本研究描述了一种通过全身暴露于吸入室中吸入二氧化硅来建立矽肺大鼠模型的技术。该矽肺大鼠模型能够以简便、经济且重复性好的方式， closely 模拟人类矽肺病的病理过程。
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摘要
摘要
矽肺病的主要病因是职业环境中吸入二氧化硅。尽管存在一些解剖学和生理学上的差异，啮齿类动物模型仍然是研究人类矽肺病的重要工具。对于矽肺病而言，经典的病理过程必须能够被诱导产生 通过 吸入新生成的石英颗粒，即特异性诱导人类职业性疾病的致病过程。本研究描述了一种建立并有效模拟矽肺病病理动态演变过程的技术。此外，该技术具有良好的可重复性，且无需手术操作。研究构建、验证并应用了一套吸入暴露系统，用于可吸入颗粒物吸入毒理学研究。其关键组成部分如下：（1）散装干燥 SiO₂2 粉末发生器通过气流控制器调节；（2）0.3 m3 可容纳最多3只动物的全身吸入暴露舱 成年大鼠；（3）用于实时调节氧气浓度、温度、湿度和压力的监测与控制系统；以及（4）用于保护实验室技术人员和环境的屏障与废物处理系统。综上所述，本方案报告了吸入暴露 通过 整个身体，吸入室建立了一种可靠、合理且可重复的大鼠矽肺模型，具有低死亡率、较少损伤和更强保护性的特点。
引言
矽肺病是由吸入二氧化硅引起的，在中国是最严重的职业病，每年占职业病报告总数的80%以上1。矽肺病的病因明确，可以预防和控制，但目前尚无有效的治疗方法2。许多药物在基础研究中已被证明有效，但在临床上疗效不确切3,4。因此，矽肺病的病理生理机制仍需进一步探索。
许多研究采用一次性将二氧化硅注入大鼠或小鼠气管的方法，以探讨矽肺病的发病机制5,6。尽管这些啮齿类动物矽肺模型可在较短时间内建立7，但这些方法仍存在动物创伤和高死亡率等挑战。一些研究通过向肺部灌注储存的二氧化硅以诱导非特异性肺部反应，但并未提及小鼠中出现矽肺结节8。此外，与急性矽肺病不同，在职业环境中长期接触二氧化硅会引发显著较轻的肺部炎症，并在肺组织中升高抗凋亡标志物水平，而非促凋亡标志物水平9。因此，亟需建立一种可靠、合理且可重复的动物模型，以进一步探索矽肺病的发病机制。
本研究描述了一种通过吸入二氧化硅模拟矽肺病患者疾病进程的方法 通过 整个身体，通过吸入室输送的气溶胶颗粒，该吸入室包括一个气溶胶二氧化硅发生器、一个全身暴露舱和一个废气处理系统。该方法操作简便，能够有效模拟矽肺病的病理动态演变过程。此外，利用该方法已鉴定出许多可能的发病机制及矽肺病的致病机理。10,11,12该方案有望为矽肺病相关研究领域的进一步探索提供帮助。
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方案
所有动物实验均依据美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》进行，并获华北理工大学伦理委员会批准（批准号：LX2019033，批准日期：2019-3-3）。本研究使用3周龄雄性Wistar大鼠。所有大鼠均饲养于铺有刨花的静态笼具中。动物维持12小时光照/12小时黑暗的昼夜节律，并提供食物和水。 随意采食后续实验在适应性喂养一周后进行。
1. 动物准备
- 抵达后，将所有大鼠饲养于无特定病原体（SPF）房间内。
- 将健康大鼠随机分为两组（n = 10）：吸入纯净空气的对照组大鼠和吸入二氧化硅的矽肺模型大鼠。
2. 二氧化硅制备
**注意：** 人体吸入二氧化硅粉尘会损伤肺部。因此，操作过程中必须穿着实验服、佩戴医用手套和防护口罩（N95）。
- 将二氧化硅颗粒接地（参见 材料列表) 每次暴露前，使用玛瑙研钵研磨1.5小时。这是因为新破碎的石英比陈化石英能产生更大量的活性氧物种。13以及直径为1-5微米的二氧化硅 µm 是最具致病性的。
- 研磨后，使用电子天平称取硅胶（30 g），置于玻璃容器中，于 180°C 烘烤。 °在电热鼓风干燥机中于 C 下处理 6 小时（参见 材料列表) 以消除二氧化硅颗粒表面的病原体。
3. 对大鼠进行二氧化硅暴露
- 连接注射系统与市售的生成器系统（参见 材料列表) 将硅胶（30 g）置于发生器内。检查连接管路是否正常、电源线是否已连接以及供电是否正常。
- 检查废气处理装置的喷淋塔及加湿器水位（参见 材料列表) 手动操作，若液量不足（未达标准线）则加水补充。
- 向废气处理装置的喷雾塔中加入自来水，并向加湿器中加入蒸馏水。图 1).
- 开启废气排放装置（参见 材料列表) 并检查气源开关，以确认屏蔽柜内部是否处于负压状态。
- 确认吸入舱下方的液体混合阀、粉末混合阀、纯气流控制阀及废水排放阀均已关闭。
- 将总计10只大鼠置于吸入室中（参见 材料列表)，并关闭吸入室与屏蔽柜门。
- 在仪器面板或计算机上设置以下实验参数：腔室压力：-50 至 -30 Pa；氧气浓度：21%；腔室温度：26-30°C °C；湿度：30%-70%；粉尘进入速率：2.0-2.5 mL/min；机柜粉尘浓度：60 ± 5 毫克/米3.
注意：实验过程中需持续观察实验数据与设备状态。设备故障警报提示应及时处理。- 每日将每只动物连续暴露于二氧化硅环境中3小时，每周5天，并允许对照组动物吸入纯净空气。
- 实验完成后，关闭混合气体流量控制阀，并开启纯气体流量阀。将纯气体持续注入吸入暴露舱。
注意：在本研究中，纯气体流（7.0-7.5 m3以每小时/升的流速持续注入至少20分钟，直至吸入舱内的有毒气体被完全置换。- 关闭纯净气流阀门，打开舱门，取出大鼠并将其送回无病原体房间。
- 依次取下大鼠笼架与支管组件，将其置于水槽中进行清洗。冲洗完毕后，关闭自动清洗阀并打开舱门。
- 用清洁布擦拭内壁，或开启纯气体干燥罐体。最后进行消毒。使用75%乙醇清洁消毒后，关闭排气闸门，并尽快微开吸入舱门使水分蒸发，以保持吸入舱内部干燥。
- 使用综合大气采样器，按照制造商说明检测柜内二氧化硅浓度。'请按照说明书操作（参见 材料列表) 每周两次，以确保实验过程中二氧化硅浓度的稳定性。采样前需对大气采样器进行校准。
- 使用数字单盘分析天平进行重量法测定。计算得出的二氧化硅浓度为65 mg/m³。3 (图 1 以及 表 1).
注意：在吸收二氧化硅前后分别称量滤纸重量。二氧化硅浓度采用以下公式计算：12:
其中 W2 = 采样后滤纸重量，W1 = 采样前滤纸重量，V = 空气体积。
- 使用数字单盘分析天平进行重量法测定。计算得出的二氧化硅浓度为65 mg/m³。3 (图 1 以及 表 1).
4. 肺组织获取与固定
- 通过腹腔注射戊巴比妥（100 mg/kg 体重）和利多卡因（4 毫克/千克体重）。通过心跳停止评估死亡14.
- 实验结束时，用4%多聚甲醛固定右下肺、肾脏、肝脏、脾脏及骨骼至少24小时，石蜡包埋，并切成5微米切片。 µm 切片7,15.
5. 苏木精和伊红 (H&E) 染色
- 将石蜡切片置于二甲苯中进行脱蜡处理（参见 材料列表) 每次 10 分钟，重复两次16并依次在100%乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇及蒸馏水中各水化3分钟。
- 使用苏木精对切片进行染色（参见 材料列表) 5 分钟，随后用水冲洗切片10.
- 将切片置于2%盐酸酒精中，随后转移至蒸馏水中，直至颜色转变为蓝色。
- 切片用伊红染色1分钟，95%乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，于光学显微镜下观察。12.
6. 免疫组织化学染色
- 常规用水清洗石蜡切片。
- 在高压（60 kPa）和高温（100°C）条件下暴露抗原。 °C) 80 秒，随后使用 3% 内源性过氧化物酶阻断剂封闭 15 分钟，以消除内源性过氧化物酶。7.
- 将样品与抗 CD68 抗体（1:200 稀释度——添加 4 µCD68 的 L 至 396 µ抗体稀释液 L；参见 材料列表) 于 4°C °4°C 过夜。
- 将样品与二抗（HRP标记的山羊抗小鼠IgG聚合物；参见 材料列表) 于 37 °在 30 分钟内完成 C 步骤，然后用 1x PBS 清洗样品。
- 使用3,3-二氨基联苯胺（DAB；参见 材料列表）。将DAB应用于组织后，在光学显微镜下观察组织的染色情况。10.
注：染色时间根据组织染色情况从数秒至数分钟不等。将切片置于水中即可终止染色程序。本研究中，组织的棕褐色染色代表 CD68 的阳性表达。所有抗体均使用 1x PBS 稀释。
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结果
采用所提出的方法，在大鼠中探索了矽肺的一些潜在机制与发病机理。吸入舱示意图如下所示 图 1该暴露舱由一个空气输送二氧化硅发生器、一个全身暴露舱和一个废物处理系统组成，具体配置如前所述。17肺功能、血清与肺部炎症因子水平、胶原沉积及肌成纤维细胞分化情况已在既往研究中报告。10,18,19.miRNA、lncRNA和mRNA的差异表达已在我们的前期报告中报道20,21,22在上述多批次研究中，未有大鼠在二氧化硅暴露后死亡。
矽肺大鼠的经典病理学特征此前已有总结。23
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讨论
作为矽肺病的主要致病原因，二氧化硅在致病过程中起着决定性作用。尘肺病患者吸入的二氧化硅颗粒是由机械切割产生的新鲜游离二氧化硅颗粒。二氧化硅可在新断裂的颗粒表面直接产生活性氧物种，或通过影响巨噬细胞间接产生活性氧物种25。因此，二氧化硅颗粒的研磨至关重要。在本方案中，使用玛瑙研钵对二氧化硅研磨超过90分钟，以使其颗粒更细、形态更不规则，并增加其表面积。据文献报道，空气中结晶型二氧化硅26的浓度不得低于0.05 mg/m3。然而，本方案可能存在粉尘浓度不准确的问题；粉尘浓度的不确定性主要源于缺乏内置的粉尘浓度监测系统。实际二氧化硅浓度是通过进入粉尘柜的SiO2质量和气体流速计算得出的。SiO2的体积是基于旋转盘的速度估算的，而非实际进入柜内的SiO2质量。因此，可能的解决方案包括每周两次检查暴露室内二氧化硅的体积，以确保每次实验大鼠暴露于相同体积的二氧化硅，或在粉尘室中安装浓度测量装置，后者是最佳解决方案。
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作由国家自然科学基金（82003406）、河北省自然科学基金（H2022209073）和河北省教育厅科技项目（ZD2022127）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 空气检测器（压缩式大气采样器） | 青岛旭宇环保科技有限公司 | ||
| 解剖台 | 不推荐特定品牌。 | ||
| CD68 抗体 | Abcam | ab201340 | |
| DAB | 中杉金桥生物技术有限公司 | ZLI-9018 | |
| 电热鼓风干燥器 | 上海一恒科学仪器有限公司 | ||
| 电子天平 | OHRUS | ||
| 包埋机 | leica | ||
| 废气排放装置 | HOPE 工贸有限公司 | ||
| 发生器系统 | HOPE 工贸有限公司 | ||
| 手套（薄型实验室手套） | The secco medical | ||
| 苏木精和伊红 | 巴索诊断股份有限公司 | BA4025 | |
| HOPE MED 8050 暴露控制装置 | HOPE 工贸有限公司 | ||
| 吸入室 | HOPE 工贸有限公司 | ||
| 注射器 | 不推荐特定品牌。 | ||
| 光学显微镜 | olympus | ||
| 载玻片 | shitai | ||
| PV-6000（HRP 标记的羊抗小鼠 IgG 聚合物） | 北京中杉金桥生物技术有限公司 | s5631 | |
| 二氧化硅 | Sigma-Aldrich | ||
| 切片机 | leica | RM2255 | |
| 废气处理装置 | HOPE 工贸有限公司 | ||
| 湿盒 | 合作塑料制品厂 | ||
| 二甲苯 | 天津永大化学试剂有限公司 |
参考文献
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