. 羊膜提取物的制备
- 从羊膜库中获取 100 mg 羊膜组织（AM）。
注意：根据先前的报道，50 mg 羊膜可分泌总量为 10 ng/mL 的亮氨酸蛋白聚糖（lumican）14。为获得更高浓度的亮氨酸蛋白聚糖，使用 100 mg 羊膜，相当于总面积为 32 cm2。 - 若羊膜组织为冷冻状态，请在室温下解冻。
注意：以下所有操作均应在 II 类 B 型生物安全柜中进行。 - 在培养皿中用 10 mL 无菌平衡盐溶液（BSS，参见 材料表）清洗羊膜组织 2 分钟。
- 将 BSS 倒入烧杯中。
- 重复步骤 3，并通过肉眼确认培养皿中的 BSS 不含甘油培养基。
注意：根据需要重复步骤 3，直至培养皿中的 BSS 不再含有甘油培养基。
- 将羊膜组织与 10 mL 分散酶 II（1.7 IU/mL，参见 材料表）在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 30 分钟。
注意：分散酶 II 是一种对上皮细胞作用温和的中性蛋白酶。该酶可有效将完整的表皮与真皮分离，并获得完整的上皮细胞层18。 - 分散酶孵育后，使用橡胶刮刀（参见 材料表）进行机械性去上皮化处理14。通过显微镜观察确认去上皮化效果。
注意：使用倒置显微镜配合 4× 和 20× 物镜验证去上皮化过程。观察组织以排除任何细胞层的存在。 - 在培养皿中用 10 mL BSS 清洗羊膜组织 2 分钟。将 BSS 倒入烧杯中。
- 将去上皮化的羊膜组织（dAM）放入一个 2 mL 微量离心管中。将其浸入液氮中 40 分钟。
- 在预冷至 -85 °C 的研钵中手动研磨冷冻的 dAM 2–3 分钟，直至形成细粉。
- 在研钵中加入 2.5 mL 蛋白酶抑制剂溶液（含蛋白酶抑制剂的 BSS），溶解 dAM 粉末。
注意：每片蛋白酶抑制剂含有以下酶混合物：胰腺提取物（0.02 mg/mL）、热稳定蛋白酶（金属蛋白酶）（0.0005 mg/mL）、糜蛋白酶（0.002 mg/mL）、胰蛋白酶（0.02 mg/mL）和木瓜蛋白酶（0.33 mg/mL）（参见 材料表）。 - 使用微量移液器收集混合物，并借助手术刀片清洁研钵内壁。将混合物转移至 5 mL 离心管中。
- 使用涡旋振荡器充分混匀 30 秒。
- 将组织混合物在 4 °C 条件下以 34 × g 离心 20 分钟，随后立即在 4 °C 条件下以 3360 × g 离心 20 分钟，以实现组织均质化。
- 所获得的上清液即为羊膜提取物（AME）（图 1）。将每份 AME 分装为 0.7 mL，分别置于不同的 2 mL 微量离心管中，并在 -20 °C、4 °C 和室温（RT）条件下分别储存 6、12、20 和 33 天。
图1：AME制备及lumican浓度测定流程。 将100 mg羊膜（AM）在37 °C下与dispase II共同孵育30分钟，并进行机械去上皮化处理。去上皮化的AM经洗涤后浸入液氮中40分钟，随后研磨至细粉状，加入2.5 mL含蛋白酶抑制剂的生理缓冲液溶解，并进行离心。收集上清液，分别在-20 °C、4 °C和室温下保存6、12、20和32天，用于总蛋白及lumican的定量分析。请点击此处查看该图的放大版本。
2. AME 蛋白定量
注意：必须在获得AME后立即进行总蛋白的定量。使用Lowry蛋白测定法进行蛋白质定量，并遵循制造商的说明（参见材料表）。建议所有标准品和样品均设三个重复孔进行检测。
- 将每种 AME 样品各 40 µL 用移液器加入 96 孔微孔板中。
- 在同一微孔板中使用牛血清白蛋白（BSA）标准品制备标准曲线，最终 BSA 浓度为 0–1,500 µg/mL（0、1、5、25、125、250、500、750、1,000 和 1,500 µg/mL）。
- 向每个孔中加入 200 µL 改良 Lowry 试剂。立即在板式混合器上混匀 30 秒。
- 用铝箔覆盖微孔板，并在室温下孵育 10 分钟。
- 向每个孔中加入 20 µL 1x Folin-Ciocalteu 试剂。立即在板式混合器上混匀 30 秒。
注意：配制 1x Folin-Ciocalteu 试剂时，将 2x（2N）试剂与超纯水按 1:1 比例稀释。该试剂需在使用当天现配，因稀释后不稳定。 - 用铝箔避光覆盖微孔板，并在室温下孵育 30 分钟。
- 使用酶标仪在 660 nm 处测定各样品的吸光度（参见 材料表）。
注意：颜色可在 650 nm 至 750 nm 波长范围内测定。 - 计算标准空白样品在 660 nm 处吸光度的平均值，并从标准品及未知样品的其他 660 nm 吸光度值中减去该值。
- 使用酶标仪以终点法测定吸光度，测定前低速振荡 10 秒。
- 利用标准曲线确定每个未知样品的蛋白浓度。
- 计算蛋白含量时，通过线性回归图确定浓度，以吸光度值为 Y 轴，各标准 BSA 曲线浓度（mg/mL）为 X 轴。
- 获得线性回归方程及 r 值，用于计算蛋白浓度。
注意：结果以总蛋白相对于 AM 组织质量的归一化相对浓度表示（µg/mL 蛋白/mg AM 组织）。
- 获得线性回归方程及 r 值，用于计算蛋白浓度。
3. AME 中 Lumican 的定量分析
注意：必须检测在不同储存条件和时间下保存的 AME 中的 lumican 浓度。使用夹心 ELISA 法定量 lumican，并遵循试剂盒制造商的说明。建议所有标准品和样品均设复孔进行检测。
- 用磷酸盐缓冲液（PBS）将人lumican捕获抗体（见材料表）稀释至工作浓度。
注意：捕获抗体小瓶中含有120 µg抗体。用0.5 mL PBS重悬后，将捕获抗体稀释至2 µg/mL的工作溶液。- 立即用移液器将100 µL稀释后的捕获抗体加入96孔微孔板的每个孔中。密封微孔板，并在室温下孵育过夜。
- 吸去每孔液体，并使用多通道移液器加入300 µL洗涤缓冲液（PBS中含0.05%聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯20，pH 7.2–7.4）（见材料表）进行洗涤。重复洗涤三次。
注意：最后一次洗涤后，将微孔板倒置并轻轻敲击纸巾，以去除残留的洗涤缓冲液。 - 向每孔加入300 µL试剂稀释液（PBS中含1% BSA，pH 7.2–7.4，经0.2 µm滤膜过滤）（见材料表）以封闭微孔板。在室温下孵育1小时。
- 重复步骤2。
- 在96孔微孔板中制备标准曲线，使用两倍系列稀释法，最终浓度分别为125、250、500、1,000、2,000、4,000和8,000 pg/mL（起始浓度为0–8,000 pg/mL）。ELISA lumican试剂盒包含75 ng重组lumican标准品（见材料表）。
- 向已包被捕获抗体的96孔微孔板中每孔加入100 µL样品和标准品。
- 盖上微孔板，在室温下以2–3 rpm的低速振荡条件于小型摇床上孵育2小时。
- 重复步骤2。
- 向每孔加入100 µL生物素标记的检测抗体（见材料表）。避光，于室温下以2–3 rpm的低速振荡条件在小型摇床上孵育2小时。
注意：生物素标记的检测抗体小瓶中含有24 µg抗体。用1.0 mL试剂稀释液重悬后，将生物素标记的检测抗体稀释至400 ng/mL的工作溶液。 - 重复步骤2。
- 向每孔加入100 µL链霉亲和素-辣根过氧化物酶（HRP）工作稀释液（见材料表）。避光，于室温下孵育20分钟。
注意：活性链霉亲和素-HRP为40倍浓缩液。使用试剂稀释液配制1×工作溶液。
注意：避免将微孔板暴露于直射光下。 - 重复步骤2。
- 最后，向每孔加入100 µL底物四甲基联苯胺（TMB）溶液（见材料表）。
注意：使用试剂盒中提供的稳定化30%过氧化氢溶液与TMB溶液等体积混合配制TMB工作液。
注意：应在使用前立即配制该溶液，并保持在室温下。 - 在避光条件下于室温孵育30分钟。
注意：避免将微孔板暴露于直射光下。不要吸去TMB溶液，因后续无需进一步洗涤。 - 每孔加入50 µL 1N H2SO4终止液以终止显色反应。轻轻敲击微孔板以确保充分混匀。
- 立即使用酶标仪在450 nm波长下测定各孔的吸光度。
- 使用酶标仪在终点模式下测定吸光度，低速振荡10秒。
- 计算标准空白样品在450 nm处的平均吸光度值，并从标准品和未知样品的其他450 nm吸光度值中减去该值。
- 利用标准曲线确定每个未知样品的lumican浓度。
- 计算lumican浓度时，以标准曲线各点的吸光度值为Y轴，对应浓度（pg/mL）为X轴，绘制线性回归图。
- 获得线性回归方程及r值，用于计算lumican浓度。
注意：lumican浓度根据所提取组织的毫克数进行归一化处理。结果以每毫克羊膜组织中lumican的归一化相对浓度表示（ng/mL lumican/mg AM组织）。
- 获得线性回归方程及r值，用于计算lumican浓度。
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结果
结果以均值 ± 标准差（SD）表示。Student's t采用t检验和方差分析（ANOVA）进行统计分析。 P-值 < 0.05 被认为具有统计学显著性。统计分析使用统计软件进行（见 材料表).
AME 中的总蛋白含量受时间和储存条件的影响。所有 AME 之间的基础蛋白浓度相似，总蛋白含量范围为 2.7 ± 0.3 µg/mL，各检测样本之间无显著差异。然而，当样本分别储存 12、20 和 32 天后，观察到蛋白浓度相对于基础浓度出现变化。有趣的是，在所有储存时间点，4 °C 和 -20 °C 条件下 AME 的蛋白浓度均高于室温（RT）条件。
同样，在比较不同储存时间的蛋白质浓度时，发现在12天、20天和32天后蛋白质浓度发生了变化。在4 °C和-20 °C条件下保存32天和20天的AME与室温（RT）条件相比，差异显著（p < 0.05）（图2），表明温度对所获得的...
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讨论
本研究分析了角膜上皮基质提取物（AME）中存在lumican的情况，并探讨了其在不同储存条件下与稳定性的直接相关性。有趣的是，当对AME中的总蛋白浓度进行定量时，发现储存后蛋白浓度有所增加。有证据表明，冷冻储存过程中可能通过三种机制改变蛋白浓度：冷变性、溶质的冷冻浓缩以及冰诱导的蛋白质结构部分展开19。冷冻过程可能由于样品中液相的结晶而影响储存样本的蛋白浓度。结果提示，这可能是由于冷冻浓缩过程所致，并受到冰箱中储存时间的影响。在较长储存时间（32天和20天）以及较低温度（4 °C和-20 °C）下，观察到更高的蛋白浓度。然而，蛋白浓度最高的时段并未表现出lumican的最高浓度；这表明lumican可能受到冷冻温度和储存时间条件的影响。
根据实验结果，Lumican 在 4 °C 和 -20 °C 条件下储存 12 天时浓度更高且更稳定。然而，在储存 6 天时 Lumican 的浓度低于 12 天时的浓度。有研究报道，蛋白质浓度在冷冻储存后可能发生改变20。该结果可能由一种称为冰诱导蛋白...
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披露
本研究由墨西哥国立自治大学研究与技术创新项目支持计划（资助号：PAPIIT IN203821）以及教育部、科学技术与创新部（资助号：SECTEI 250/2019）资助。
致谢
作者无竞争性财务利益。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 N H2SO4 终止液 | R&D Systems | DY994 | |
| 100 μL 微量移液器 | Eppendorf | ||
| 1000 μL 微量移液器 | Eppendorf | ||
| 15 mm 培养皿 | Symlaboratorios | ||
| 18 G 针头（1.2 mm × 40 mm） | BD Becton Dickinson | 305211 | |
| 2 mL 微量离心管 | Eppendorf | Z606340 | |
| 20 mL 塑料注射器 | BD Becton Dickinson | 302562 | |
| 20 μL 微量移液器 | Eppendorf | ||
| 20–200 μL 微量移液器 | Eppendorf | ||
| 5 mL 微量离心管 | Eppendorf | 30119401 | |
| 96 孔微孔板 | SARSTEDT | 821581 | |
| 铝箔 | N/A | N/A | |
| 羊膜 | Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana Amnion Bank | 100 mg | |
| 平衡盐溶液 | Bausch + Lomb | BSS-403802 | |
| 烧杯 | N/A | N/A | |
| BioRender | BioRender | 图示设计 | |
| Compact Rocker 振荡器 | BioRad | 970822DD | 型号 5202SD-BIO |
| 完全型、无 EDTA 蛋白酶抑制剂 混合片剂 | Roche | 11 873 580 001 | 蛋白酶抑制剂 |
| Daiggner 涡旋振荡器 Genie 2 | A.Daigger & Co. , INC | 22220A | |
| Dispase II | Gibco | 17105-041 | |
| ELISA 板分光光度计 | Thermo Labsystems | 35401106 | Multiscan |
| 冷冻机 | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc | 版本 9 | 统计分析与绘图软件 |
| 人源 Lumican DuoSet ELISA 试剂盒 | R&D Systems | DY2846-05 | 包含人源 Lumican 捕获抗体 |
| 培养箱 | Forma Scientific | 3326 S/N 36481-7002 | |
| 倒置光学显微镜 | Olympus | 6A13921 | 用于确认去上皮化效果 型号 CK2 |
| 层流罩 | Forma Scientific | 14753-567 | 型号 1184 |
| 液氮 | N/A | N/A | |
| 研钵 | N/A | N/A | |
| 多通道移液器 | Eppendorf | ||
| 氮气罐 | Thermo Scientific | 型号 Biocan 20 | |
| 纸巾 | N/A | N/A | |
| 磷酸盐缓冲液 | R&D Systems | DY006 | |
| Pierce 改良 Lowry 蛋白质测定试剂盒 | Thermo Scientific | 23240 | |
| 板封膜 | R&D Systems | DY992 | |
| 试剂稀释液 | R&D Systems | DY995 | 含 1% BSA 的 PBS，pH 7.2–7.4，经 0.2 μm 滤膜过滤 |
| 冷冻离心机 | centurion scientific Ltd | 15877 | 型号 K2015R |
| 橡胶刮铲细胞刮刀 | NEST | 710001 | 用于机械去上皮化 |
| 手术刀片 | Braun | BB521 | 10 号或 21 号 |
| 链霉亲和素-HRP 40 倍浓缩液 | R&D Systems | 货号 893975 | |
| 底物四甲基联苯胺（TMB）溶液 | R&D Systems | DY999 | |
| 有齿镊子 | Invent Germany | 6b | 不锈钢 |
| 超纯水 | PISA | ||
| 洗涤缓冲液 | R&D Systems | WA126 | 含 0.05% Tween 20 的 PBS，pH 7.2–7.4 |
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