基于靶向质谱的低丰度蛋白质蛋白分析中的微量采样

摘要

提出了一种方案，用于从干燥的血清样品中测定低丰度生物标志物，例如生物标志物前胃泌素释放肽（ProGRP）。抗体包被的磁珠用于蛋白型ProGRP肽的选择性纯化和富集。随后通过液相色谱-串联质谱分析捕获的肽。

摘要

本文提出了一个方案，详细描述了从干燥样品中高效纯化低丰度蛋白质的样品。这是在蛋白型肽亲和捕获和液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）测定之前使用基于珠子的蛋白水解进行的。该程序既可以应用于使用纸卡的常规干燥样品（例如，干血斑[DBS]和干血清斑[DSS]），也可以应用于使用较新的采样方法（如体积吸收微采样（VAMS））收集的样品。除了描述该过程外，在这项工作中还逐步介绍了胰蛋白酶磁珠和抗体包被磁珠的制备。所提出的程序的优点是使用磁珠进行省时有效的蛋白水解和使用肽亲和捕获的选择性稳健纯化。目前的程序描述了在干燥血清（DSS和VAMS）中测定低丰度小细胞肺癌（SCLC）生物标志物，前胃泌素释放肽（ProGRP）。微球制备的详细程序使在新应用或其他实验室中实施工作流程变得更加容易。结果表明，结果可能取决于采样材料;在本项目中，与DSS相比，使用VAMS收集的样品的信号强度更高。

引言

自 Ivar Bang 在 1913 年描述 DBS 的葡萄糖监测以来，微量采样已经存在了 100 多年¹.在Guthrie和Susi于1963年引入DBSs用于测定新生儿苯丙氨酸²之后，该技术变得越来越普遍。用于蛋白质采样和储存的DBS的第一批报告是在1970年代初3，⁴，十年后的1980^年代，我们发现了第一份用于测定DBSs⁵蛋白质的质谱（MS）报告。尽管很早就被引入，但直到世纪之交之后，DBS和其他微量采样技术中蛋白质的MS测定才变得更加普遍。

在临床环境中，确定疾病诊断和随访中的蛋白质以及治疗监测和兴奋剂目的具有重要意义。通过MS从少量干燥样品中靶向测定蛋白质分析物仍然具有挑战性，通常需要在分析前进行大量的样品制备。

MS对蛋白质的靶向定量测定通常通过应用自下而上的方法进行，在分析之前将蛋白质消化为肽。该过程产生无数肽，这使得对消化的生物样品的直接分析具有挑战性。避免这种情况的一种方法是在消化⁶，^7，8之前或之后在MS分析的前期应用选择性亲和净化步骤。通过这种方式，在分析之前从样品基质中选择性地分离感兴趣的蛋白质（或其蛋白型肽，如果在消化后执行亲和捕获步骤），从而提供较低的检测限⁹。

与传统血液样本相比，使用DBS卡进行微量采样具有一定的优势，包括样本量小，侵入性小和储存稳定性更高。然而，样品基质不同，可能会在分析中引入其他挑战（例如，干燥与液体样品基质以及毛细血管血液与血清或血浆）^10，11。DBS观察到的另一个挑战是所谓的血细胞比容效应，其中血细胞比容会影响进一步处理以进行分析的样品体积，因此在分析中引入了个体间变异性¹²。较新的微量采样装置，如2014年¹³中推出的VAMS，通过收集固定量的血液而不是滴血来解决这个问题。

该协议描述了用于分析干燥微样品中的低丰度生物标志物的设置。洗脱后，消化干燥的样品，随后通过肽亲和捕获分离蛋白型肽。模型分析物是SCLC生物标志物ProGRP。由于无法从全血中可靠地测定ProGRP，因此使用血清作为样品基质。显示了使用VAMS收集的DSS和血清样品的代表性结果。

方案

来自健康献血者的血清用于制备标准溶液。使用来自健康献血者的血清是严格按照挪威法律进行的。获得所有受试者的知情同意。血清样品使用符合相关指南和法规的方法进行分析。所描述的协议是先前工作¹⁴中描述的方法的修改版本。缓冲液和溶液的组成以及如何制备它们的概述可以在 补充表S1中找到，而材料表包含本协议中使用的 材料 ，设备和试剂。

1. 抗体包被磁珠的制备

1. 计算制备所需磁珠数量所需的抗体量。每50毫克磁珠使用1毫克抗体。
   注意:通常，在后续实验中，每个样品使用 20 μL 的 20 mg/mL 磁珠悬浮液（参见步骤 5.1）。
2. 计算制备所需磁珠数量所需的抗体体积。
   注意:抗体体积取决于抗体浓度，需要针对每种抗体进行计算。
3. 将所需体积的抗体溶液转移到 5 mL 低蛋白结合微量离心管中。例如，如果抗体溶液含有 1 mg/mL 抗体，则使用 0.4 mL 制备 1.0 mL 磁珠悬浮液（20 mg 磁珠/mL 含 1 mg 抗体/50 mg 磁珠）。
   注意:抗体应位于无胺缓冲液中。对所有含有蛋白质的溶液使用低蛋白结合微量离心管，以避免分析物因吸附而损失。
4. 在抗体溶液中加入一个小的磁力搅拌棒，并在连续搅拌下将pH调节至2.5。使用带微量电极的pH计测量pH值，并通过逐步添加规定体积的1.0 M HCl来调节pH值（首先添加10 μL份量的1.0 M HCl，并在pH接近2.5时减小体积）。记录将pH调节至2.5所需的1.0 M HCl的总体积。
5. 取出微电极并将酸化抗体在磁力搅拌器的冰上孵育1小时。
   注意:对抗体进行酸处理以促进磁珠上抗体的正确取向。HCl的浓度可以降低到0.5M或0.2M HCl，具体取决于抗体溶液中的缓冲液浓度。
6. 中和抗体溶液。使用带有微电极的pH计测量pH值，并通过逐步加入规定的1.0 M NaOH体积将pH调节至7（从10 μL部分开始，当pH接近7时减小体积）。记录添加的1.0 M NaOH的总体积。
   注意:NaOH的浓度应与步骤1.4中使用的HCl浓度相同。氢氧化钠具有很强的腐蚀性;使用防护设备，包括手套和适当的护目镜。
7. 计算要使用的甲苯磺酰活化磁珠的所需体积。
   注意:通常，建议在进行小规模偶联时使用20 mg磁珠/mL。应至少使用5毫克珠子。
8. 在涡旋混合器上彻底混合磁珠悬浮液，并抽出含有所需磁珠悬浮液量的体积。例如，要制备 1 mL 磁珠悬浮液，请取出含有 20 mg 磁珠的体积（如果磁珠浓度为 30 mg/mL，则为 667 μL）。
9. 将珠悬浮液放在磁性架上1分钟，然后除去上清液。用等体积的 1 型 H₂O 洗涤磁珠 2 倍（如果使用 30 mg/mL 磁珠溶液制备 1 mL 20 mg/mL 抗体包被的磁珠，则为 667 μL）。每次加入洗涤溶液后，使用涡旋混合器混合，并在除去上清液之前放在磁性架上1分钟。
10. 向磁珠中添加以下内容:酸处理抗体、0.5 M 硼酸盐缓冲液 （pH 9.5）（总体积的 1/5，因为最终浓度应为 0.1 M;这等于 0.2 mL 以制备 1 mL 磁珠悬浮液）和用于抗体偶联的偶联缓冲液（要制备 1 mL 抗体包被的磁珠，偶联缓冲液的体积应等于 1 mL -酸处理抗体体积 - 0.2 mL 硼酸盐缓冲液）。使用涡旋混合器混合。
    注意:酸处理抗体的体积等于抗体溶液的体积（0.4 mL，使用1 mg / mL抗体溶液制备1 mL磁珠悬浮液）+用于将pH调节至2.5的1.0 M HCl体积+用于将pH调节至7的1.0M NaOH体积）。
    注意:0.5 M硼酸盐缓冲液（pH 9.5）和用于抗体偶联的偶联缓冲液的组成可在 补充表S1中找到。
11. 使用端到端样品混合器在环境温度下旋转过夜，最好是相互旋转和振动。
12. 以239× g离心10分钟。将管放在磁铁上2分钟，然后除去上清液。
13. 使用端到端样品混合器在环境温度下旋转抗体珠的存储缓冲液，洗涤磁珠 2 x 2 小时并洗涤一次过夜。使用与步骤 1.10 中的总卷相同的卷。将管放在磁铁上1分钟，并在每次洗涤之间除去上清液。
    注意:抗体微球储存缓冲液的组成可在 补充表S1中找到。
14. 使用所需磁珠储备浓度（通常为20 mg/mL）储存在所需缓冲液中（例如，与步骤1.13中相同的缓冲液）。存放在冰箱中。

2.制备2 mL胰蛋白酶固定化珠（20 mg / mL磁珠）

1. 将 20 mL 的 1 mM HCl 加入 2 mL NHS 活化的琼脂糖珠中以洗涤磁珠。
2. 混合并以2，655 × g 离心5分钟。除去上清液。
3. 加入 20 mL 的 0.1 M 磷酸盐缓冲液 （pH 7.8）。使用涡旋混合器混合并以2，655× g 离心5分钟。除去上清液。
   注意:0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.8）的组成可在 补充表S1中找到。
4. 加入 2 mL 的 20 mg/mL 胰蛋白酶（溶解在冷偶联缓冲液中用于胰蛋白酶偶联）。
   注意:胰蛋白酶偶联的偶联缓冲液组成可在 补充表S1中找到。将缓冲液存放在冰箱中。
5. 使用温控混合器在22°C和1，100rpm下孵育25分钟。以2，655 × g 离心5分钟。除去上清液。
6. 加入2mL修饰缓冲液以制备胰蛋白酶珠，并使用温控混合器在22°C和1，100rpm下孵育20分钟。以2，655 ×g 离心5分钟。除去上清液。
   注意:用于制备胰蛋白酶珠的修饰缓冲液的组成可以在 补充表S1中找到。将缓冲液存放在冰箱中。
7. 加入10mL封闭缓冲液以制备胰蛋白酶珠，并使用温控混合器在22°C和1，100rpm下孵育10分钟。以2，655 × g 离心5分钟。除去上清液。
   注意:用于制备胰蛋白酶珠的封闭缓冲液的组成可以在 补充表S1中找到。将缓冲液存放在冰箱中。
8. 加入 2 mL 储存缓冲液，使用涡旋混合器混合，并存放在冰箱中直至使用。
   注意:胰蛋白酶微球储存缓冲液的组成可在 补充表S1中找到。将缓冲液存放在冰箱中。

3. DSS/VAMS取样及随后提取干燥血清

1. 通过在血清中加入适当水平的ProGRP（或目标蛋白）来制备标准品。将峰值交易量保持在总交易量的 1% ≤。
   注意:此处使用295 μg/mL ProGRP的水溶液储备溶液制备加标血清标准品。
2. 在涡旋混合器上混合标准品。
3. 将 10 μL 血清（加标标准品）涂在 DBS 卡上，或按照制造商的指南通过 VAMS （10 μL） 收集 10 μL 血清。对于 DSS，请确保该点位于虚线圆圈内。
4. 在环境温度下风干至少2小时。
5. 切下整个斑点并将其转移到 2 mL 低蛋白结合微量离心管中，或从支架上取出 VAMS 并将其放入 2 mL 低蛋白结合微量离心管中。
6. 加入 1，000 μL 100 mM 碳酸氢铵 （ABC） 溶液。使用温控混合器在22°C以1，000rpm从斑点/ VAMS中提取干燥的血清1小时。
7. 将提取物转移到新的 1.5 mL 低蛋白结合微量离心管中进行胰蛋白酶水解。

4. 消化DSS/VAMS提取物

1. 每个样品使用 30 μL 胰蛋白酶珠（如第 2 节中制备）。将所有样品的含有胰蛋白酶珠的体积转移到新的 1.5 mL 低蛋白结合微量离心管中，以 2，655 × g 离心 5 分钟，然后除去上清液。
2. 用 1 mL 冷的 50 mM ABC 洗涤胰蛋白酶珠 2 次，然后以移液的相同体积重悬。以2，655× g 离心5分钟，并在步骤之间除去上清液。
3. 向每个 DSS/VAMS 提取物中加入 30 μL 洗涤过的胰蛋白酶珠以启动消化。
4. 使用温控混合器或类似物在37°C和1，000rpm下孵育2小时。以 2，655 × g 离心 5 分钟，并将上清液（非珠子）转移到新的 2.0 mL 低蛋白结合微量离心管中。
5. 在 100 mM ABC 溶液中加入 25 μL 含有稳定同位素标记 （SIL） 肽 ALGNQQPSWDSEDSSNF[^K_13C₆_15 N₂] 的 ¹⁴ng/mL 内标 （IS） 溶液。

5. 使用抗体包被的磁珠捕获蛋白型ProGRP肽

1. 每次提取使用 20 μL 抗体包被的微球（第 1 节中制备的 20 mg/mL）。将所有抗体包被的磁珠转移到新的 1.5 mL 低蛋白结合微量离心管中，放在磁铁上 1 分钟，然后取出储存缓冲液。
2. 用 1 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）、pH 7.4（含有 0.05% 聚山梨酯 20）和 2 x 1 mL PBS 洗涤磁性抗体包被的磁珠，然后重悬于移液的相同体积中。在涡旋混合器上混合，并在缓冲液交换之间放在磁铁上1分钟。
   注意:PBS 含有 137 mM NaCl、2.7 mM KCl、8 mM Na 2 HPO 4和 1.8 mM KH₂PO₄。建议以10倍浓度制备溶液以提高稳定性。有关 100 mL 10x PBS 的组成，请参见补充表 S1。稀释 10x PBS 10x 将达到 ~7.4 的 pH 值。
3. 向每个含有消化的 DSS/VAMS 提取物和 IS 的低蛋白结合微量离心管中加入 20 μL 洗涤磁珠悬浮液。在环境温度下使用端到端样品混合器进行免疫提取1小时。
4. 使用以下溶液洗涤磁珠:500 μL PBS 与 0.05% （v/v） 聚山梨酯 20、400 μL PBS、300 μL 10 mM Tris HCl （pH 7.4） 和 300 μL 100 mM ABC。
   1. 加入每种洗涤溶液后，从磁架上取出带有珠子和洗涤溶液的低蛋白结合微量离心管，并小心地倒置直至均匀。然后，将低蛋白结合微量离心管放在磁铁上30秒，倒置30秒，然后放在磁铁上1分钟。取出洗涤液。
   2. 使用微量离心机旋转剩余的悬浮液。放在磁铁上1分钟，然后除去剩余的洗涤溶液。
5. 向每个样品中加入 15 μL 1 H 2 O 型₂% （v/v） 甲酸，并使用温控混合器或类似方法在 22 °C 和 1，000 rpm 下孵育 5 分钟，以洗脱捕获的肽。放在磁铁上1分钟，然后将洗脱液转移到新的1.5mL低蛋白结合微量离心管中。重复一次并将第二个洗脱液转移到与第一个洗脱液相同的低蛋白结合微量离心管中。
6. 向每个洗脱液中加入 20 μL 的 100 mM ABC（总体积为 50 μL）。
7. 离心机（微量离心机）并将 40 μL 洗脱液转移到微量插入物中，用于高效液相色谱 （HPLC） 样品瓶。

6. 通过LC-MS/MS进行分析

1. 使用具有电喷雾电离功能的微型液相色谱三重四极杆质谱仪，以实现高稳定性。
2. 用流动相A（H₂O和MeCN中的20 mM FA，95:5 v/v）和B（H₂O和MeCN中的20 mM FA，5:95 v/v）吹扫泵，准备LC-MS/MS系统进行分析。
3. 插入分析柱（C18，50 mm x 1 mm 内径 [ID]，3 μm 颗粒）。
4. 按照特定仪器的启动程序继续准备仪器进行分析。
5. 在仪器软件中，将柱炉温度设置为25°C，流速设置为50 μL/min（100%流动相A）。
6. 用流动相A平衡色谱柱至少15分钟。
7. 将样品放入自动进样器中。
8. 准备用于分析ProGRP特异性胰蛋白酶肽ALGNQQPSWDSEDSSNFK及其IS的仪器方法。
   注意:有几个方法参数是特定于仪器的，必须针对所使用的特定仪器进行优化。此处使用的方法参数的详细信息在步骤 6.9 至 6.11 中描述。
9. 对于LC中的梯度程序，请使用以下设置:流速:50 μL/分钟;从时间0.0到3.0分钟:100%流动相A;从时间3.0到18.0分钟:运行0%至50%流动相B的线性梯度;从时间18.0到18.1分钟:将流动相B从50%增加到100%;从时间18.1到20.0分钟:100%流动相B;从时间20.0到20.1分钟:将流动相B从100%降低到0%;从时间20.1到30分钟:100%流动相A重新平衡色谱柱（使用至少10个色谱柱体积）。
10. 对于 MS/MS 设置，请使用确保高效电离的仪器设置在正模式下运行 MS/MS。要遵循此协议，请使用 +4，000 V 的喷雾电压、270 °C 的加热毛细管温度、氮气作为片状气体（5 个任意单位）和氩气 （2 mTorr） 进行碰撞诱导解离 （CID） 碎裂。如果仪器允许，引导液相色谱流浪费运行的前 2 分钟（0-2 分钟）和后 1 分钟（29-30 分钟），而不是进入 MS。
11. 对（A）特征肽（ALGNQQPSWDSEDSSNFK）:1，005.45→913.3，1，005.45→1，028.3和1，005.45→1，398.5）使用选定的反应监测（SRM）通道，以及（B）IS SIL肽（ALGNQQPSWDSEDSSNF[K_¹³C₆_¹⁵N₂]）:1，009.45→921.3，1，009.45→1，036.3和1，009.45→1，406.5。对所有受监控的转换使用优化的碰撞能量（本协议中为 35 V）。
12. 使用适用于您的LC-MS/MS系统的软件准备包含要运行的样品的序列。将进样体积设置为 10 μL。
    注意:确保根据需要添加空白样品和质量控制样品。
13. 按仪器软件中的"运行序列"开始序列。
14. 监测亲和捕获的ProGRP特异性胰蛋白酶肽ALGNQQPSWDSEDSSNFK及其IS SIL肽的峰面积。
    注意:特征肽ALGNQPSWDSEDSSNFK的选择和确认在别处描述¹⁴。

结果

使用DSS采样和VAMS的分析工作流程概述如图 1所示。除了抽样方法不同外，程序是相同的。使用两种采样方法采样的血清图像如图 2所示。

两种采样形式（VAMS 和 DSS）都适用于含 ProGRP 的血清的采样。从 图3 可以看出，图中显示了DSS和VAMS采样的蛋白型肽和IS SIL肽的MS色谱图。此外，还包括分析由10 μL加标液体血清样品组成的对照样品后的MS色谱图，该样品以与干燥样品相同的方式处理。后者以与DSS / VAMS提取溶液体积相同的体积稀释，使用胰蛋白酶珠进行消化并使用肽亲和捕获进行净化。

比较VAMS和DSS采样（图4），VAMS提供的蛋白型肽/IS面积比高于DSS。这表明用于DSS（纯纤维素）的纸张中可能存在目标蛋白ProGRP的损失。与对照样品相比，血清在进一步处理和分析之前未干燥（图4），结果表明VAMS提供的面积比与对照样品相似（双尾 t检验， p≤0.65），表明对采样材料没有损失，而DSS提供的面积比显着降低（双尾 t检验， p≤ 0.005），表示取样材料的损失。

使用VAMS进行了简短的评估。线性范围为10至1，000 ng/mL（R² = 0.9996），检测限（LOD，信噪比= 3）为6.7 ng/mL。LOD被认为是令人满意的，因为分析是在相当旧的三重四极杆（2008）上进行的，具有1 mm的内径柱。使用IS校正，信噪比>10的所有电平的重复性也被认为是令人满意的，RSD在7%和17%（n = 3）之间。

亲和捕获可以通过捕获目标蛋白质或其蛋白型肽在消化步骤之前和之后进行。当前程序描述了肽亲和捕获。与蛋白质捕获相比，这种方法的一个优点是仅捕获目标肽，并且可以实现更高效的样品净化。 如图5所示，显示了更复杂的全扫描色谱图，与肽捕获后相比，蛋白质捕获后的噪声更大。 图5 中分析的样品未使用DSS采样或VAMS采样;然而，血清也是样品基质，并且在所述过程中使用与肽捕获相同的抗体进行亲和捕获。

图 1:使用 DSS 和 VAMS 采样的分析工作流程概述。 缩写:DSS = 干血清斑点;VAMS = 体积吸收微采样;LC-MS/MS = 液相色谱-串联质谱。 请点击此处查看此图的大图。

图2:使用不同方法采样的血清图像 。 （A）DBS纤维素卡和（B）VAMS。缩写:DBS = 干血斑;VAMS = 体积吸收微采样。 请点击此处查看此图的大图。

图 3:DSS 和 VAMS 采样后蛋白型肽和 IS SIL 肽的代表性 MS 色谱图，以及直接添加到提取溶液中的加标血清样品的代表性 MS 色谱图。MS色谱图显示10 μL血清样品加标1.5 μg/mL ProGRP，并应用于（A）VAMS，（B）纤维素采样卡（用于DSS）或（C）直接应用于提取缓冲液（对照样品）。在肽亲和捕获之前，向所有样品中添加 25 μL 14 ng/mL 的 SIL 肽。缩写:DSS = 干血清斑点;VAMS = 体积吸收微采样;MS = 质谱;ProGRP = 前胃泌素释放肽;IS = 内标;SIL = 稳定同位素标记。请点击此处查看此图的大图。

图 4:加标 ProGRP 并应用于 VAMS、DSS 或直接应用于提取溶液（对照样品）的血清样品的 ALGNQQPSWDSEDSSNFK/IS 面积比的代表性结果。 ProGRP的浓度为1.5μg/ mL，每种条件n = 4;在肽亲和捕获之前，将 25 μL 的 14 ng/mL IS SIL 肽添加到所有样品中。*表示面积比与应用于VAMS的样品显著不同（双尾 t检验， p≤0.005）。误差线±标准偏差。缩写:DSS = 干血清斑点;VAMS = 体积吸收微采样;ProGRP = 前胃泌素释放肽;IS = 内标;SIL = 稳定同位素标记。 请点击此处查看此图的大图。

图5:完整蛋白提取（蓝色）和蛋白型表位肽提取（红色）后的基础峰色谱图（全扫描Orbitrap分析）的比较。 蛋白质型表位肽（ALGNQQPSWDSEDSSNFK，m/z 1005.45）的提取离子色谱图如右图所示。使用加标 150 ng mL⁻¹ ProGRP 的血清作为样品。该图转载自Levernæs等人¹⁴。请点击此处查看此图的大图。

补充表S1:缓冲液和溶液的组成以及如何制备它们的概述。请点击此处下载此文件。

讨论

所描述的协议包含有关如何在分析来自干燥微量样品（DSS和VAMS）的低丰度生物标志物中执行几个重要步骤的信息，包括胰蛋白酶珠和抗体包被的磁珠的制备。根据以往的经验，我们始终在磁珠固定之前用酸处理抗体，以改善抗体的方向¹⁵。

该过程的关键步骤之一是选择最合适的微量采样格式。首先，必须考虑所讨论的分析物是否可以从全血中测定，或者浓度是否受血细胞影响并且必须在血清或血浆中测定（如模型分析物ProGRP）。

基于纸张和聚合物的方法都有优点和局限性;对于ProGRP，VAMS在从取样器中提取后分析物回收率方面具有明显的优势。但是，对于DSS样品，可以使用不同的提取解决方案来优化这一点。然而，分析物和取样材料之间的这种潜在相互作用很重要，因为它可能导致分析变异增加和检测限提高。由于使用的IS是SIL肽，并且在消化后首先添加，因此IS可以校正消化后的步骤（例如，亲和萃取和LC-MS/MS分析）。从DSS / VAMS和消化步骤中提取IS校正是不可能的。

在此过程中使用两种类型的磁珠:胰蛋白酶珠，用于从采样器中提取血清样品后进行消化，以及抗体包被的磁珠，用于在消化后捕获蛋白型肽。使用胰蛋白酶珠的一个主要原因，除了加速消化外，是为了在亲和捕获过程中最大限度地减少样品中残留的胰蛋白酶活性。这对于避免亲和捕获过程中mAb的胰蛋白酶水解非常重要。

琼脂糖珠用于制备胰蛋白酶微球，而磁珠用于制备抗体包被的微球。琼脂糖微球比磁珠便宜，但有一个限制，即从溶液中分离磁珠需要离心。这使得磁珠和上清液的分离效率低于使用磁珠时的效率。此外，使用琼脂糖珠很难实现工作流程的自动化。但是，可以使用磁性 NHS 激活微球，可用于更简化和自动化的样品制备工作流程。

微量采样是药物和生物标志物生物分析的重要趋势。当前方法的一个挑战是样品体积有限（10 μL），这对于测定极低丰度分析物（如ProGRP（pg/mL-低ng/mL水平））可能特别重要。然而，使用最先进的分析设备可以规避这一挑战。对于这些低丰度分析物，样品制备的选择至关重要，最常需要通过基于抗体的亲和捕获进行选择性样品净化。由于肽捕获已被证明比蛋白质捕获（使用相同的抗体）提供更清洁的提取物和更低的检测限¹⁴，因此本文的重点是这种方法与微量采样相结合。肽捕获方法的另一个优点是IS SIL肽还可以校正亲和捕获步骤。

在这项工作中，靶向蛋白质的抗体用于肽捕获。这是一个优势，因为靶向蛋白质的现成抗体的可用性高于靶向蛋白型肽的现成抗体。然而，为了使抗蛋白抗体有效捕获蛋白型肽，表位需要在蛋白质消化后保持完整。此外，对于许多抗体，确切的表位尚不清楚，这使得寻找抗蛋白抗体变得乏味。这限制了适用于肽捕获的可用抗蛋白抗体的数量。使用血清作为基质，ProGRP作为目标分析物来演示所描述的程序。该程序适用于其他基质和其他目标分析物。除了使用市售的抗蛋白抗体来亲和捕获蛋白型肽外，还可以使用定制的抗肽抗体。与蛋白质捕获相比，肽捕获的净化效率如图 5所示。通过将用于制备胰蛋白酶微球的琼脂糖珠与磁珠交换，该程序还应与市场上的机器人样品制备工作站兼容。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙酸 N-羟基琥珀酰亚胺酯	Carbosynt （Staad， Switzerland）	FA33719	储存在 -20 °C 以下的冰箱中;C
ALGNQQPSWDSEDSSNF[K_13C6 _15N2] （≥ 95%）	Innovagen （瑞典隆德）	不适用	存放在低于 -20 °C 的冰箱中;C
碳酸氢铵 BioUltra （≥ 99.5%）	Sigma Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）	09830-500G
Aquasil C18 色谱柱，3 µm，50 mm x 1 mm	Thermo Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）	77503-051030	分析柱与 100% 水性流动相
苯扎脒 （≥ 95.0%）	Sigma Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）	12072	储存在 2-6 °C 的冰箱中;C
氯化钙二水合物 （≥ 99% ）	Sigma Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）	223506-500G
离心机 5804	Eppendorf（汉堡，蒂斯克兰）	5804000010
克隆的 ProGRP 亚型 1	镭医院，奥斯陆大学医院（挪威奥斯陆）	不适用	存放在低于 -20 °C 的冰箱中;C
磷酸氢二钠二水合物（pro analysis）	Sigma Aldrich （美国密苏里州圣路易斯市）	30435-500G
磷酸氢二钠十二水合物 （pro analysis）	默克（达姆施塔特，泰斯克兰）	1.06579.0500
Dynabeads M-280 甲苯磺酰基活化 10 mL	Invitrogen（美国卡尔斯巴德）	14204	储存在 2-6 °C 的冰箱中;C
DynaMag-2	Invitrogen （Carlsbad， USA）	123-21D
乙醇胺 （pro analysis， ≥ 99%）	Sigma Aldrich （St. Louis， MO， USA）#	02400
甲酸 （≥ 99%） 用于 LC-MS	VWR International（美国宾夕法尼亚州拉德诺）	84865.260
FTA DMPK-C 纤维素卡	Whatman（英国肯特）	WB129243	DBS 卡
HPLC 样品瓶，透明玻璃，1.5 mL，32 x 11.6 mm，洁净包装	Nerliens Meszansky （挪威奥斯陆）	LPP 11 09 0519
Hulamixer 样品混合器	Invitrogen （Carlsbad， USA）	101561503016	样品混合器，具有端对端混合、往复旋转和振动
来自健康血液捐献者的人血清	Bloodbank， Ullevål， 奥斯陆大学医院 （挪威奥斯陆）	不适用	存放在低于 -20 °C 的冰箱中;C
盐酸发烟 37%（用于分析）	默克（达姆施塔特，蒂斯克兰）	1.00317.1000
LC-MS/MS 系统：Ultimate 3000 系统（自动进样器，WPS-3000TRS;微型泵，LPG-3400M;流量管理器、FLM-3300、MIC、1X2P-10P）和 TSQ Quantum 访问。由 Xcalibur 2.2 SP1.48 Thermo	Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）控制不	适用
用于 LC-MS 的 LiChrosolv 乙腈超降解	默克（达姆施塔特，蒂斯克兰）	1.00029.2500
LL Biotrode，组合玻璃电极	瑞士万通（Herisau，Sveits）	6.0224.100
磁力搅拌器，M10 型	Franz Morat KG（德国艾森巴赫）	10236
玻璃微型插件（31 x 6 mm，0.1 mL）	VWR International（美国宾夕法尼亚州拉德诺）	548-0006
MilliQ 积分 3 带 Q-POD	Merck Millipore（法国莫尔塞姆）	ZRXQ003T0	用于生产 1 型水
单克隆抗体 M18	镭医院，奥斯陆大学医院（挪威奥斯陆）不	适用	存放在 2-6 °C 的冰箱中;C
Neoteryx Mitra 微量采样器 （10 μL） 4 个采样器 Clamshell	Fisher Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）	NC1382947
NHS 活化的琼脂糖珠 4 个快速流	速 Sigma Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）	GE17-0906-01	琼脂糖珠，以 2-6 °C 储存在冰箱中;C
Optifit， 补充装移液吸头，10 mL	Sartorius Biohit（芬兰赫尔辛基）	613-2911Optifit
，补充装移液吸头，10 个 μL	Sartorius Biohit（芬兰赫尔辛基）	790012
Optifit，补充装移液器吸头，1,000 个 μL	Sartorius Biohit（芬兰赫尔辛基）	791002
Optifit，补充装移液器吸头，200 个 μL	Sartorius Biohit（芬兰赫尔辛基）	790202
pH 玻璃电极	瑞士万通（Herisau，Sveits）	6.0233.100
pH 计 744	瑞士万通（Herisau，Sveits）	8.744.1003
移液管 10 mL	Sartorius Biohit（芬兰赫尔辛基）	725090
移液管 m10 和微量;L	Sartorius Biohit（芬兰赫尔辛基）	725020
Pipet m100 µL	Sartorius Biohit （芬兰赫尔辛基）	725050
移液管 m1,000 & micro;L	Sartorius Biohit （芬兰赫尔辛基）	725070
移液管 m20 & micro;L	Sartorius Biohit（芬兰赫尔辛基）	725030
氯化钾（KCl ≥ 99.9%）	Sigma Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）	P-3911
磷酸二氢钾（专业分析）	默克（达姆施塔特，蒂斯克兰）	1.04873.0250
蛋白质 LoBind Eppendorf 管 0.5 mL	Eppendorf（汉堡，Tyskland）	525-0133 （0030 108.094）
蛋白质 LoBind Eppendorf 管 1.5 mL	Eppendorf （Hamburg， Tyskland）	525-0132 （0030 108.116）
Protein LoBind Eppendorf tube 2.0 mL	Eppendorf （Hamburg， Tyskland）	525-0134 （0030 108.450）
蛋白质 LoBind Eppendorf 管 5.0 mL	Eppendorf （Hamburg， Tyskland）	525-0792 （0030108.302）
Scissors	Sigma Aldrich （St. Louis， MO， USA）	Z186716-1EA
叠氮化钠 （BioUltra; ≥ 99.5% ）	Sigma Aldrich （美国密苏里州圣路易斯）	71289-5G
氯化钠（用于分析）	默克 （Darmstadt， Tyskland）	1.06404.1000
磷酸二氢钠一水合物（专业分析）	默克 （Darmstadt， Tyskland）	1.06346.0500
氢氧化钠 （AnalaR NORMAPUR）	VWR International （美国宾夕法尼亚州拉德诺）	28244.295
十水合四硼酸钠 （≥99. %）	Sigma Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）	S9640-500G
Spectrafuge 微型离心机	LABNET International（美国新泽西州爱迪生）	C1301
搅拌磁铁，25 mm x 6 mm Ø，圆形	Leybold（德国科隆）	666 851
斯图尔特 Scientific SA8 涡旋混合器	Stuart （英国斯塔福德郡）	Z648531-1EA
SuperClear 离心管 （15 mL）	VWR International（美国宾夕法尼亚州拉德诺）	525-0150
SuperClear 离心管 （50 mL）	VWR International（美国宾夕法尼亚州拉德诺）	525-0155
舒适型恒温混合器 1.5 mL	Eppendorf（汉堡，蒂斯克兰）	53,55,27,831	温控混合器
Trizma 碱（试剂级，≥ 99.0 %）	Sigma Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）	T6066	三（羟甲基）氨基聚糖 （tris）
Trizma HCl（试剂级，≥ 99.0%）	Sigma Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）	T3253-100G	Tris（羟甲基）氨基二聚糖盐酸盐（tris HCl）
胰蛋白酶（来自牛胰腺的TCPK处理，10,000-15,000 BAEE单位/mg蛋白质）	Sigma Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）	T8802	储存在-20 °以下的冰箱中;C
吐温 20	Sigma Aldrich （美国密苏里州圣路易斯）	P7949-500ML	聚山梨酯 20
镊子	Sigma Aldrich （美国密苏里州圣路易斯）	TEM-78511-27
小瓶盖，白色，9 mm	Nerliens Meszansky （挪威奥斯陆）	LPP 09 15 0981
采用 VAMS（容量吸附微量采样）技术的 Mitra 微量进样器，10 &微量;L，4 采样器翻盖	式 Neoteryx（美国加利福尼亚州托伦斯）