从羊膜中提取Lumican及其储存温度的确定

摘要

本方案描述了从羊膜（AM）中提取lumican的方法，以及将羊膜提取物（AME）在-20 °C、4 °C和室温（RT）下分别保存6、12、20和32天的储存条件，以定量其蛋白质含量和lumican浓度。

摘要

Lumican 是人羊膜（AM）中的一种小型富含亮氨酸的蛋白聚糖，可促进角膜上皮化及胶原纤维的有序排列，从而维持角膜透明性。本研究提出一种从羊膜中提取 Lumican 蛋白的方法，并评估羊膜提取物（AME）在不同温度和储存时间下的 Lumican 稳定性。取 100 mg 羊膜样品解冻后进行机械法去上皮处理，将去上皮后的羊膜冷冻并研磨成细粉，加入 2.5 mL 含蛋白酶抑制剂的生理缓冲液溶解，离心后收集上清液用于蛋白提取。将上清液分别在 -20 °C、4 °C 和室温（RT）下储存 6、12、20 和 32 天，随后对各 AME 样品中的 Lumican 含量进行定量分析。该方法提供了一种简便且可重复的 Lumican 提取方案。Lumican 的浓度受储存时间和温度条件的影响。储存 12 天后，-20 °C 和 4 °C 条件下 AME 中的 Lumican 浓度显著高于其他组。该 Lumican 提取方法有望用于开发治疗手段和药物制剂。未来仍需进一步研究以明确 AME 中 Lumican 在再上皮化及伤口愈合过程中的具体应用价值。

引言

羊膜移植是治疗角膜疾病最常用的方法之一；然而近年来，出现了利用羊膜组织各种组分作为替代或辅助治疗手段的新方案。在羊膜（AM）的诸多组分中，研究最为广泛的是来源于羊膜提取物（AME）的成分^{1,2,3,4,5,6,7}。羊膜含有多种可溶性因子，包括抗血管生成蛋白、白细胞介素（IL）、基质金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs）、由TSG-6介导的抗炎蛋白（可抑制中性粒细胞胞外诱捕网）、生长因子：表皮生长因子（EGF）、转化生长因子（TGF）（α和β）、角质形成细胞生长因子（KGF）、肝细胞生长因子（HGF）以及调节胶原原纤维生成从而维持角膜透明性的卢米坎（lumican）^1,2,3,4,

方案

所有实验程序均经机构审查委员会批准（项目编号：CEI-2020/06/04）。羊膜（AM）取自中国台湾康德·瓦伦西亚眼科研究所羊膜库（来自匿名人类供体），其制备方法如 Chávez-García 等人所述¹⁷。

1. 羊膜提取物的制备

1. 从羊膜库中获取 100 mg 羊膜（AM）。
   注意：根据先前的报道，50 mg 羊膜可分泌总共 10 ng/mL 的润滑素（lumican）¹⁴。为获得更高浓度的润滑素，使用 100 mg 羊膜，相当于总面积为 32 cm²。
2. 若羊膜为冷冻状态，需在室温下解冻。
   注意：以下所有操作均应在 II B 级层流生物安全柜中进行。
3. 在培养皿中用 10 mL 无菌平衡盐溶液（BSS，参见 材料表）清洗羊膜，持续 2 分钟。
   1. 将 BSS 倒入烧杯中。
   2. 重复步骤 3，并通过肉眼确认培养皿中的 BSS 不含甘油培养基。
      注意：根据需要重复步骤 3，直至培养皿中的 BSS 不含甘油培养基。
4. 将羊膜与 10 mL dispase II（1.7 IU/mL，参见 材料表

结果

结果以均值 ± 标准差（SD）表示。进行 Student t 检验和方差分析（ANOVA）。当 P 值 < 0.05 时认为具有统计学显著性。统计分析使用统计软件进行（见材料表）。

AME 中的总蛋白含量受时间和储存条件的影响。所有 AME 之间的基础蛋白浓度相似，总蛋白含量范围为 2.7 ± 0.3 µg/mL，所评估样品之间无显著差异。然而，当样品分别储存 12、20 和 32 天后，观察到蛋白浓度相对于基础浓度出现变化。有趣的是，在所有储存时间点，4 °C 和 -20 °C 条件下的 AME 蛋白浓度均高于室温（RT）条件。

同样，在比较不同储存时间的蛋白质浓度时，发现其在12天、20天和32天后均发生变化。在4 °C和-20 °C条件下，储存32天和20天的AME与室温条件相比，差异显著（p < 0.05）（图2），表明温度对于所获得的不同AME中蛋白质的保存具.......

讨论

本研究分析了角膜上皮基质提取物（AME）中存在lumican的情况，并探讨了其在不同储存条件下与稳定性的直接相关性。有趣的是，当对AME中的总蛋白浓度进行定量时，发现储存后蛋白浓度有所增加。有证据表明，冷冻储存过程中可能通过三种机制改变蛋白浓度：冷变性、溶质的冷冻浓缩以及冰诱导的蛋白质结构部分展开¹⁹。冷冻过程可能由于样品中液相的结晶而影响储存样本的蛋白浓度。结果提示，这可能是由于冷冻浓缩过程所致，并受到冰箱中储存时间的影响。在较长储存时间（32天和20天）以及较低温度（4 °C和-20 °C）下，观察到更高的蛋白浓度。然而，蛋白浓度最高的时段并未表现出lumican的最高浓度；这表明lumican可能受到冷冻温度和储存时间条件的影响。

根据实验结果，Lumican 在 4 °C 和 -20 °C 条件下储存 12 天时浓度更高且更稳定。然而，在储存 6 天时 Lumican 的浓度低于 12 天时的浓度。有研究报道，蛋白质浓度在冷冻储存后可能发生改变²⁰。该结果可能由一种称为冰诱导蛋白.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 N H2SO4 终止液	R&D Systems	DY994
100 μL 微量移液器	Eppendorf
1000 μL 微量移液器	Eppendorf
15 mm 培养皿	Symlaboratorios
18 G 针头（1.2 mm × 40 mm）	BD Becton Dickinson	305211
2 mL 微量离心管	Eppendorf	Z606340
20 mL 塑料注射器	BD Becton Dickinson	302562
20 μL 微量移液器	Eppendorf
20–200 μL 微量移液器	Eppendorf
5 mL 微量离心管	Eppendorf	30119401
96 孔微孔板	SARSTEDT	821581
铝箔	N/A	N/A
羊膜	Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana Amnion Bank		100 mg
平衡盐溶液	Bausch + Lomb	BSS-403802
烧杯	N/A	N/A
BioRender	BioRender		图示设计
Compact Rocker 振荡器	BioRad	970822DD	型号 5202SD-BIO
完全型、无 EDTA 蛋白酶抑制剂 混合片剂	Roche	11 873 580 001	蛋白酶抑制剂
Daiggner 涡旋振荡器 Genie 2	A.Daigger & Co. , INC	22220A
Dispase II	Gibco	17105-041
ELISA 板分光光度计	Thermo Labsystems	35401106	Multiscan
冷冻机
GraphPad Prism	GraphPad Software, Inc	版本 9	统计分析与绘图软件
人源 Lumican DuoSet ELISA 试剂盒	R&D Systems	DY2846-05	包含人源 Lumican 捕获抗体
培养箱	Forma Scientific	3326 S/N 36481-7002
倒置光学显微镜	Olympus	6A13921	用于确认去上皮化效果  型号 CK2
层流罩	Forma Scientific	14753-567	型号 1184
液氮	N/A	N/A
研钵	N/A	N/A
多通道移液器	Eppendorf
氮气罐	Thermo Scientific		型号 Biocan 20
纸巾	N/A	N/A
磷酸盐缓冲液	R&D Systems	DY006
Pierce 改良 Lowry 蛋白质测定试剂盒	Thermo Scientific	23240
板封膜	R&D Systems	DY992
试剂稀释液	R&D Systems	DY995	含 1% BSA 的 PBS，pH 7.2–7.4，经 0.2 μm 滤膜过滤
冷冻离心机	centurion scientific Ltd	15877	型号 K2015R
橡胶刮铲细胞刮刀	NEST	710001	用于机械去上皮化
手术刀片	Braun	BB521	10 号或 21 号
链霉亲和素-HRP 40 倍浓缩液	R&D Systems	货号 893975
底物四甲基联苯胺（TMB）溶液	R&D Systems	DY999
有齿镊子	Invent Germany	6b	不锈钢
超纯水	PISA
洗涤缓冲液	R&D Systems	WA126	含 0.05% Tween 20 的 PBS，pH 7.2–7.4