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方法文章

收集苜蓿根系分泌物以研究邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯对代谢物产生的影响

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DOI：

10.3791/64470

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2023年6月2日

 ,  ,  , 
1Key Laboratory of Soil Environment and Pollution Remediation, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, 2College of Resources and Environment, University of Chinese Academy of Sciences

本文内容

摘要

根系分泌物的释放通常是植物在胁迫条件下的一种外部解毒策略。本方案描述了如何评估异源物质对苜蓿的影响 通过 非靶向代谢组学分析

摘要

根系分泌物是植物根系与周围环境之间信息交流和能量传递的主要媒介。在胁迫条件下，植物根系分泌物分泌的变化通常是一种外部解毒策略。本实验方案旨在介绍收集苜蓿根系分泌物的一般性操作指南，以研究邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯（DEHP）对代谢物产生的影响。首先，在水培实验中使苜蓿幼苗处于DEHP胁迫条件下培养。随后，将植株转移至含有50 mL灭菌超纯水的离心管中，静置6 h以收集根系分泌物。收集的溶液随后在真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥。将冻干样品用双(三甲基硅基)三氟乙酰胺（BSTFA）试剂进行提取和衍生化处理。接着，采用气相色谱-飞行时间质谱联用仪（GC-TOF-MS）对衍生化后的提取物进行检测。所获得的代谢物数据将基于生物信息学方法进行分析。应深入探究差异性代谢物及显著变化的代谢通路，从根系分泌物的角度揭示DEHP对苜蓿的影响。

引言

邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯（DEHP）是一种合成化学物质，广泛用作塑料和聚合物中的增塑剂，以提高其可塑性和强度。近年来，越来越多的研究表明，DEHP是一种内分泌干扰物，对人类及其他动物的呼吸系统、神经系统和生殖系统具有不良影响1,2,3鉴于其对健康的潜在风险，美国环境保护局、欧盟以及中国环境监测中心均已将邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯（DEHP）列入优先控制污染物名录。由于地膜覆盖、有机肥施用、污水灌溉以及污泥农用等因素，土壤已成为环境中DEHP的重要汇。4正如预期，邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯（DEHP）已在农田土壤中普遍检出，其含量在中国某些地区甚至高达每千克干土数毫克。5,6DEHP 可主要通过以下途径进入植物 通过 根部并在此类土壤生态系统的不同营养级中发生生物放大作用7因此，近年来人们对邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯（DEHP）诱导的植物胁迫问题产生了广泛关注。

植物通常对邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯（DEHP）暴露较为敏感。已观察到DEHP胁迫对种子萌发和正常代谢产生不利影响，从而抑制植物的生长与发育8,9。例如，DEHP可诱导叶肉细胞的氧化损伤，降低叶绿素和渗透调节物质的含量，并提高抗氧化酶的活性，最终导致食用植物产量和品质的下降10,11。然而，以往关于植物对DEHP胁迫响应的研究大多集中于氧化应激以及生理生化特性方面，而与植物代谢相关的机制研究相对较少。根系分泌物是一个泛指术语，用于描述植物根系向环境中分泌并释放的各类化合物。它们被认为是植物与根际土壤之间相互作用的媒介，在支持植物生长与发育过程中发挥重要作用12。众所周知，根系分泌物约占全部光合固定碳的30%–40%13。在污染环境中，根系分泌物通过代谢转化或外部排斥等方式参与增强植物对污染物胁迫的耐受性14。因此，深入理解植物根系分泌物对污染胁迫的响应，有助于揭示与细胞生物化学及生物学现象相关的内在机制15。

代谢组学技术为同时检测细胞16,17、组织18乃至生物体渗出物19中的大量小分子代谢物（包括糖类、有机酸、氨基酸和脂质等）提供了一种高效策略。与传统或经典的化学分析方法相比，代谢组学方法显著增加了可检测的代谢物数量20，有助于以更高通量的方式鉴定代谢物并识别关键代谢通路。代谢组学已广泛应用于生物体在胁迫环境（如重金属21、新兴污染物22和纳米颗粒19）下生物学响应的研究领域。目前有关植物的大多数研究集中于植物内部组织的代谢变化，而关于根系分泌物对环境胁迫响应的研究报道较少。因此，本研究旨在介绍紫花苜蓿根系分泌物收集的一般性操作指南，以研究邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯（DEHP）对代谢物生成的影响。研究结果将为后续DEHP作用下植物代谢组学研究提供方法学指导。

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方案

本实验方案的目的是提供一个从水培实验到代谢组学分析的通用流程，用于量化邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯（DEHP）对紫花苜蓿根系分泌物的影响。

1. 水培实验

注意：本实验方案以苜蓿水培实验为例，旨在获得在不同浓度邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）胁迫下的苜蓿（Medicago sativa）幼苗。共设置三个处理组：对照组不添加任何物质，另两个处理组分别在营养液中添加1 mg kg-1和10 mg kg-1的DEHP。DEHP的浓度设置依据土壤中DEHP的实际含量23。每个处理设六个重复。

  1. 用0.1%次氯酸钠对苜蓿种子灭菌10分钟，再用75%乙醇灭菌30分钟。
    1. 用蒸馏水将灭菌后的种子冲洗数次，然后置于无菌培养皿中的湿润滤纸上，在30 °C黑暗条件下萌发。
  2. 将20粒大小均匀、已萌发且饱满的种子转移至装有营养液的培养瓶中的移植篮内，营养液成分为（单位为 µM）：Ca(NO3)2，3,500；NH4H2PO4，1,000；KNO3，6,000；MgSO4，2,000；Na2Fe-乙二胺四乙酸（EDTA），75；H3BO3，46；MnSO4，9.1；ZnSO4，0.8；CuSO4，0.3；(NH4)6Mo7O24，0.02。用0.1 M KOH调节溶液pH至7.0。每周更换全部营养液。
  3. 将所有培养瓶置于可控生长室中，光照强度为150–180 µmol m-2 s-1，光周期为每日16小时光照，温度设置为白天27 °C（16小时）、夜间20 °C（8小时）。
  4. 两周后，将15株生长一致的苜蓿幼苗转移至新的玻璃瓶中，进行1 mg kg-1和10 mg kg-1 DEHP胁迫下的培养实验。用铝箔和封口膜包裹玻璃瓶，以防止DEHP发生光解和挥发。对照组培养瓶也需以相同方式用铝箔和封口膜包裹，以保持条件一致。每日补充营养液以维持液面高度。
  5. 每隔2天随机更换培养瓶位置并旋转，以确保苜蓿幼苗生长条件一致。
  6. 培养7天后，将苜蓿幼苗从培养瓶中取出，用超纯水反复冲洗数次，准备收集根系分泌物。

2. 根系分泌物的收集、提取与代谢组学分析

注意：本实验方案分为三个部分：收集实验、提取实验以及根系分泌物的代谢组学分析。收集实验的目的是将植物样品中分泌的代谢物转移至溶液体系中，以便进行后续提取。

  1. 收集实验
    1. 将10株大小一致的苜蓿幼苗转移至装有50 mL灭菌去离子水的离心管中。将根部浸入水中，收集根系分泌物6小时；保持离心管直立。每种处理至少进行六次重复。
    2. 用铝箔包裹离心管，以避免根部暴露于光照下。
    3. 取出植株，将收集的液体冷冻干燥，用于代谢物谱分析。
  2. 提取实验
    1. 向离心管中加入1.8 mL提取液（甲醇:H2O = 3:1, V/V），涡旋振荡30秒。
    2. 将离心管置于冰水浴中，超声处理10分钟。
    3. 在4 °C、11,000 × g 条件下离心15分钟。
    4. 小心吸取200 µL上清液转移至1.5 mL微量离心管中。从每个样品中取45 µL上清液，混合至质量控制（QC）样品中，最终体积为270 µL，用于校准样品的代谢组数据。
    5. 在真空浓缩仪中将提取物冷冻干燥。随后加入5 µL内标物（核糖醇）继续干燥。
    6. 在真空浓缩仪中蒸发后，向各管中加入30 µL甲氧基胺盐酸盐（溶于吡啶，浓度为20 mg mL-1），80 °C孵育30分钟。然后向样品中加入40 µL双(三甲基硅基)三氟乙酰胺（BSTFA）试剂（含1%三甲基氯硅烷[TMC]，V/V），70 °C放置1.5小时进行衍生化。
    7. 将样品冷却至室温，向QC样品中加入5 µL脂肪酸甲酯（FAMEs）（溶于氯仿）。
  3. 代谢组分析
    1. 取1.0 µL衍生化后的提取物，采用不分流模式注入气相色谱-飞行时间质谱联用系统（GC-TOF-MS），进行代谢物谱分析。
      1. 使用毛细管柱（30 m × 250 µm × 0.25 µm）分离根系分泌物，以氦气为载气，流速为1.0 mL min-1。进样口温度设为280 °C，传输线温度和离子源温度分别维持在280 °C和250 °C。
      2. 分离程序如下：50 °C恒温1分钟，以10 °C/min-1的升温速率升至310 °C，最后在310 °C恒温8分钟。
      3. 采用电子轰击电离模式，能量为-70 eV。以全扫描模式采集质谱数据，扫描范围为50–500 m/z，扫描速率为12.5谱图/秒。
    2. 对单个峰进行过滤以去除噪声。基于四分位距对偏差值进行筛选。
    3. 用最小值的一半填补缺失值，对数据进行标准化和归一化处理。
    4. 将最终的.csv格式数据导入统计分析软件，进行多变量分析。
    5. 在KEGG数据库（京都基因与基因组百科全书，用于理解生物系统高级功能和用途的数据库资源）中查询代谢物，并将代谢物分类为碳水化合物、酸类、脂类、醇类和胺类等不同类别。使用统计分析软件绘制饼图，表示各类代谢物在全部根系分泌物中所占比例。
    6. 采用有监督的正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）展示各组之间的差异。
    7. 根据投影变量重要性（VIP）> 1且p < 0.05（Student's t 检验）筛选显著变化的代谢物作为差异代谢物。
    8. 利用代谢组数据，使用统计分析软件绘制热图，并根据不同处理下的倍数变化绘制柱状图。
    9. 在KEGG数据库和PubChem中查询差异代谢物，整理包含这些差异代谢物的代谢通路，并进行通路富集分析或拓扑结构分析。

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结果

在本实验中，按照上述方法收集、提取和分析苜蓿根系分泌物（图1）。共设置三个处理组：对照组、低浓度DEHP处理组（1 mg L−1）和高浓度DEHP处理组（10 mg L−1）。

在对照组的色谱图中共检测到778个峰，其中根据质谱信息可鉴定出314种代谢物。如图2所示，这些代谢物可根据相对丰度分为六类：碳水化合物（28.6%）、酸类（15.58%）、脂类（13.87%）、醇类（3.91%）、胺类（0.92%）及其他物质（37.12%）。相对丰度低于0.5%的代谢物被归为其他物质（图2A）。酸类进一步细分为脂肪酸（56.09%）、氨基酸（26.62%）、有机酸（13.95%）和酚酸（3.34%）（图2B）。此外，在苜蓿根系分泌物中还检测到大多数植物根系分泌物中常见的部分物质，包括嘧啶、羟基吡啶、黄酮类、酚类...

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讨论

本方案提供了在邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）胁迫下收集和测定苜蓿根系分泌物以及分析代谢组数据的一般性指导。本方案中某些关键步骤需要特别注意。在水培实验中，将苜蓿幼苗置于装有含不同浓度DEHP营养液的玻璃瓶中进行水培。在整个培养期间，应使用铝箔包裹玻璃瓶以避光，防止DEHP发生光解，并确保所有培养液中DEHP浓度的一致性25,26。DEHP浓度设置为1 mg L-1和10 mg L-1，依据的是通常在DEHP污染土壤中检测到的浓度水平27,28。在收集根系分泌物过程中，离心管仍需用铝箔包裹，以避免根系暴露于光照。本研究中收集时间为6小时。若收集时间过短，某些低丰度根系分泌物的浓度可能过低而无法被检测，导致根系分泌物的组成不能真实反映苜蓿幼苗在DEHP胁迫下的实际响应；若收集时间过长，所收集的根系分泌物可能在培养体系中被微生物部分降解，甚至可能检测到微生...

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披露

作者声明，他们不存在任何已知的可能被认为会影响本文报道工作的竞争性经济利益或个人关系。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（41877139）、国家自然科学基金重大项目（41991335）、中国国家重点研发计划（2016YFD0800204）、江苏省自然科学基金（编号 BK20161616）、"135"规划以及中国科学院前沿科学重点研究计划（ISSASIP1615）的共同资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
阿东醇SIGMA≥99%
苜蓿种子江苏省农业科学院（中国南京）
分析天平SartoriusBSA124S-CW
BSTFAREGIS Technologies含1% TMCS（v/v）
离心机Thermo Fisher ScientificHeraeus Fresco17
色谱柱AgilentDB-5MS（30 m × 250 μm × 0.25 μm）
邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯Dr. Ehrenstorfer
脂肪酸甲酯混合物（FAMEs）Dr. Ehrenstorfer
气相色谱仪（GC）Agilent7890A
研磨仪上海净信科技股份有限公司JXFSTPRP-24
质谱仪（MS）LECOPEGASUS HT
甲醇CNW TechnologiesHPLC
甲氧胺盐酸盐TCIAR
微量离心管EppendorfEppendorf Quality1.5 mL
烘箱上海一恒科学仪器有限公司DHG-9023A
吡啶AdamasHPLC
R 软件统计分析软件（通路富集、拓扑分析）
SIMCA16.0.2 统计分析软件（OPLS-DA 等）
超低温冰箱Thermo Fisher ScientificForma 900 系列
超声仪深圳方高微电子有限公司YM-080S
真空干燥器太仓华美生化仪器厂LNG-T98

参考文献

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